대뇌 피 질의 로컬 필드 전위 및 응답 Nociceptive 레이저 자극으로 자유롭게 이동 하는 쥐에서 Electrocorticograms의 동시 녹음

Summary

우리는 동시에 응답 nociceptive 레이저 자극으로 자유롭게 이동 하는 쥐에서 electrocorticography와 로컬 필드 전위를 기록 하는 기술을 개발 했다. 이 기술은 nociceptive 정보를 뇌에서 처리 조사를 용이 하 게 electrocortical 신호는 생체 및 거시적인 수준에서의 직접적인 관계를 설정 하는 데 도움이 됩니다.

Abstract

Electrocortical 응답, nociceptive 무료 신경 엔딩을 선택적으로 활성화 하는 레이저 열 펄스에 의해 elicited nociceptive 정보 대뇌 피 질의 처리를 조사 하는 많은 인간과 동물 연구에서 널리 사용 됩니다. 여러 과도 응답 시간 고정 레이저 자극의 발병에는 이러한 레이저 갖는 뇌 전위 (LEPs)에 의하여 이루어져 있다. 그러나, LEP 응답의 기능 특성 아직도 크게 알려지지 않은, 동시에 피 (즉, electrocorticogram [ECoG]과 두 피 표면에 신경 활동을 기록할 수 있는 샘플링 기법 부족 [두 피 뇌 파] 뇌 파)와 (즉, 로컬 필드 가능성 [LFP]) 뇌 내부. 이 문제를 해결 하려면 선물이 여기 자유롭게 움직이는 쥐를 사용 하 여 동물 프로토콜. 이 프로토콜은 세 가지 주요 절차의 구성: (1) 동물 준비 및 수술 절차, (2) 동시 녹음 ECoG 및 LFP nociceptive 레이저 자극, 그리고 (3) 데이터 분석 및 기능 추출에 대 한 응답에서. 특히, 3D 인쇄 보호 쉘의 도움으로, 쥐의 두개골에서 이식 ECoG와 LFP 전극 함께 안전 하 게 개최 했다. 데이터 수집 하는 동안 레이저 펄스는 때 동물 자발적인 고 요함에 챔버 바닥에 있는 간격을 통해 쥐의 forepaws에 전달 되었다. 지속적인 백색 잡음 청각 시스템의 정품 인증 피하기 위해 레이저에서 생성 된 초음파에 의해 연주 되었다. 결과적으로, nociceptive 응답만 선택적으로 기록 되었다. 우리 LEPs 높은 신호 대 잡음 비율을 보여주는 결과 얻은 (예를 들어, 대역 통과 필터링, epoch 추출, 및 기준선 보정) 두뇌 자극 관련 응답을 추출 하 표준 분석 절차를 사용 하 여, ECoG 및 LFP 전극에서 동시에 기록 했다. 이 방법론 ECoG LFP 활동의 동시 녹음을 가능 하 게, 생체 및 거시적인 수준에서 electrocortical 신호에 따라서 nociceptive 정보 처리의 조사를 촉진의 다리를 제공 하 두뇌.

Introduction

뇌 파 진동 뇌 활동은 뇌에 뉴런의 수천의 동기화 된 활동에 의해 생성 된 전기 잠재력을 기록 하는 기술입니다. 그것은 많은 기초 연구와 임상 응용^1,2에 널리 사용 된다. 예를 들어, 뇌 파 응답 강렬한 레이저 펄스 (즉, LEPs) 열 nociceptive 감각 입력된^3,,45의 주변 및 중앙 처리 조사에 널리 채택 된다. 인간에서는, LEPs 주로 이루어져 세 가지 심한: somatotopically 조직과 가능성이⁶기본 somatosensory 피 (S1) 활동을 반영 하는 초기 구성 요소 (N1) 그리고 늦은 구성 요소 (n 2와 P2) 중앙 분산 하 고 보조 somatosensory 피 질, insula, 및 이전 대상 피 질^7,8의 활동을 반영 하기 위해 가능성이. 이전 연구^9,10, 우리 뇌의 노출된 표면에 전극에서 그 쥐 LEPs, ECoG (intracranial 뇌 파의 일종)를 사용 하 여 샘플링을 시연, 세 가지 심한 ( 의 구성도 즉,, somatotopically 조직 N1 중앙 분산 n 2와 P2). 극성, 순서, 및 쥐 LEP 컴포넌트의 지형 인간의 LEPs¹¹와 유사 하다. 그러나, 때문에 두 피 뇌 파와 경 ECoG 녹음¹²의 제한 된 공간 해상도, 뇌 파의 부정확 한 특성 뿐만 아니라 소스 분석 기법¹³, LEP 구성 요소에 신경 활동의 상세한 기여 많은 토론. 예를 들어 그것은 불분명 한 경우와 S1 레이저 자극⁶elicited 대뇌 피 질의 응답 (N1)의 초기 부분에 기여 하는 정도입니다.

거시적인 수준, 직접 intracranial 녹음 stereotaxic 기구 및 microdrives^14,에 의해 원조 하는 microwire 배열을 사용 하 여에 기록 기술에서 다른¹⁵ 신경 활동 (예를 들어, LFPs 측정 수 있습니다. )의 특정 지역. LFPs는 주로 로컬 신경 인구¹⁶의 금지 또는 흥분 성의 postsynaptic 잠재력의 합계를 반영합니다. LFP 샘플링 신경 활동 기록 전극 주위 마이크로미터의 수백에 내에서 발생 하는 신경 과정을 반영, 이후 생체 수준에서 뇌에서 처리 하는 정보를 조사 하이 녹음 기술은 널리 이용 된다. 그러나, 그것은 단지 뇌 활동의 정확한 지역 변화에 초점을 맞추고 및 여러 영역에서 신호는 통합 하는 방법의 질문에 대답 수 없습니다 (예를 들어, 여러 뇌 영역에 LEP 구성 요소는 통합 하는 방법).

ECoG 및 자유롭게 이동 하는 쥐에서 피 질 LFPs의 동시 녹음 거시적인 모두에서 처리 하는 대뇌 피 질의 정보 조사를 촉진 수 주목할 만한 생체 수준. 또한,이 방법론 조사 범위를 미리 정의 된 뇌 영역의 신경 활동은 LEPs 기여할 수 있는 좋은 기회를 제공 합니다. 실제로, 스파이크, 대뇌 피 질의 LFP 사이의 일관성을 평가 하는 몇몇 이전 학문 그리고 ECoG^17,18 신호 시연 LFP^19,20 EEG 전극에 인접 한에 기여는 자극-관련 된 뇌 반응의 형성입니다. 그러나, 기존 기술은 전극 충돌에 의해 손상 되지 않도록 보호 껍질의 부족으로 인해 마 취 동물에서 두뇌 응답을 일반적으로 사용 됩니다. 즉, 쥐를 자유롭게 이동 생체 (대뇌 피 질의 LFP) 및에서 거시적인 (뇌 파와 ECoG) 수준에서 electrocortical 신호의 다리를 구축할 수 있는 기술은 아직 부족 한.

이 문제를 해결 하려면 우리는 ECoG 및 대뇌 피 질의 LFPs 자유롭게 이동 하는 쥐에서 동시에 여러 뇌 영역에 기록 수 있는 기술을 개발 했다. 이 기술은 nociceptive 정보를 뇌에서 처리 조사 촉진 생체 및 거시적인 수준에서 electrocortical 신호의 직접적인 관계를 설정 하는 데 도움이 됩니다.

Protocol

(400-450 g 무게) 성인 남성 Sprague-Dawley 쥐 실험에서 사용 되었다. 모든 수술 및 실험 절차 관리 및 건강의 국가 학회의 실험실 동물의 사용에 대 한 가이드를 따라. 절차는 심리학, 중국 과학원의 연구소에서 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 전극 이식

1. 수술 전에 1 L/min의 공기 흐름 속도와 5 %isoflurane 챔버에 쥐 anesthetize
2. Stereotaxic 기구를 사용 하 여 마 취 마스크에 그것의 코를 가진 쥐의 머리를 수정 합니다. Isoflurane 통해 수술 중 마 취 깊이 유지 하기 위해 0.5 L/분의 공기 흐름 속도 2%의 농도에서 마 취 마스크 관리 하는 Note 외과 공차 쥐 발가락 곤란에 응답 하지 못할 때 이루어집니다.
3. 각 막 건조를 피하기 위해 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
4. 표준 면도기를 사용 하 여 쥐 두 피 위쪽 면도.
5. 요오드를 제거 하려면 의료 iodophor 살 균 솔루션 및 75% 알코올을 사용 하 여 두 피 소독.
6. Lidocaine (2%) 지역 진통에 대 한 두 피에 주사. 아트로핀 (0.2 mL i.p.) 호흡기 hypersecretion를 억제 하기 위해 관리 합니다.
7. 메스를 사용 하 여 두 피에 약 2-3 cm의 중간 절 개를 확인 합니다. 잘라 중간 선 따라 피의 일부를 제거 하 고는 두개골을 노출. electrocoagulator를 사용 하 여 출혈, 필요한 경우 중지.
8. 미리 정의 된 stereotaxic 좌표 (Bregma의 위치에 따라 배치)에 따라 ECoG 전극의 위치와 (각각 2, 4 m m caudally 람다, 배치) 중간에 참조 및 접지 전극의 위치를 표시 합니다.
9. 드릴 구멍 (직경: 0.5 m m) ECoG 나사를 사용 하 여 전기 두개골 드릴 표시 된 사이트에서 두개골에는 경질을 파괴 하지 않고.
10. 스테인리스 스틸 스크류 드라이브 (외부 직경: 0.6 m m)는 기본 dura를 관통 하지 않고 약 1 m m 깊이 구멍에 절연 코팅 구리 와이어에 연결. 이 나사는 실험 기간 동안 ECoG, 참조, 및 지상 전극으로 행동.
11. 장소는 두개골에 기본 방호 포탄입니다. 치과 아크릴을 사용 하 여 두개골에 그것의 인접 한 나사 베이스를 수정 합니다. 덮기에서 깊이 와이어 이식에 사용 될 영역을 보호 하기 위해 나중에 제거 될 수 있는 의료 면을 사용 합니다.
    참고: 보호 껍질은 세 부분으로 구성 된 맞춤형 3D 인쇄 polylactic 제품: 기초, 벽, 그리고 모자. 벽은 패러데이 케이지로 구성 하는 구리 테이퍼 적용 됩니다.
12. 미리 정의 된 stereotaxic 좌표에 따라 깊이 와이어 전극의 위치를 표시 합니다.
13. 드릴 작은 구멍 (직경: 0.2 m m) 와이어 주입에 대 한 표시 사이트 주위 두개골에 뼈 플랩 경질 폭로 조심 스럽게 제거 하 고. 워시는 craniotomy 자주, 일반 식 염 수를 사용 하 여. 그림 1 깊이 와이어 전극의 주입 하기 전에 설정을 설명합니다.
14. 바늘을 사용 하 여, 들어올린 pia mater, 선박과 피 질의 표면 손상 없이 경질을 잘라.
15. 낮은 깊이 와이어 전극은 피 질 표면에 그리고, 다음, 천천히 뇌의 대상 깊이 침투 합니다. 자주 중지 대뇌 피 질의 탄력성을 위한 전극 아래로 이동 합니다. 현재 연구에서 와이어 끝의 깊이 대뇌 피 질의 표면 아래 0.5 m m 이다.
16. 후속 실험 조작에 대 한 깊이 와이어 전극을 이동할 수 있도록 왁 스, 파라핀 오일의 혼합물으로 craniotomy 인감.
17. 치과 아크릴을 사용 하 여 두개골에 전극 기구를 수정 합니다.
18. ECoG 나사 커넥터 모듈에 해당 채널에 연결 하는 각 구리 와이어 용접. 다른 수로 사이 잠재적인 접촉을 피하기 위해 찰 흙을 사용 하 여 용접 반점 커버.
19. 기지를 보호 쉘 벽을 조립 하 고 해당 채널에 참조 및 지상 전극 용접.
20. 수정 테이프를 사용 하 여 오염을 방지 하는 보호 껍질 모자.
21. 페니실린으로 쥐를 주사 (60000 U, i.p.) postsurgical 감염을 방지 하기 위해 수술 후 즉시.
22. 단일-집에는 온도 및 습도-제어 쥐 케이지 고 음식 수술 후 12 h 주/야 주기에서 그것을 유지 하 고 광고 libitum LEP 실험 전에 적어도 1 주 동안 물.
    참고: ECoG 및 대뇌 피 질의 LFP 활동, 기구를 동시에 기록 하는 사용 여기 텅스텐 와이어 배열에 연결 된 여러 microdrives를 포함 한 커넥터 모듈에 연결 된 전극의 두 종류 조립 했다. 골드 핀 커넥터 모듈의 전극 인터페이스 보드 (EIB)에 텅스텐 와이어를 연결 하는 EIB에 작은 금속 구멍에 철사를 눌러 사용 되었다. EIB에 두 개의 금속 구멍 코팅 구리 전선과 납땜 했다 고 각 구리 와이어의 오픈 엔드 ECoG 나사에 연결 된 해당 구리선으로 납땜 했다. 제조의 세부 되었습니다²¹설명 되어.

2. 데이터 수집

1. 쥐 실험²²잘 알고 얻을 수 있도록 실험 하기 전에 3 개 이상의 연속 일 동안 하루 x 적어도 1 쥐를 간지 럼.
2. 쥐 쥐 녹음 환경에 acclimatizes 수 있도록 실험 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 행동 챔버에 배치 합니다.
   참고: 챔버 측면 길이 30 ㎝의 플라스틱 입방체 이다. 챔버의 바닥 ~ 8 mm 간격으로 철 격자의 이루어집니다.
3. 전극 모듈 기록 headstage 연결 부드럽게, 쥐를 무서 워 하 고 전극 모듈의 손상을 방지 하려면.
4. 레이저 발생기를 설정, 광학 섬유 연결 하 고 장비 통신 수의 설명서에 따라 레이저의 점 크기를 조정. 기록의 디지털 입력 포트 트리거 생성기에서 디지털 출력을 연결 합니다.
   참고: 주의 하지 광학 섬유는 섬유에서 위반을 피하기 위해를 지나치게 곱슬 곱슬. 녹음 하기 전에 방 아 쇠 신호 표시 되 고 레코딩 소프트웨어에 의해 기록 된 있는지 확인 합니다. 이 프로토콜에서 빛나는 열 자극 적외선 네오디뮴 이트륨 알루미늄 페로 의해 생성 됩니다 (Nd: 짖) 1.34 μ m의 파장을 가진 레이저. 자리 레이저 크기의 직경 약 5 m m 초점 렌즈에 의해 설정 됩니다. 그-Ne 레이저 자극된 지역, 실험의 목적에 따라 정의 되는 지적 했다. 또한, 레이저 펄스의 자극 에너지 실험 설계에 따라 결정 됩니다. 레이저 맥 박 내구 4 ms입니다.
5. 그 발 nociceptive 레이저 자극을 받으면 지속적으로 쥐의 nociceptive 동작을 기록 하는 실험 챔버의 모서리 아래 비디오 카메라를 설정 합니다. 위치를 조정 하 고 되도록 nociceptive 행동 카메라의 방향을 완전히 실험을 통해 기록 됩니다.
   참고: 고속 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라는 좋습니다로 발병 시간과 nociceptive 동작의 기간을 정확 하 게 기록 기록 시스템의 메인 보드에 동작 신호를 제공할 수 있습니다. Nociceptive 동작 다음과 같이 동물 운동^23,24에 따라 이전에 정의 된 기준에 따라 각 레이저 자극 후에 실험에 의해 평가 됩니다: 운동 (점수 = 0), 머리-터 닝 (떨고 포함 또는 올리는 머리; 점수 = 1), 꽁 (즉, 작은 갑작스러운 신체 움직임을 쳐 주는, 점수 = 2), 철수 (즉, 레이저 자극에서 발 철회; 점수 = 3), 사슬 및 전신 운동 (점수 = 4).
6. 챔버의 상단에는 스피커를 통해 지속적인 백색 잡음 (50 dB SPL) 제공 합니다.
   참고: 이전 연구^10,25같이 피부에 전달 하는 레이저 자극 쥐 청각 시스템에 의해 검출 될 수 있는 초음파를 생성 합니다. 이러한 이유로, 지속적인 백색 잡음은 초음파 레이저 생성에 대 한 응답 청각 시스템의 활성화를 방지 하는 실험을 통해 재생 됩니다. 이 절차는 nociceptive 시스템의 활성화와 관련 된 두뇌 응답의 선택적 기록 수 있습니다.
7. 모두는 ECoG와 장비 통신 수의 설명서에 따라 기록 시스템을 사용 하 여 깊이 와이어 전극에서 electrophysiological 데이터를 수집 합니다.
   참고: 카메라 및 레이저 펄스의 신호 동시 electrophysiological 데이터와 동시에 샘플링 하는 트리거 동작 신호 샘플링 속도 (모든 데이터는 증폭 및 20000 Hz의 샘플링 속도 사용 하 여 디지털화), 보장 하는 모든 데이터는 시간 동기화.
8. 챔버의 바닥에 있는 간격을 통해 쥐의 forepaw의 발바닥에 레이저 펄스를 제공 합니다.
   참고: 레이저 자극만 전달 때 쥐 2 이상에 대 한 자발적인 고 요함의 운동 관련 유물 신호 오염을 최소화 하기 위해 실험의 관찰을 바탕으로 s. 레이저 광선의 대상 각 자극 후 수동으로 난민은 nociceptor 피로 또는 민감 화를 방지 하려면 그리고 interstimulus 간격 40 s. ECoG 및 LFP 신호 각 쥐에서 여러 번 기록할 수 보다 짧은 되지 않습니다. 쥐 각 녹음 세션 전에 실험 챔버 1 시간에에서 있이 필요가 있다. 결국 녹음 세션, 쥐 취 깊이 했다 그리고 4 %paraformaldehyde 뒤 차가운 인산 염 버퍼 염 분으로 transcardially를 끼얹는다. 두뇌는 두개골에서 제거 되었고 전극 위치를 식별 하는 구분.

3. 데이터 분석

1. 1 30 Hz 사이의 대역 통과 필터와 지속적인 데이터를 필터링 합니다.
2. Epoch 3의 분석 창을 사용 하 여 데이터 1에서 확장 하는 s s 2 하기 전에 레이저 자극의 발병 후 s. 기준선 보정 prestimulus 간격 내 평균 진폭을 빼는 방법으로 수행 됩니다.
3. 수동으로 총 유물에 의해 오염 epochs 거부 합니다.
4. 시간 고정 각 실험 조건에 대 한 레이저 자극의 발병에는 평균된 LEP 파형을 계산 합니다.
5. 와이어 전극 ECoGs와 깊이에서 기록 된 LEP 파형의 웨이 블 릿 변환 일관성 (911 무역)을 계산 합니다.
   참고: WTC 시간의 기능으로 전극의 쌍 및 주파수 사이의 일관성을 수행 하는 기술입니다. 전체 시간-주파수 스펙트럼에 대 한 일관성 값 생성의 이점이 있다 모든 시간-주파수 포인트에 대 한 2 개의 신호 사이 WTC는 계산할 수 있습니다. 방법론의 세부 되었습니다²⁶설명 되어.

Results

대표적인 실험에서 5 쥐에서 electrophysiological 데이터 기록 되었다. 레이저 자극과 20 번 각 쥐의 오른쪽 forepaw 전달 되었고 > 40 s interstimulus 간격. 응답 ECoG 나사 깊이 와이어와 깊이 와이어를 사용 하 여 기록 된 레이저 갖는 뇌 양자 기본 somatosensory 외피가 (S1) 및 기본 모터 외피가 (M1)에 이식 되었다.

그림 1에 요약 된 대로 두 개의 ECoGs (블랙에서 표시)와 깊이 와이어 전극 (색상, 각 4 개 지역 5 전선 표시) (표현 Bregma, 참조 하는 다음 위치에서 stereotaxic 좌표에 따라 배치 했다 mm; 양수 X 및 Y 축 값 표시 오른쪽 및 앞쪽 위치, 각각): 왼쪽된 ECoG에서 X =-1.5와 Y = 1.7...

Discussion

현재 연구에서 우리는 ECoGs 및 대뇌 피 질의 LFP 응답 nociceptive 레이저 자극에서 쥐를 자유롭게 이동 하 여 elicited 동시에 기록 하는 기법을 설명. 결과 LEP 응답 ECoG 및 LFP 신호에 레이저 자극의 발병 후 명확 하 게 검출 될 수는 나타났다. ECoG 및 대뇌 피 질의 LFP 신호 동시 녹음에는 더 나은 이해 LEP 구성 요소에 신경 활동의 기여에 대 한 그들의 관계를 조사 하는 과학자 수 있게 된다.

5 중요 한 단계는 제안 된 기술에 주목 해야 한다. 첫째, 있는지 확인 하는 두개골의 표면 청결 하 고 건조 치과 아크릴을 사용 하 여 그것에, 보호 쉘 기본을 고정 하기 전에 중요 하다. 이 단계는 보호 쉘 기반 안정적으로 고정 되어 있습니다. 둘째, ECoG 나사의 직경 보다 약간 큰 그는 구멍의 초기 나사 운전 확대 합니다 스크류 스레드를 구멍 때문. 현재 연구에서 텅스텐 와이어 구멍와 ECoG 나사 구멍 사이의 거리는 매우 작은 (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
수컷 Sprague-Drawley 쥐	Vital River
Isoflurane	RWD 생명 과학
소동물 이소 플루란 마취 시스템	RWD 생명 과학		쥐 용 마취 방독면을 포함
입체 요법 장치	RWD 생명 과학
ECoG 및 LFP 전극			이 결합 된 장치이 장치는 ECoG 및 깊이 와이어 전극을 커넥터 모듈
3D 인쇄 보호 쉘			쉘의 질감은 폴리락틱이며 쉘은 집에서 만든 것으로 베이스, 벽 및 캡의 세 부분으로 구성됩니다. 벽은 패러데이 케이지로 구성하기 위해 구리 테이퍼로 덮여
텅스텐 와이어 (직경 : 50mm)	California Fine Wires Company		피질 LFP 기록용 전극
스테인레스 스틸 나사 (직경 : 0.6 mm)			ECoG 기록 용 전극
전기 두개골 드릴	RWD Life Science
드릴 비트 (직경: 0.5 mm)	RWD 생명 과학		드릴은 ECoG 나사의 구멍을 드릴링하는 데 사용됩니다
드릴 비트 (직경: 0.2 mm)	RWD 생명 과학		드릴은 깊이 와이어의 구멍을 드릴링하는 데 사용됩니다
치과 아릴 파우더	SNC 치과
아릴 액체	SNC 치과
파라핀	Fisher Scientific		이 혼합물은 마이크로 와이어 어레이의 다음 움직임을 보장하기 위해 개두술을 밀봉하는 데 사용됩니다.
미네랄 오일	피셔 사이언티픽
전기 응고기	Bovie medical Corporation
RHD2132 앰프 보드	Intan Technologies		32채널 헤드스테이지
RHD2000 시스템 Intan	Technologies		데이터 수집 시스템
적외선 네오디뮴 이트륨 알루미늄 페로브스카이트(Nd:YAP) 레이저 발생기	전자 공학
Matlab R2016b	The MathWorks