마약 대상 포용의 측정은 효과적인 약물 개발 및 화학 프로브 유효성 검사를 중앙. 여기, 우리 선발 마약 대상 포용 셀룰러 열 교대 분석 실험 (CETSA)의 미 판 호환 adaption에 높은 콘텐츠 이미징 사용 하 여 측정 하기 위한 프로토콜.
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이 논문에서
요약
초록
Quantitating 그들의 의도 된 단백질 목표와 작은 분자의 상호 작용 하는 것이 신약 개발, 대상 유효성 검사 및 화학 프로브 유효성 검사에 대 한 중요 합니다. 단백질 대상 또는 작은 분자의 수정 없이이 현상을 측정 하는 메서드는 기술적으로 도전 하지만 특히 가치가 있습니다. 세포 열 교대 분석 실험 (CETSA)은 살아있는 세포에서 대상 참여 모니터링 하 한 기술입니다. 여기, 우리는 단일 세포 수준에서 subcellular 지 방화를 유지 하면서 높은 처리량 측정을 위한 수 있는 원래 CETSA 프로토콜의 적응을 설명 합니다. 우리는이 프로토콜 제공 세포의 유형이 다른 인구에서 특히 화합물 대상 상호 작용의 깊이 특성에 대 한 CETSA의 응용 프로그램에 중요 한 진보를 믿습니다.
서론
때 개발 하는 새로운 약물 또는 화학 프로브 측정 대상 인 또는 약혼 라이브 셀1,2,3의 관찰 된 약리 효과 또는 기능 판독 하 필수적 이다. 이러한 데이터는 작은 분자는 실제로 원하는 목표에 도달할 수 있도록 고 단백질 대상 선택4,5뒤에 생물 학적 가설을 확인 하기 위해 필요. 또한, 약물 개발 동안 증가 복잡성의 모델 시스템을 선택 하 여 확증 임상 시험 전에 복합 리드 사용 됩니다. 이러한 전 임상 시스템 생물학의 번역을 확인, 추적 마약 대상 참여와 함께이 개발 과정을 통해 생물학에 대 한 메서드는 중요 합니다.
마약-대상 참여 도전 unfunctionalized 작은 분자와 단백질, 특히 공간적 해상도6,7단일 세포 수준에서 라이브 셀에서 모니터링 하 전통적으로. 간의 상호 작용을 관찰 하는 최근 방법은 수정 되지 않은 약물 및 살아있는 세포에 있는 단백질은 세포 열 변화 분석 결과 (CETSA)는 열 도전 하 응답에서 네이티브 단백질의 ligand 유도 안정화는 정량된8, 9,10. 이것은 열 문제에 노출 된 후 남아 있는 수용 성 단백질을 측정 함으로써 이루어집니다. CETSA의 초기 공개, 서쪽 오 점 검출을 위해 사용 되었다. 심사 캠페인을 활성화 하 고 더 큰 복합 컬렉션의 심사 했다, CETSA 실험의 처리량을 증가 노력 여러 동종, microplate 기반 분석10,11의 개발을 리드를 해야 합니다. 그러나, 이러한 방법 한 가지 한계는 셀 정지에 복합 치료에 현재 가장 적합 한 하며 탐지 세포 세포의 용 해, 공간 정보의 손실에 지도 이다. CETSA 일 수 있다 실험적으로 열 집계 온도 (Tagg) ligand 유도 된 변화에 적용 작은 분자의 단일 농도 또는 ligand 농도 단일 온도에서 단백질을 안정화 하는 데 필요한. 후자은 등온선 복용량 응답 지문 (ITDRF) 이러한 측정 특정 실험 조건에의 의존을 불린다.
이 프로토콜의 목표 대상 약혼이 콘텐츠 현미경12immunofluorescent (IF) 항 체 검출에 의해 부착 셀에 CETSA를 사용 하 여 측정 하는입니다. 이 절차는 subcellular 지 방화의 절약 대상 포용의 단일 셀 정량화에 대 한 허용 하도록 원래 CETSA 플랫폼을 확장 합니다. 특히, 많은 이전 보고서와 달리이 절차에서 복합 치료 수행 됩니다 라이브 부착 세포 표면 분리 또는 열 도전, 따라서 우리가13를 측정 하는 것을 목표로 설립 된 바인딩 균형을 보존 하기 전에 세척 하지 않고. 현재 메서드는 유효성을 검사 한 대상 단백질 p38α에 대 한 (MAPK14)에 여러 셀 라인, 그리고 우리는이 절차를 공유 함으로써 기술 적용 광범위 하 게 녹는 프로테옴 바랍니다. 우리는이 프로토콜 검사에서 약물 개발 파이프라인에 걸쳐 적용할 수 있습니다, 대상 참여에서 vivo에서의 모니터링을 통해 심사 히트 예상.
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프로토콜
1. 셀의 시드
참고: 워크플로 대 한 일반적인 개요에 대 한 그림 1을 참조 하십시오. 재료 및 시 약의 상세 목록 테이블의 재료에서 사용할 수 있습니다.
- 셀의 시드, 이전 나중 단계에서 난방 접시 아래 갇혀 공기 방울을 피하기 위해 검은 384-잘 이미징 분석 결과 접시의 프레임에 표준 드릴 구멍을 드릴 합니다. 플라스틱 입자가이 단계 동안 우물을 입력을 방지 하 고 살 균 조건을 유지 하기 위해 밀봉 접착제 알루미늄 호 일 접시 또는 조직 문화 후드에 드릴링 전에 접시 커버. 일반적으로, 각 접시 (짧은 가장자리)의 측면에 3.5 m m의 직경을 가진 3 구멍 충분.
- 70% 에탄올으로 청소 하 여 층 류 벤치를 준비 합니다. 표준 무 균 조직 배양 기술, 다음 셀 플라스 크 또는 접시에서 미디어를 제거 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 5-10 mL로 세포 세척 하 고 플라스 크에 트립 신 2 mL를 추가 합니다. A-431 셀 분리 될 때까지 플라스 크에서 37 ° C를 품 어. Haemocytometer 또는 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 문화 매체에 50, 000 셀/mL의 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
- 벌크 시 약 디스펜서 또는 실험의 규모에 따라 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 분석 결과 플레이트의 각 음에 세포 현 탁 액 (주는 잘 당 2000 셀 마지막 셀 밀도)의 40 µ L을 분배. 짧게 사이드-투-측면에서 접시의 바닥에 세포를 균일 하 게 분산 하는 접시를 이동 합니다.
- 접시 가장자리 효과 최소화 하기 위해 층 류 두건 뒤 실 온에서 20 분에 대 한 분석 결과 접시의 하단에 정착을 셀 수 있습니다. 다음, 다습 한 대기권을 보장 하기 위해 젖은 종이 타월로 플라스틱 용기에 접시를 놓습니다. 사용 전에 70% 에탄올과 플라스틱 용기를 닦아.
- 기존의 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 2-3 일에 대 한 분석 결과 플레이트 상자를 품 어. 가벼운 현미경으로 검사 하 여 평가는 50-75%까지 셀의 confluency를 모니터링 합니다.
2. 복합 치료
- 실험 당일, 잘 사용 하 여 각 접시 세탁기에서 중간 발음. 접시 와셔에 접시를 놓고 포부 프로그램을 선택 합니다. 접시 와셔를 사용할 수 없는 경우에, 액체 폐기물 트레이 또는 싱크를 통해 빠른 손 트위스트와 함께 접시를 반전 하 여 제거할 수 있습니다. 액체의 완전 한 제거 좋은 성능을 위해 필수적 이다. 어떤 초과 액체 다음 종이 타월로 dabbing에 의해 제거 됩니다.
- 자동 분배를 사용 하 여 세포 배양 또는 실험의 규모에 따라 멀티 채널 피 펫 적절된 농도를 희석 하는 화합물의 30 µ L를 추가 합니다. 각 분석 결과 접시에 여러 우물을 네거티브 (DMSO)와 긍정적인 (알려진된 ligand) 컨트롤을 추가 하려면 확인 하십시오. 이후이 열 교대 분석 실험, 화합물 농도 분리 상수 관찰 단백질 안정화를 초과 하는 것이 필요 하다. 따라서, 화합물 농도 대 한 대략적인 가이드라인은 50-100 번 IC50, 하지만 화합물 농도 대 한 더 많은 세부 사항 설명을 토론 섹션에서 찾을 수 있습니다.
참고: 셀 라인의 DMSO 내성 실험 전에 시험 되어야 한다. - 인감 숨 플레이트 화합물 처리 분석 결과 플레이트 밀봉 하 고 30 분 동안 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 에서 품 어.
3. 열 도전
- 먼저, 원하는 온도에 물 목욕을 설정 합니다. 참고 분석 결과 접시의 우물 내부에 도달 최종 온도 물 목욕에 최종 온도에서 다를 수 있습니다. 더미 플레이트 및 열전대 온도계와 오프셋을 미리 조사. 그것은 일반적으로 원하는 온도에서 안정화 목욕 30 분 걸립니다.
- 원하는 온도 난방 단계 분석 결과 격판덮개의 우물에서에 도달 확인, 분석 결과 접시와 매체의 동일한 볼륨을 포함 하는 봉인 되지 않은 더미 플레이트를 준비 합니다.
- 인큐베이터에서 분석 결과 플레이트를 제거 합니다. 숨 봉인 해제 하 고 다시 물 물 목욕에 연속적인 난방 동안 우물에 누설 것 이다 되도록 꽉 접착제 알루미늄 호 일 화합물 취급 셀을 포함 하는 분석 결과 접시를 봉인. 플레이트 프레임에 드릴된 구멍 액세스할 수 있는지 확인 하십시오.
- 접시 아래에서 밖으로 남아 있는 공기를 물 표면으로 각도 판의 아래쪽 물 목욕에 분석 결과 접시와 접시 더미를 놓습니다.
- 열전대 온도계를 사용 하 여 새로운 더미 격판덮개의 우물 내부 온도 모니터링 합니다.
- 분석 결과 접시 물 욕조에 3 분 동안 열. 즉시 다른 물 목욕을 5 분 동안 방 강화 물 분석 결과 및 더미 플레이트 전송. 분석 결과 격판덮개는 이제 추가 처리에 대 한 준비 이다.
4입니다. 고정
- 벌크 시 약 디스펜서 또는 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 분석 결과 접시에 직접 10 µ L 16% (w/v) paraformaldehyde (PFA)을 분배. 20 분 동안 실 온에서 품 어.
참고: 일부 fixatives 발암으로 분류 되 고 기관 안전 규정을 따라야 한다. - PFA 솔루션 발음 하 고 접시 와셔를 사용 하 여 300 µ L PBS를 가진 세포를 씻어. 접시 와셔에 접시를 놓고 포부 프로그램을 선택 합니다.
참고:이 절차는 최적화 되어 있는 액체는 동시에 적절 하 게 하 고 제거 접시 세탁기에 오버플로 프로토콜을 사용 하. 접시 와셔 또는 유사한 절차를 사용할 수 없는 경우 세척 단계 수동으로 수행할 수도 있습니다. - 수동 세척 절차: 폐기물 트레이 또는 싱크를 통해 빠른 손 트위스트와 함께 접시를 반전 하 여 우물에서 액체를 제거 합니다. 액체의 완전 한 제거 좋은 성능을 위해 필수적 이다. 멀티 채널 피 펫으로 PBS의 80 µ L을 추가 및 위에서 설명한 대로 다시 접시를 반전, 세척 절차를 두 번 반복. 마지막 세척 후 깨끗 한 종이 수건을 초과 액체를 제거에 대 한 접시를 되 리.
5입니다. permeabilization
- 0.1% (v/v) NP 40를 멀티 채널 피펫으로와 웰 스의 20 µ L을 추가 하 고 10 분 동안 실내 온도에 품 어. (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차를 사용 하 여 셀을 씻어.
- 또는 적절 한 경우 적용 한 항 원 검색 프로토콜, 예를 들면:
- 멀티 채널 피펫으로와 우물에 1 %SDS 20 µ L를 추가 합니다. 5 분 동안 실내 온도에 incubate 고 (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차에 따라 씻어.
- PH 7.2에서 10 mM 글리신의 80 μ를 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어. 접시 와셔를 사용 하 여 접시 세탁기에 배치 하 고 포부 프로토콜을 선택 하 여 글리신 솔루션 발음 접시 와셔를 사용할 수 없는 경우 2.1에 4.2 노트를 참조 하십시오.
6. 차단
- 벌크 시 약 디스펜서 또는 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물에 PBS에서 1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 15 µ L를 추가 합니다. 접시 알루미늄 호 일 접시 도장 4 ° C에서 1 시간 동안 실내 온도에 또는 밤새 품 어.
7. 1 차 항 체
- 접시 와셔를 사용 하 여 접시 세탁기에 배치 하 고 포부 프로토콜을 선택 하 여 차단 솔루션 발음 접시 와셔를 사용할 수 없는 경우 2.1에 4.2 노트를 참조 하십시오.
- 1 차적인 항 체 따라 희석의 10 µ L을 추가 1% (w/v) BSA PBS에 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물에. 접시 알루미늄 호 일 접시 도장 4 ° C에서 1 시간 동안 실내 온도에 또는 밤새 품 어.
8. 2 차 항 체
- 1 차적인 항 체 솔루션을 발음 하 고 (단계 4.2) 위에서 설명한 동일한 절차에 따라 우물을 세척.
- 알 렉 사 488 이차 항 체 따라 희석의 10 µ L을 추가 1% (w/v) BSA PBS에. 1 시간 동안 실 온에서 품 어. 빛 으로부터 보호 하기 위해 접착제 알루미늄 호 일 인감과 접시를 봉인.
참고:이 빛에서 접시와 후속 단계를 보호 합니다.
9. 핵 얼룩 및 셀 마스크
- 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물 PBS에 0.05 mg/mL를 희석 하는 핵 염색의 10 µ L를 추가 합니다. 추가 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
- 이차 항 체 및 Hoechst 솔루션 aspirate과 웰 스 (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차를 사용 하 여 세척.
- 셀 마스크 200 ng/mL PBS에 멀티 채널 피펫으로 사용 하 우물에 희석의 10 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 실 온에서 품 어.
- 셀 마스크 솔루션을 발음 하 고 우물 (4.2 단계) 위에서 설명한 동일한 절차를 사용 하 여 세척.
- 접시 와셔, 벌크 시 약 디스펜서 또는 멀티 채널 피펫으로 사용 하 여 모든 우물에 PBS의 60 µ L를 분배 하 고 밀봉 접착제 알루미늄 호 일로 접시.
10. 이미지 수집 및 분석
- 3 형광 채널을 사용 하 여 높은 콘텐츠 영상에 이미지 캡처: DAPI (387/447), GFP (472/520) 및 TexasRed (562/624). 10 X 목표를 사용 하 여 잘 당 4 이미지를 취득 합니다. 자동된 레이저 자동 초점을 사용 하 고 범주화 2 중 적용. 16 비트, 회색 스케일 tiff 파일로 메타 데이터와 함께 이미지를 저장 합니다.
- 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 합니다. DAPI (핵)와 TexasRed (세포질) 셀 점수 알고리즘을 사용 하 여 셀 경계를 식별 합니다.
- 추가 데이터 분석에 대 한 모든 인수 파장에 대 한 평균 강도 추출 합니다.
- 분석 결과의 안정성을 보장 하기 위해 Z 요소를 계산 합니다.
- 다음 수식을 사용 하 여 % 안정화 계산: 100 * (1-(잘 강도-평균 잘 휘도 부정적인 제어) / (평균 휘도 긍정적인 제어 평균 강도 부정적인 제어)). 여기 부정적인 제어 DMSO 이며 긍정적인 컨트롤 참조 물질 이다. 각 화합물에 대 한 최대 및 최소 안정화 농도 제어 우물의 강도 값 대신 가끔 사용 됩니다 이후 최대 안정화 화합물 사이 다를 수 있으며 실제로 ITDRF 곡선에 대 한 긍정적인 통제 보다 클 수, .
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결과
그림 1 에 설명 된 프로토콜에서는 높은 콘텐츠 영상으로 남아 있는 수용 성 단백질의 탐지와 부착 세포에 CETSA 분석 실험을 실행 하기 위한 기본 워크플로 설명 합니다. 이 워크플로 화합물 또는 약14의 격판덮개 레이아웃을 수정 하 여 쉽게 분석 결과 개발의 모든 단계에 맞게 수 있습니다. 우리 선발 예상된 결과 예상 몇 가지 사용 하는 경우 아래.
항 체 식별 및 분석 결과 개발입니다. 성공적인 결과 대 한 필수 구성 요소는 기본 항 체 또는 선택적으로 열 동안 집계 및 침전 된 단백질의 단백질의 기본 형태를 인식 하는 다른 적합 한 선호도 시 약의 식별 3 단계에 도전 한다. 설정 하려면 여기에 설명 된 CETSA 이미징 분석 결과, 우리는 긍정...
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토론
결과 섹션에서 설명 했 듯이, 절차를 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 그것은 높은-품질 선호도 시 약을 식별 하는 것이 중요입니다. 각 원하는 대상에 대 한 항 체의 작은 도서관을 심사 하는 것이 좋습니다. 1 차적인 항 체를 선택한 후 적절 한 단백질 대상의 다른 바인딩 사이트의 숫자에 대 한 시스템의 유효성을 검사 하는 것이 중요 이기도 합니다. 열 문제를 생략 하 여 그림 2C 와 같이 분석 결과 신호 방해 하는 화합물에 대 한 카운터 검사는 매우 좋습니다. ligand의 존재에 있는 감소 된 신호를 관찰 하는 때 단계 5.2에서에서 설명한 대로 항 원 검색 프로토콜을 테스트할 수 있습니다. 플레이트의 고르지 못한 난방 관찰된 데이터 변동 및 격판덮개 변형을 일으킬 수 있습니다. 접시 부분적으로 (3.4 단계) 과도 열 도전 하는 동안 물 욕조에 잠긴 이후 플레이트의 외부 우물 외부 벽을 통해 뿐만 아니라 우물의 바닥에서 뿐만 아니라 뜨거운 물에 노출 됩니다. 이...
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공개 사항
저자 아무 공개 보고 있다.
감사의 글
저자는 과학 생활 연구소와 카롤 린스 카 Institutet 위한 인프라 지원을 인정합니다. 저자는 또한 입력과 Michaela Vallin, 막달레나 Otrocka와 토마스 Lundbäck 토론을 인정합니다.
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재료
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