이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

백혈구 탈출구 Murine 피부 및 종양 림프 혈관을 통해 측정

8.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58704

⸱

2019년 1월 7일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell, Developmental, & Cancer Biology, Oregon Health and Science University, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health and Science University, 3Department of Dermatology, Oregon Health and Science University, 4Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University

이 논문에서

요약

여기, 우리는 순 진, 염증된에서 백혈구 탈출구의 정량화 vivo에서 악성 murine 피부에 대 한 방법을 보여 줍니다. 두 모델의 머리 비교를 수행 하는 우리: 경 피 FITC 응용과 현장에서 photoconversion. 또한, 피부 종양에서 백혈구 탈출구를 추적 하기 위한 photoconversion 유틸리티를 설명 합니다.

초록

고갈 림프절 주변 조직에서 백혈구 탈출구만 면역 감시 및 시작에 대 한 중요 하지 않습니다 하지만 또한 주변 조직 응답의 해상도에 기여. 다양 한 방법은 비 림프, 주변 조직에서 백혈구 탈출구를 계량 하는 데 사용 됩니다, 세포질이 고 분자 메커니즘을 맞는 탈출구를 제어 하는 불완전 하 게 이해 남아 있다. 여기, 우리는 murine 피부와 종양에서 백혈구 탈출구의 정량 분석에 대 한 현장에서 photoconversion 사용 하 여를 설명합니다. Photoconversion는 직접 라벨 백혈구의 피부 조직 내에서 거주 할 수 있습니다. 보라색 빛에 피부 노출 유도 로컬 하지만 선 동적인 응답 특징 백혈구 침투와 혈관 시키는 형광 추적기의 경 피 응용 프로그램 머리 비교에서 photoconversion 특히 철새 수지상 세포 인구를 분류 하 고 동시에 피부 microenvironments 및 종양에서 골수성과 림프 탈출구의 정량화를 사용. 백혈구 탈출구의 메커니즘 intratumoral 백혈구 복잡성에 대 한 우리의 이해에 누락 된 구성 요소를 유지 고 따라서 여기에 설명 된 도구 응용 프로그램 제공할 것 이다 종양의 역학에 대 한 독특한 통찰력 모두 면역 microenvironments 안정 된 상태와 치료에 대 한 응답에서

서론

주변 조직 면역 반응 염증의 사이트에 백혈구 신규 모집에 의해 뿐만 아니라 그들의 후속 보존 규제 메커니즘에 의해 형성 된다. 따라서, 보호 면역 체류 시간, 또는 오히려 림프 혈관을 통해 말 초 조직에서 마이그레이션합니다는 백혈구 입력 여부를 결정 하는 누적 세포 및 분자 메커니즘에 의해 결정 됩니다. 중요 한 것은, 백혈구 림프 혈관 (탈출구 되 나)을 통해 조직의 종료에 대 한 성향은 그들의 특수 기능에 연결 된다. 수지상 세포 (DC) 취득 성숙 신호 항 전송 및 배출 림프절 (dLN), 적응 면역1에 필요한 프로세스에서 프레 젠 테이 션에 대 한 응답에서 철새 행동. 청소 골수성 세포, 대 식 세포와 호 중구, 식 균 작용을 통해 apoptotic 파편을 취소를 제공 합니다. 세균 감염 시 호 중구 탈출구 조직 및 궁극적으로 apoptosis와 DSS 유도 colitis의 모델 dLNs2 에서 받게, 데이터 지원 macrophage 탈출구는 지역의 염증3를 해결 하는 데 필요한 가설. 그러나 Neutrophil 및 대 식 세포 출구 모든 염증 상황에서 발생 하는 여부, 불명 하다. 정상 상태4,5,,67,8감염된 및 염증된4,,910, 에서 T 림프 구 출구에 대 한 증거 11,12 주변, 비 림프 조직은 T 세포는 활발히 recirculate, 조직 기반 신호 운전이 출구를 제대로 이해 남아 있지만 나타냅니다. 여러 연구 결과 확인 21 (CCL21)와 그것의 수용 체 CCR74,11, chemokine (C C 모티브) 리간드를 포함 하 여 신호 배출 림프 모 세관 쪽으로 방향 마이그레이션에 필요한 후속 탈출구 13, 12 (CXCL12) chemokine (C X C 모티브) ligand 수용 체 CXCR42,14및 sphingosine 1 인산 염 (S1P)10,,1516. 그러나, 이러한 메커니즘은 모든 컨텍스트에서 활성 그리고 미결 문제에 남아 있다 여부 그들은 모든 종류의 세포 출구 결정. 중요 한 것은, 더 출구와 질병에서 기능적인 관련성을 제어 하는 메커니즘에 대 한 통찰력 필요 양적 vivo에서 분석의 방법을 합니다.

여러 가지 방법은 출구 여러 동물 모델에 vivo에 직접 cannulation 림프 혈관의 입양 전송 ex vivo 라는 백혈구, 형광 추적기의 경 피 응용 프로그램을 포함 하 여 계량 하는 데 사용 되었습니다. 레이블이 지정 된 입자, 그리고 photoconversion17,18 vivo에서 주입 구심 마우스 림프 혈관의 직접 cannulation 어렵고 작은 동물에서 수집 될 수 있는 액체의 양에 의해 제한 이다. 따라서, cannulation 크게 큰 동물에서 수행 되었습니다 (예., 양) 수술 조작 등은 실용적. 이러한 연구는 림프10,,1920에 림프 및 골수성 세포의 존재에 대 한 직접 증거를 제공합니다. 또한, 양 모델 공개는 급성 및 만성 염증 림프에 림프 구 존재 거의 10010,21증가.

중요 한 것은 분류 하 고 유전자 조작 세포의 입양 전송 공개 하 고 CCR7는 CD4의 탈출구 필요 심하게 염증이 피부5,11, 림프 톨의 전처리 하는 동안+ T 세포 작은 분자 S1P 수용 체 길 항 제, FTY720, 부분적 으로만 그들의 출구10를 억제. 흥미롭게도, 만성 염증이 피부에서 전송 된 림프 톨의 출구 CCR7 독립적인10, 이지만 부분적으로 CXCR49필요할 수 있습니다. 그러나 입양 전송 실험,, 제공 비 생리 적인 수 전 비보 의 활성화 및 레이블이 세포 주입, 조직 및 높은 중간 유체 압력의 biomechanical 환경 변경 통해 조직으로 그 초기 림프 모 세관 열고22그들의 전송 속성 변경 합니다. Fluorescein isothiocyanate (FITC) 피부 irritants의 유무에 한 대안, 경 피 응용 프로그램으로 (예., 틸 프 탈 레이트, DBP) 또는 감염23,24 의 추적에 대 한 수 추적 프로그램을 축적 하 고 dLNs를 마이그레이션할 phagocytic 세포. 마찬가지로, 붙일 레이블된 종양 종양 소재25잠겼습니다 있다 phagocytic 세포를 추적 하는 수단을 제공 합니다. 이러한 메서드는 DC 출구13,14,17,,2627 지배 하지만 비 phagocytic 추적할 수 있습니다 메커니즘에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 림프 톨 그리고, 해석 성 FITC 따라서 철새, 라벨 LN 거주 Dc의 무료 림프 배수 하 여 복잡 한 수 있습니다.

또는, intravital 현미경 실시간으로,2829순수 관련 백혈구 인구의 비보에 추적을 허용 하는 강력한 도구입니다. 함께 사용 기자 마우스 및 생체 내에서 항 체 기반 immunofluorescent이 라벨, intravital 현미경 복잡 한 공간을 계시 했다 및 면역의 일시적인 역동성 셀 밀매, 포함 중간 마이그레이션30 , 림프 endothelium, 림프 루멘 및 마이그레이션 LN 항목28,31시 내 통로 환생. Intravital 이미징 기술의 광범위 한 채택 비용, 설정, 위해 필요한 전문 기술에 의해 제한 하 고 여러 세포 유형 측정 처리량 제한. 아직도, 인구 역학을 분석 하는 양적 방법 커플링 intravital 이미징 조직 것입니다 통찰력을 제공 추가 하 고 중요 한 기계 운동 성 및 마이그레이션 그리고 림프 모 세관 내에서 메커니즘에 관하여 18 , 31 , 32.

따라서, vivo에서 photoconversion 나왔다 제자리에 라벨, 허용 하는 방법으로 생리 적 백혈구 출구 (함께 사용할 경우 cytometry)의 정량화 및 phagocytic 활동의 독립은 부재 또는 도전의 존재입니다. 단풍나무-Tg 마우스 constitutively 후 레스터 변환 빨간색 형광 (빨강 단풍나무)33보라색 빛에 노출 될 때까지 녹색 형광 (가 그린)를 전시 하는 돌 산호에서 고립 된 단백질을 표현 한다. 그들은 주변 조직 사이트에서 탈출구로 Photoconverted 세포를 추적할 수 있습니다 dLNs에 축적. 이것 및 다른 유사한 photoconvertible 마우스 모델34,35 피부36에서 규정 하는 T 세포의 제정 탈출구, Peyer의 패치37에서에서 CXCR4 종속 B 세포 출구를 포함 하 여 중요 한 생물학을 계시 했다 , 펩 티 드 다시 도전38, 그리고 종양 microenvironments39에서 광범위 한 백혈구 송신 시 상주 메모리 T 세포의 동원. 여기, 우리는 피부 염증 및 photoconvertible 메서드를 사용 하면 기존 데이터의 직접적인 비교에 대 한 있도록 감염의 맥락에서 경 피 FITC 응용 프로그램 photoconversion의 머리 비교를 수행 합니다. 또한, 우리 이식된 종양에서 photoconversion를 설명 하 고 변환 효율 및 종양 microenvironments에서 선택적 탈출구를 기술 한다. 따라서, 우리는 더 이러한 방법의 응용 프로그램 필요 백혈구 출구 intratumoral 백혈구 복잡성, 항 종양 면역, 해석에 대 한 중요 한 영향을 미칠 것 이다, 종양에서의 중요 한 생물학을 명료 하 주장 하 고 치료에 응답입니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 동물 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 오 레 곤 건강 & 과학 대학에 의해 승인 되었습니다가지고.

1. 염증 및 마우스 Pinna의 FITC 그림의 유도

  1. 층 류 흐름 후드에서 C57Bl/6 마우스 증발된 isofluorane를 사용 하 여 anesthetize (3-5 %isofluorane 유발 하 고 1-3 %isofluorane;에서 0.5-1.0에서 산소 유량 L/분). 페달 반사의 손실 모니터링 하 여 적절 한 anesthetization를 위해 무의식적인 움직임과 감소 호흡 속도.
  2. 귀 위쪽으로 향하게 하는 복 부 측으로 편평 하다. 피펫으로 20 µ L 5 %FITC 솔루션의 귀 pinna의 복 부 측에 1:1 아세톤: 틸 프 탈 레이트 (DBP)에 녹아. 몇 초 동안 말리에 귀를 하실 수 있습니다.
  3. FITC 신청 후 24 시간 이산화탄소 노출 뒤에 자 궁 경부 전위를 통해 마우스를 안락사. 가 위를 사용 하 여 머리에서 귀를 구분 하 여 PBS에 귀 pinnae를 수집 합니다. 자 궁 경부 dLNs와 사 타 구니 비 배수 LNs는 LNs 주위 조직에서 분리를 핀셋을 사용 하 여 PBS에 수집 합니다. 사 타 구니 비 배수 LNs FITC+/Kaede 빨간+ 백혈구의 존재에 대 한 부정적인 컨트롤 될 것입니다. 기관 프로토콜 당 시체의 처분.
    참고: 분석을 위한 최적의 시간 게시물 photoconversion 세포 유형 및 알려진된 철새 동작에 따라 달라 집니다. 수지상 세포, 예를 들어 6 h 게시물 DBP 응용 프로그램으로 이른 dLNs에서 검색할 수 있습니다.

2. 염증 및 마우스 Pinna의 Photoconversion의 유도

  1. 층 류 두건에서 80 mg/kg 케 타 민 및 염 분에 녹아 10 mg/kg xylazine의 복 주사가-Tg 마우스 (C57Bl/6 배경) anesthetize. 1.1 단계에에서 설명 된 대로 적절 한 anesthetization를 확인 합니다.
  2. 귀 위쪽으로 향하게 하는 복 부 측으로 편평 하다. 피펫으로 20 µ L 귀 pinna의 복 부 측에 1:1 아세톤: DBP의. 몇 초 동안 말리에 귀를 하실 수 있습니다.
  3. DBP 신청 후 알루미늄 호 일의 조각에 슬릿을 절단 하 고 보라색 광원에 귀를 노출 하는 슬릿을 통해 귀를 당겨. 등 쪽 면이 위쪽으로 양면 테이프를 사용 하 여 호 일에 귀를 보호 귀를 평평 하다.
  4. 3 분 100 mW 전력에서 405 nm 광원을 사용 하 여 직접 광원, photoconvert 아래 귀 위치.
  5. photoconversion, 후 24 h가-Tg 마우스를 안락사 고 1.3 단계에서에서 설명한 대로 귀 pinnae, 자 궁 경부 LNs, 사 타 구니 LNs를 수확.
    참고: 1.3 단계에서에서 언급 한 고려 사항 외에도 확산의 속도 결정 분석의 타이밍으로 급속 하 게 세포 분할에서 단풍나무 레드의 손실이 발생 합니다.

3. vaccinia 감염 마우스 Pinna의 FITC 응용 프로그램

  1. 1.1 단계에에서 설명 된 대로 증발된 isofluorane와 C57Bl/6 마우스를 anesthetize.
  2. 이의 복 부 측 평평 하다. 피펫으로 5 x 106 플 라크 형성 단위 (PFU) 귀 pinna에 PBS의 10 µ L에 희석 vaccinia 바이러스 (VacV)의. 29 게이지 바늘을 사용 하 여, pinna 25 번40구멍.
  3. 감염 된 후 24 h, 단계 1.1 그리고 피펫으로 20 µ L 5% 귀 pinna의 복 부 측에 아세톤에 녹아 있는 FITC에서에서 설명한 isofluorane와 VacV에 감염 된 쥐를 anesthetize. 몇 초 동안 말리에 귀를 하실 수 있습니다.
  4. FITC 신청 후 24 시간에서 마우스를 안락사 고 1.3 단계에서에서 설명한 대로 귀 pinnae, 자 궁 경부 LNs 및 사 타 구니 LNs를 수집 합니다.
    참고: FITC DC 다양 한 24 시간 간격으로 매매를 결정 하기 위해 시간 포인트 게시물 감염에 적용할 수 있습니다. 우리는 이전 dLNs에 DC 마이그레이션 하루 1 ~ 3 게시물 감염41에서 비슷한 수준에서 유지 됩니다 보고.

4. vaccinia 감염 마우스 Pinna Photoconversion

  1. 1.1 단계에에서 설명 된 대로 증발된 isofluorane와 단풍나무-Tg 마우스를 anesthetize.
  2. 3.2 단계에에서 설명 된 대로 VacV와 귀 pinna 감염.
  3. 감염 된 후 24 h, anesthetize가 VacV에 감염 된 쥐 단계 2.1에 설명 된 대로 고 2.3-2.4 단계에서 설명한 대로 photoconversion를 수행 합니다.
  4. photoconversion, 후 24 h는 마우스를 안락사 고 1.3 단계에서에서 설명한 대로 귀 pinnae, 자 궁 경부 LNs, 사 타 구니 LNs를 수확.
    참고: 단계 3.4에서 위에서 언급 한, photoconversion 시간 포인트 게시물 감염에서 관리 수 있습니다.

5. 귀 및 림프 노드 Cytometry에 대 한 처리

  1. 단일 셀 정지 귀 pinnae의 만들기: 껍질 떨어져 귀를 1 mg/mL 콜라 D 80 U/mL DNase에서 희석을 포함 하는 24-잘 접시의 우물에 아래로 향하게의 내부는 두 쌍의 족집게와 장소를 사용 하 여 귀 pinna의 복 부와 등 쪽 면 행 크의 버퍼링 식 염 수 솔루션 (HBSS) (캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +포함). 70 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 30 분 보도 소화 조직에 대 한 37 ° C에서 품 어.
  2. LNs에서 단일 셀 정지를 만들기: 1 mg/mL 콜라 D 80 U/mL DNase HBSS에 희석을 포함 하는 24-잘 접시의 우물에서 LNs 장소. 애타게 오픈 림프 노드 두 29 게이지 바늘을 사용 하 여 캡슐을 30 분 동안 37 ° C에서 림프절을 품 어 70 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 소화 조직을 누릅니다.

6. 피부 흑색 종 종양 이식 및 Photoconversion입니다.

  1. 전기 면도기를 사용 하 여 장난-Tg 마우스 뒷면의 센터에서 모피를 면도.
  2. 왼쪽 및 오른쪽 상단 견 사이 뒤쪽의 센터에서 29 게이지 바늘을 놓고 intradermally가-Tg 마우스의 피부에 주입 5 x 105 종양 세포 (식 염 수의 50 µ L에 희석). 종양 (즉, 왼쪽 및 오른쪽 상 완 LNs 종양에 대 한 상단 뒷면 중앙 배치) 지정 된 림프절 림프 배수 되도록 신중 하 게 배치 해야 합니다. DLN 위에 종양이 피부/종양 통해 LNs의 직접 photoconversion에서 발생할 수 있습니다 배치 하지 마십시오.
  3. 원하는 크기 (100-650 m m3) 종양을 허용 합니다.
  4. 2.1에 설명 된 대로 조직 컬렉션 이전 1 일 장난-Tg 마우스 anesthetize 하 고 종양 주변의 모든 새로 regrown 모피를 면도.
  5. 알루미늄 호 일에 원형 구멍을 삭감 하 고 광원을 종양을 노출 하는 종양을 이겨낼. 다시 구멍을 통해 떨어지는에서 종양을 방지 하기 위해 종양 보다 약간 작은 구멍을 삭감 하 고 인접, 비 종양 피부의 변환 최소화 합니다.
  6. 광원 및 5 분 200 mW 전력에서 405 nm 광원을 사용 하 여 photoconvert 바로 아래 종양 위치.
  7. 1.3 단계에서에서 설명한 대로 photoconversion, 후 24 h 쥐 안락사. PBS에는 종양, 상 완 dLNs, 및 사 타 구니 비 배수 LNs를 수집 합니다. 가 위를 사용 하 여 주변 피부에서 종양을 잘라 고 1.3 단계에서에서 설명한 대로 LNs를 제거 합니다.

7. 종양 및 림프절 Cytometry에 대 한 처리

  1. 종양에서 단일 셀 정지를 만들기: 1 mg/mL 콜라 D 80 U/mL DNase HBSS에 희석을 포함 하는 24-잘 접시의 우물으로가 위 종양을 말하다. 70 µ m 나일론 여과기를 통해 1 h. 보도 소화 조직에 대 한 37 ° C에서 품 어.
  2. 5.2 단계에에서 설명 된 대로 림프절의 단일 세포 현 탁 액을 만듭니다.

8입니다. 항 체 Cytometry에 대 한 얼룩

  1. 단일 셀 정지에 조직을 소화, 후 관심의 표식이 있는 셀을 표준 흐름 cytometry 얼룩 기법을 수행 합니다. 간단히, 96 잘 접시에 피펫으로 2 x 106 셀. Fc 블록 (1 µ g/mL) 얼음; 20 분에 대 한 샘플을 품 어 FACs 버퍼 (1% 소 혈 청 알 부 민 PBS에) 두 번 씻어. 라이브/죽은 얼룩 (PBS에 희석) 샘플에 추가 하 고 얼음;에 15 분 동안 품 어 FACs 버퍼 두 번 씻어. 1 차 항 체 (테이블의 재료) 얼음; 30 분 FACs 버퍼에 희석 된 품 어 FACs 버퍼 두 번 씻어.
    참고: 녹색가 고 빨간 형광 FITC와 PE fluorophores;와 겹치는 데 따라서, FITC와 PE 활용 된 항 체는 데 단백질을 함께 사용할 수 없습니다.
  2. 얼룩, 후 교류 cytometer에서 샘플을 실행 합니다. 또는 2% 셀 수정 PFA.

9. 교류 Cytometry 분석

  1. FITC (가 그린)와 PE (빨강 단풍나무) 채널을 70-80%의 전체 범위에 PMT 전압 설정 (약 10에서 인구 센터4)가 그린 비보 전 또는 빨간 단색 splenocytes 또는 혈액을 사용 하 여.
    참고:이 큰 신호 확산에서 발생 장난 (FITC) 녹색과 빨강 단풍나무 (PE) 채널에 대 한 보상 하지 마십시오.
    1. 단색이 컨트롤을 만들려면 장난-Tg 마우스에서 비장 또는 혈액을 수집 합니다. ACK 버퍼, 붉은 혈액 세포를 lyse 다음 셀 두 그룹으로 나누어:가 녹색 및 변환가 빨간색 없이.
    2. 단일 색상가 빨간색 컨트롤 중단 1 mL의 PBS에 셀과 100의 힘에는 405 nm 광원을 사용 하 여 5 분에 대 한 24-잘 접시에 photoconvert mW. 이러한 세포를 사용 하 여 설정 하는 데 녹색 (FITC)와 빨간 PMT 전압 교류 cytometer (단계 9.1)에.
  2. 가 단백질에 대 한 전압을 설정 되 면 단일 fluorophore 보상 구슬 제조 업체의 지시 당 분류를 사용 하 여 다른 모든 기본 항 체 얼룩에 대 한 보상.
  3. 데이터를 수집 하는 교류 cytometer에서 샘플을 실행 합니다.
    참고: 데 단백질 세포에 의해 생산 되 고 지속적으로. 즉 그 24 h photoconversion, 후 변환 된 셀이 녹색에 대 한 두 배 긍정적인 되며 새로 합성된 장난 (녹색)으로 붉은 단풍나무 단백질 셀에 축적 했다.
  4. FlowJo 소프트웨어 또는 비슷한 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

우리는 먼저 photoconversion 결과 효율성을 평가 하 고 결정 마우스 피부에 관련 된 염증에 문학에 발표 된 복제 하고자 했다. 귀 pinna 100 mW 보라색 빛에 노출 되었다 (405 nm) 이전33을 설명 하는 3 분. 단일 셀 정지 모든 CD45의 78% 변환 효율을 공개 노출 다음 즉시 귀 피부 또는 자 궁 경부 dLNs에서 생성 된+ dLNs (그림 1A)에서 변환 된 셀으로 피부에 백혈구 관찰. Photoconversion와 관련 된 염증 반응 평가, 하 우리 계량 CD45 침투의 숫자+ 변환된 귀 0에 24 h 백혈구 변환 (그림 1B) 및 급성 변화에에서 게시 혈관 침투성 측정 의해 마일의 분석 결과42 (

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

주변, 비 림프 조직에서 백혈구 탈출구는 개시 및 면역 반응의 해결에 대 한 중요 한, 탈출구를 제어 하는 분자 메커니즘 이해 가난 하 게 된다. 지식에이 격차는 주로 정량화 비보에 대 한 도구의 준비 가용성 예정 이다. 여기, 우리 photoconvertible 마우스 (단풍나무-Tg) 피부와 종양에서 내 생 백혈구 탈출구를 계량 하 고 염증에 FITC 페인트로 직접 머리 비교를 제공 하 고 감염 모델의 사용을 설명 합니다. 두 모델 모두 생 DC 인구를 추적 하는 동안 FITC와 비 phagocytic 세포에 의해 빈약한 통풍 관의 무료 배수 제한 FITC 골수성과 림프 출구 주변, 비 림프 조직 등에서 광범위 한 분석에 대 한 페인트의 유틸리티 설명 종양입니다. 또한, 우리를 나타내는 종양에서 출구 확률적 결과 제시한 Torcellan 그 외 여러분 확인 보다는 선택적 데이터 제시 39. 종양에서 백혈구 출구 제어 메커니즘의 추가 조사 종양 관련 된...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 충돌이 있다.

감사의 글

저자 박사 마커 스 Bosenberg YUMM 1.1 및 YUMM 1.7 murine 흑색 라인 및 박사 데보라 J. Fowell b 6를 제공 하기 위한 제공 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. RIKEN BRC 통해 국가 바이오-리소스 문 부 과학성, 일본의와 cg Tg(CAG-tdKaede) 15Utr 쥐.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Collagenase DRoche11088866001
DNaseRoche4536282001
광섬유 및 콜림터가 있는 Silver-LED-405B 광원Prizmatix LtdV8144
플루오레세인 이소티오시아네이트 이성질체 ISigma-AldrichF4274
디부틸 프탈레이트Sigma-Aldrich524980
아세톤Macron Fine Chemicals2440-02
29 게이지 주사기Exel International26029
Evans BlueSigma-AldrichE2129
70 um 셀 스트레이너VWR732-2758
파라포름알데히드Sigma-AldrichP6148
HBSSCaissonHBL06
LIVE/DEAD 고정성 아쿠아 데드 셀 스테인 키트InvitrogenL34966
정제 안티 마우스 CD16/CD32Tonbo Biosciences70-0161-M001
BV605 CD11c (클론 N418)Biolegend117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (클론 M5/114.15.2)BD Pharmingen562363
BV421 CD3e (클론 145-2C11)Biolegend100341
APC CD8a (클론 53-6.7)TonBo Biosciences20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (클론 30-F11)Biolegend103116
BV650 CD19 (클론 6D5)Biolegend115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (클론 HK1.4)Biolegend128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (클론 BM8)Biolegend123121
APC-Cy7 Ly6G (클론 1A8)Biolegend127623
BV711 CD11b (클론 M1/70)Biolegend101241
BV605 CD45 (클론 30-F11)Biolegend103155
BV711 CD4 (클론 RM4-5)BD Biosciences563726
소 혈청 알부민 (Fraction V)Fisher ScientificBP1600-100
Anit-Rat 및 Anti-Hamster Igk / 음성 제어 보상 입자 세트BD Biosciences552845
Fortessa 유세포 분석기BD Biosciences
FlowJo v10 소프트웨어FlowJo

참고문헌

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  2. Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139(2015).
  3. D'Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
  4. Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
  5. Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
  6. Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
  7. Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
  8. Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
  9. Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626(2014).
  10. Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
  11. Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
  12. Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
  13. Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
  14. Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
  15. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
  16. Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
  17. Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433(2013).
  18. Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613(2016).
  19. Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
  20. Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
  21. Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
  22. Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
  23. Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
  24. Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
  25. Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
  26. Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
  27. Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
  28. Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
  29. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135(2013).
  30. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
  31. Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
  32. Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253(2011).
  33. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  34. Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
  35. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030(2014).
  36. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  37. Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
  38. Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
  39. Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
  40. Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
  41. Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
  42. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062(2013).
  43. Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
  44. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  45. Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
  46. Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
  47. Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
  48. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  49. Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
  50. Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
  51. Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
  52. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
  53. Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
  54. Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
  55. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  56. Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

광전환 기술유세포 분석Kaede 형질전환 마우스마우스 피부 종양Collagenase D 소화405 나노미터 광원단일 세포 현탁액배출 림프절
백혈구 탈출구 Murine 피부 및 종양 림프 혈관을 통해 측정
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.