Polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩

요약

여기, 우리는 새로운 형광 얼룩 polyacrylamide 젤에서 총 단백질 검출에 대 한 기술 개요는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 활용 Ag⁺를 감지 하는 실버 이온 전용 형광 턴 온 프로브-단백질 복합물, 전통적인 발은 얼룩의 특정 한계를 제거 하 고.

초록

실버 얼룩은 널리 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 다음 polyacrylamide 젤에 단백질 밴드를 시각화 하는 데 사용 색도계 기술. 클래식은 얼룩 얼룩, 불 쌍 한 단백질 복구, 낮은 재현성, 정량화, 및 질량 분석 (MS)와 호환성을 제한 된 좁은 선형 동적 범위 높은 백그라운드와 같은 특정 단점이 있다. 지금, TPE-4TA, fluorogenic⁺ Ag 프로브를 사용 하 여 우리 polyacrylamide 젤에서 총 단백질 시각화 방법 얼룩이 지기 형광 실버를 개발 했다. 이 새로운 얼룩 전통적인 실버 얼룩에 성가신 실버 감소 단계를 피할 수 있습니다. 또한, 형광은 얼룩 좋은 재현성, 감도, 및 선형 부 량 단백질 검출, 유용 하 고 실용적인 단백질 젤 얼룩을 만드는 방법을 보여 줍니다.

서론

많은 얼룩 방법 단백질 젤 전기 이동 법에 따라, 예를 들면 Coomassie 화려한 블루, 실버 얼룩, 형광, 색도계 염료를 사용 하 여 시각화 하는 데 사용 되었거나 방사성 라벨^{1,2, 3 , 4}. 실버 얼룩 간주 됩니다 간단 하 고 저렴 한 시 약을 필요로 하는 단백질 검출에 대 한 가장 중요 한 기술 중 하나. 그것은 두 개의 주요 가족으로 분류 될 수 있다: 실버 질산염 및 암모니아은 얼룩 얼룩^5,6. 알칼리 성 암모니아 실버 메서드 실버 diamine 복잡 한 암모니아와 수산화 나트륨 생산 이며 산 성 포 름 알 데히드 솔루션을 사용 하 여 개발 하는 동안 금속은 감소. 얼룩 기본적인 단백질에 대 한 효율적으로 수용 하지만 산 성 및 중성 단백질에 대 한 손상 된 성능을 보여줍니다 그리고, 또한, 클래식 글리신 및 황소자리 전기 이동 시스템. 비교, 실버 질산염 얼룩 악용 단백질은 이온의 높은 바이오 선호도, 주로 sulfhydryl carboxyl 측면 체인에서 그룹 그리고 산 성 단백질을 보다 효율적으로 얼룩 하는 경향이⁷. 실버 이온 바인딩, 후 (일반적으로 만든 포름알데히드와 나트륨 thiosulphate를 포함 하는 금속 탄산 솔루션) 개발 솔루션은 이온 금속은 곡물 브라운-어두운 색상 시각화를 구축을 줄이기 위해 적용 되는 단백질 밴드입니다.

비록은 얼룩의 다양성 및 높은 감도 대 한 잘 알려진 1970 년대⁸의 개발 이후, 방법으로 까다로운 자주 간주 됩니다. 실버 얼룩 방법을 단계 시간 제한 있고 낮은 재현성을 보여줍니다. 실버 얼룩의 색상은 일반적으로 하지 균일 하 고 제어 하기 어렵다, 감소 단계에 따라 이후 실버 얼룩 양적 방법 이며, 따라서, 젤 비교 연구 및 단백질 정량화⁹에 대 한 권장 하지 않습니다. 감도에 최적화 하는 방법 또한 더 유니폼¹⁰얼룩을 제공할 수 있는 알데하이드 활용 수 있습니다. 그러나,이 때문에 알데하이드에 의해 단백질의 가교 추가 다운스트림 분석 비용입니다. 빠른 프로토콜은 주로 조합 또는 재현성 및 얼룩⁵의 균일성을 타협 하는 시간을 줄이기 위해 단계를 단축. 그 결과, 수많은 실버 얼룩 얼룩; 특정 요구 사항에 맞게 최적화 된 각 단백질 젤 내에서 이체 있다 예를 들어 단순, 감도, 또는 펩 티 드 복구 속도 다운스트림 분석에 대 한. 이러한 특성 또한 서로에 영향을 미칠 수 있습니다 그리고 한 프로토콜에서 모든 요구를 만족 시키기 어려울 수 있습니다.

이 작품에서 새로운 형광은 단백질 검출 polyacrylamide 젤에 방법 얼룩을 소개 합니다. 이 방법에서는, 우리 실버 침 단백질¹¹시각화 하은 이온, TPE-4TA (그림 1)에 대 한 fluorogenic 프로브를 사용 합니다. TPE 4TA 집계 유도 방출 (AIE) 원칙에 의해 설계 되었습니다. 그것은 비-브 수성 해결책에서 녹을 때 하지만 높은 브은 이온의 존재. 전통적인 실버 얼룩에 비 개발 단계를 개발 하는 fluorogenic, 바꿔서 형광은 메서드 감소 배경으로 총 단백질의 강력한 얼룩 수 있습니다.

또한, 형광은 얼룩 널리 SYPRO 루비 얼룩과 비교 하 고 전통적인은 얼룩 하지 달성 단백질 정량화에 대 한 좋은 동적 선형 범위를 보였다. 젤 자외선 램프로 일반적으로 사용 되 젤 문서 시스템에 몇 군데 수 있습니다 (여기 파장: 302/365 nm 채널; 방출: 490 ~ 530 nm) 많은 생물학 실험실에서.

프로토콜

1입니다. 젤의 준비

참고: 데모 SDS 페이지¹²직후 얼룩에 대 한 젤을 준비 하는 표준 프로토콜을 따릅니다. 간단히, 다음 단계는 샘플의 준비를 설명 하 고 젤 전기 이동 법.

1. 4%-12% 두번째-트리 스 단백질 젤 (1mm, 15 잘) SDS 페이지 수행 2-(N-morpholino)로 가득 미니 젤 탱크를 사용 하 여 ethanesulfonic 산 (MES) 버퍼.
2. 희석 증류수, 리튬 라우릴 황산 (LDS) 버퍼, 그리고 샘플을 감소 요원의 혼합물으로 샘플.
3. 재고 (10 µ L), 양의 두 배 첫 번째 레인 정상적인 재고 금액 (5 µ L) 및 (13 희석, 8192 x 2 배에서)의 두 가지 희석 후의 일련 로드.
4. 30 분 동안 200 V의 정 전압에서 젤을 실행 합니다.

2입니다. 젤의 고정

1. 실내 온도 (각 30 분), x 2에 또는 하룻밤 4 ° c.에서 50 rpm에서 궤도 통에 40 %ethanol/10% 초 산의 100 mL 해결책에 젤 전기 이동 법, 후 잠수함
2. 3 x 10 분 각 깨끗 한 용기에 초순에 젤을 씻어. 세척 단계는 중요 한. 고정 솔루션에서 산 fluorogenic 개발 단계에서 제대로 제거 되지 않습니다, 경우 과도 한 TPE-4TA 산에 의해 활성화 되 고 젤에서 강한 배경 형광.

3. 준비는 AgNO₃솔루션 및 젤의 실버 침

1. 어 그 노₃ 솔루션 (0.0001%) 임신에 대 한 첫째, 0.01 g 0.1% AgNO₃ 재고 솔루션을 준비 하는 초순의 10 ml에서 AgNO₃ 의 분해. 다음, 작업 솔루션 초순 물 100 mL에 0.1% AgNO₃ 재고 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다.
   참고: AgNO₃ 솔루션 사용 하기 전에 어둠 속에 저장 합니다.
2. 실버 밀폐 유리 용기에서 50 rpm에서 궤도 통에 1 시간에 대 한 솔루션을 작업의 100 mL와 함께 젤 임신 그것은 증기 두건, 알루미늄 호 일 빛에서 보호 아래은 수태를 수행 하는 중요 한입니다.
3. 2 x 60에 대 한 깨끗 한 용기에 초순 (약 100ml)와 젤을 씻어 s.

4. Fluorogenic 젤의 개발

1. 염료 스톡 솔루션 (0.1 m m)를 준비 하려면 초순 물 50 mL에 TPE 4TA 염료의 3.0 mg을 추가 합니다. 몇 분 동안 솔루션을 sonicate 고 염료를 분해 수 있도록 일부 NaOH 솔루션 (예를 들면 1 개 M)를 추가 합니다.
2. 염료 분자는 완전히 용 해 되도록 365 nm UV 램프에서 솔루션의 형광을 확인 하십시오. 만 약 또는 nonemissive 솔루션 전체 해체를 나타냅니다.
   참고: TPE-4TA 은 염료 합성 다음 프로토콜 최근 보고 시 외. ¹⁰ TPE 4TA 솔루션 매우 안정적 이며 달 동안 어둠 속에 보관 하실 수 있습니다.
3. Fluorogenic 개발 솔루션 (10 µ M)의 100 mL를 준비 하려면 초순 물 90 mL에 TPE 4TA 재고 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. PH 미터를 사용 하 여 솔루션의 산도 확인 하 고 7-9를 사용 하 여 수산화 나트륨 용액 (1 µ M)에 그것을 조정할.
4. Fluorogenic 개발 솔루션의 100 mL와 함께 깨끗 하 고 접착성 컨테이너에 젤을 전송 합니다. 젤은 완전히 몰입 솔루션에 다는 것을 확인 하십시오. 컨테이너 봉인. 빛에서 그것을 커버 하 고 하룻밤 실 온에서 50 rpm에서 궤도 셰이 커에 흔들어. 또는, 인큐베이션 단계 수 또한 단축 될 약 ~ 2 h AIE 개발 솔루션 얼룩이 지 고 실내 온도에 그것을 떠날에 대 한 80 ° C로 예 열 하 여.

5. destaining 및 이미징

1. 깨끗 한 용기에 젤을 전송 하 고 30 분 동안 10% 에탄올 100ml에 destain.
   참고: 혼자 물 젤을 씻어 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 destaining에 대 한 10% 에탄올 솔루션을 사용 하 여 시간을 더 효율적입니다. 이 시간에서 30 분으로 destaining 과정을 줄이기 위해 도움이 됩니다.
2. 5 분 동안 초순에 젤 린스.
3. 365 nm 채널 또는 302 nm 채널에서 젤 젤 문서 컴퓨터 이미지.

결과

형광은 얼룩에 의해 얼룩이 단백질 밴드 365 nm UV 램프에서 강렬한 녹색 형광을 전시 한다. 모든 14 단백질 밴드 (10-200 kDa), 위에서 아래로, 명확 하 게 보이는, SYPRO 루비 염료 (그림 2)¹⁰에 의해 스테인드 14 레드 색 들과 잘 했다.

정량적 단백질 검출에 관한는 젤은 젤 이미징 시스템 자동화 된 절차를 사용 하 여 몇 군데 하 고 이미지 분석 된 상용 소프트웨어를 사용 하 여 비교. 이 형광은 방법 얼룩 나타납니다 높은 해상도. 일부 단백질 밴드에 대 한 형광은 얼룩의 감도 형광 SYPRO 루비 얼룩의 그것 보다 약간 더 나은 이기도합니다. 특히, 형광은 얼룩의 성능은 나타내는 새로운 메서드는 저 분자 무게 단백질의 탐지를 위해 특히 ...

토론

여기는 소설 형광은 얼룩 polyacrylamide 젤에 단백질을 위한 방법. 이 전략은 기존의 얼룩 및 형광 얼룩 통합합니다. 얼룩 악용 다른 실버로 단백질은 이온의 선택적 바인딩 얼룩 하지만 매우 중요 한 fluorogenic 실버를 사용 하 여 TPE 4TA 빛은 바인딩된 단백질을 조사. 하면 전통에 필요에 따라 감소 시각화 단계의 더 이상 요구 하지 않고 매우 민감한 감지 이후 fluorogenic 프로브 TPE 4TA nanomolar 범위¹¹에서 상당히 낮은 농도에 이온을 느낄 수 있다, 실버 얼룩입니다. 이 실행 실행 가능한 변형을 최소화 됩니다. 한편, 포름알데히드와 글, 펩 티 드 식별 MS 분석에 자주 방해를 포함 하 여 가혹한 화학 물질의 사용을 방지 한다. 또한, TPE 4TA AIE 액티브 하 고 자체 냉각 문제 무료, 염료 분자의 수에 대 한 응답에 단백질 밴드에 밀도가 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
LDS 시료 버퍼(4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007	시약
4-12% Bis-Tris 단백질 겔, 1.0mm, 15웰	Thermo Fisher Scientific	NP0323BOX	프리캐스트 겔
시료 환원제(10X)	Thermo Fisher Scientific	NP0004	시약
MES SDS 러닝 버퍼(20X)	Thermo Fisher Scientific	NP0002	시약
미니 젤 탱크	Thermo Fisher Scientific	A25977	장비
300W 전원 공급 장치(230VAC)	Thermo Fisher Scientific	PS0301	장비
염색되지 않은 단백질 사다리	Thermo Fisher Scientific	26614	샘플
질산은	Sigma-Aldrich	31630-25G-R	시약
Ethanol	Bragg and co.	42520J	시약
아세트산	J.T. Baker	103201A	시약
Milli-Q 합성 A10			M&Omega를 제공합니다. cm 워터
젤 문서화 시스템(c600 모델)	Azure biosystems-Equipment

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