여기, 우리는 새로운 형광 얼룩 polyacrylamide 젤에서 총 단백질 검출에 대 한 기술 개요는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 활용 Ag+를 감지 하는 실버 이온 전용 형광 턴 온 프로브-단백질 복합물, 전통적인 발은 얼룩의 특정 한계를 제거 하 고.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
실버 얼룩은 널리 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 다음 polyacrylamide 젤에 단백질 밴드를 시각화 하는 데 사용 색도계 기술. 클래식은 얼룩 얼룩, 불 쌍 한 단백질 복구, 낮은 재현성, 정량화, 및 질량 분석 (MS)와 호환성을 제한 된 좁은 선형 동적 범위 높은 백그라운드와 같은 특정 단점이 있다. 지금, TPE-4TA, fluorogenic+ Ag 프로브를 사용 하 여 우리 polyacrylamide 젤에서 총 단백질 시각화 방법 얼룩이 지기 형광 실버를 개발 했다. 이 새로운 얼룩 전통적인 실버 얼룩에 성가신 실버 감소 단계를 피할 수 있습니다. 또한, 형광은 얼룩 좋은 재현성, 감도, 및 선형 부 량 단백질 검출, 유용 하 고 실용적인 단백질 젤 얼룩을 만드는 방법을 보여 줍니다.
서론
많은 얼룩 방법 단백질 젤 전기 이동 법에 따라, 예를 들면 Coomassie 화려한 블루, 실버 얼룩, 형광, 색도계 염료를 사용 하 여 시각화 하는 데 사용 되었거나 방사성 라벨1,2, 3 , 4. 실버 얼룩 간주 됩니다 간단 하 고 저렴 한 시 약을 필요로 하는 단백질 검출에 대 한 가장 중요 한 기술 중 하나. 그것은 두 개의 주요 가족으로 분류 될 수 있다: 실버 질산염 및 암모니아은 얼룩 얼룩5,6. 알칼리 성 암모니아 실버 메서드 실버 diamine 복잡 한 암모니아와 수산화 나트륨 생산 이며 산 성 포 름 알 데히드 솔루션을 사용 하 여 개발 하는 동안 금속은 감소. 얼룩 기본적인 단백질에 대 한 효율적으로 수용 하지만 산 성 및 중성 단백질에 대 한 손상 된 성능을 보여줍니다 그리고, 또한, 클래식 글리신 및 황소자리 전기 이동 시스템. 비교, 실버 질산염 얼룩 악용 단백질은 이온의 높은 바이오 선호도, 주로 sulfhydryl carboxyl ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1입니다. 젤의 준비
참고: 데모 SDS 페이지12직후 얼룩에 대 한 젤을 준비 하는 표준 프로토콜을 따릅니다. 간단히, 다음 단계는 샘플의 준비를 설명 하 고 젤 전기 이동 법.
- 4%-12% 두번째-트리 스 단백질 젤 (1mm, 15 잘) SDS 페이지 수행 2-(N-morpholino)로 가득 미니 젤 탱크를 사용 하 여 ethanesulfonic 산 (MES) 버퍼.
- 희석 증류수, 리튬 라우릴 황산 (LDS) 버퍼, 그리고 샘플을 감소 요원의 혼합물으로 샘플.
- 재고 (10 µ L), 양의 두 배 첫 번째 레인 정상적인 재고 금액 (5 µ L) 및 (13 희석, 8192 x 2 배에서)의 두 가지 희석 후의 일련 로드.
- 30 분 동안 200 V의 정 전압에서 젤을 실행 합니다.
2입니다. 젤의 고정
- 실내 온도 (각 30 분), x 2에 또는 하룻밤 4 ° c.에서 50 rpm에서 궤도 통에 40 %ethanol/10% 초 산의 100 mL 해결책에 젤 전기 이동 법, 후 잠수함
- 3 x 10 분 각 깨끗 한 용기에 초....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
형광은 얼룩에 의해 얼룩이 단백질 밴드 365 nm UV 램프에서 강렬한 녹색 형광을 전시 한다. 모든 14 단백질 밴드 (10-200 kDa), 위에서 아래로, 명확 하 게 보이는, SYPRO 루비 염료 (그림 2)10에 의해 스테인드 14 레드 색 들과 잘 했다.
정량적 단백질 검출에 관한는 젤은 젤 이미징 시스템 자동화 된 절차를 사용 하 여 몇 군데 하 고 이미지 분석 된 상용 소프트웨어를 사용 하 여 비교. 이 형광은 방법 얼룩 나타납니다 높은 해상도. 일부 단백질 밴드에 대 한 형광은 얼룩의 감도 형광 SYPRO 루비 얼룩의 그것 보다 약간 더 나은 이기도합니다. 특히, 형광은 얼룩의 성능은 나타내는 새로운 메서드는 저 분자 무게 단백질의 탐지를 위해 특히 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기는 소설 형광은 얼룩 polyacrylamide 젤에 단백질을 위한 방법. 이 전략은 기존의 얼룩 및 형광 얼룩 통합합니다. 얼룩 악용 다른 실버로 단백질은 이온의 선택적 바인딩 얼룩 하지만 매우 중요 한 fluorogenic 실버를 사용 하 여 TPE 4TA 빛은 바인딩된 단백질을 조사. 하면 전통에 필요에 따라 감소 시각화 단계의 더 이상 요구 하지 않고 매우 민감한 감지 이후 fluorogenic 프로브 TPE 4TA nanomolar 범위11에서 상당히 낮은 농도에 이온을 느낄 수 있다, 실버 얼룩입니다. 이 실행 실행 가능한 변형을 최소화 됩니다. 한편, 포름알데히드와 글, 펩 티 드 식별 MS 분석에 자주 방해를 포함 하 여 가혹한 화학 물질의 사용을 방지 한다. 또한, TPE 4TA AIE 액티브 하 고 자체 냉각 문제 무료, 염료 분자의 수에 대 한 응답에 단백질 밴드에 밀도가 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
이 형광은 얼룩에 특허 출원을 제기 했다.
감사의 글
저자는 그의 기술 지원에 대 한 회복 약, 카롤 린스 카 Institutet 패트릭 챈 명나라와이 라우 센터에 감사 하 고 싶습니다. S. X. 스웨덴 연구 위원회 (그랜트 No. 2017-06344)에서 지원에 대 한 감사입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
LDS 시료 버퍼(4X) | Thermo Fisher Scientific | NP0007 | 시약 |
4-12% Bis-Tris 단백질 겔, 1.0mm, 15웰 | Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | 프리캐스트 겔 |
| 시료 환원제(10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | 시약 |
| MES SDS 러닝 버퍼(20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | 시약 |
| 미니 젤 탱크 | Thermo Fisher Scientific | A25977 | 장비 |
| 300W 전원 공급 장치(230VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | 장비 |
| 염색되지 않은 단백질 사다리 | Thermo Fisher Scientific | 26614 | 샘플 |
| 질산은 | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | 시약 |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | 시약 |
| 아세트산 | J.T. Baker | 103201A | 시약 |
| Milli-Q 합성 A10 | M&Omega를 제공합니다. cm 워터 | ||
| 젤 문서화 시스템(c600 모델) | Azure biosystems-Equipment |
참고문헌
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coor....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
