여기 우리는 다중 형광 immunohistochemical 얼룩 및 여러 암 관련 항 림프 종에서의 동시 지역화에 대 한 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 모든 조직 섹션에서 생체의 colocalization 분석을 확장할 수 있습니다.
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방법 논문
멀티플렉스 형광 Immunohistochemical 얼룩, 이미징, 및 림프 종 조직학 샘플 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Immunohistochemical (IHC) 방법 가벼운 현미경 검사 법에 의해 단백질 표정에 현장 분석에 대 한 연구와 진단 목적을 위한 강력한 도구입니다. 그러나, 시각화 및 정량화 기존의 비 IHC를 사용 하 여 단일 조직 섹션에서 여러 개의 항 원에의 도전 이다. 멀티플렉스 이미징 관계가 특히 림프 종 연구와 진단, 마커 복잡 한 종양 microenvironment의 맥락에서 해석 될 수 있다. 여기 우리는 멀티플렉스 형광 IHC 림프 종에 대 한 관심의 특정 세포 유형에 여러 대상의 양적 평가 있도록 얼룩에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 방법 측면 커버 유효성 검사 항 체, 항 체 최적화, 림프의 표식이 있는 멀티플렉스 최적화, 데이터 분석, 특정 뒤 조직 microarray (TMA) 슬라이드 및 슬라이드, 스캔의 얼룩 림프 종 참조. 이 메서드를 사용 하 여 모두 관심과 백분율 양성의 감 적의 평균 강도 대 한 점수는 정량 분석을 더 촉진 하기 위하여 생성 됩니다. 멀티플렉싱 샘플 사용률을 최소화 하 고 각 표식에 대 한 관심의 공간 정보를 제공 합니다.
서론
림프 신생 세포의 억제 되지 않는 악성 확산에 의해 발생 합니다. 이 세포 면역 시스템의 중요 한 구성 요소 이며, 골 수, 림프절, 비장, 및 다른 점 막 관련 림프 시스템 등 기본 2 차 면역 기관에 지역화. 림프 신생 형태학, immunophenotype, 유전자 기능 및 임상 프레 젠 테이 션을 포함 하 여 특징의 별자리에 따라 분류는 누가 장애의 다른 유형의 그룹입니다. 각 매개 변수는 역할을, 하는 동안 혈통 정의 기능을 유지 하 고 인식 하는 B 세포, T 세포 및 자연적인 살인자 (NK) 세포1에서 파생 된 신생 WHO 분류 시스템에 대 한 기초를 형성.
림프 종의 분류에 키 림프 톨2의 다양 한 하위의 백혈구 표면 표식에 대 한 항 체의 특성화 되었습니다. Immunohistochemistry (IHC) 전통적으로 이러한 마커 분석에 사용 되었습니다과 가벼운 현미경 통해 구상 될 수 있다 세포 및 조직 기반 분자 검출에 특정 항 원-항 체 인식의 원리에 따라 그러나 3. 기존의 밝은 필드 비 멀티플렉스 IHC에서 단일 슬라이드에 여러 목표물의 식별 한계가 있기 때문에 그것은 종종 단일 조직 섹션에 여....
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프로토콜
이 프로토콜에서 사용 하는 모든 조직 싱가포르 NHG 도메인 특정 검토 보드 B에서 가져온 2014/00693 공부.
1. 선택과 항 체의 유효성 검사
참고: 어떤 멀티플렉스 패널의 설립을 계속 하기 전에 모든 항 체 얼룩이 튼튼하게, 관심의 대상 항만 식별 해야 합니다. 목표는 구체적으로 조직 단면도의 항 원 인식 하는 항 체를 선택 하는.
- 잘 설립 연구 사용, 또는 임상 사용 IHC에서 항 체에 대 한 긍정적이 고 부정적인 제어 조직에 기존의 IHC5,13 를 수행 하 여 epitope 검색 및 항 체 희석 등 조건 확인 섹션입니다. 인간 근원의 조직 단면도, 실험 시작 전에 장소에 적절 한 윤리 클리어런스는 확인 합니다.
참고: 긍정적인 통제는 관심사의 항 원을 표현 하는 것으로 예상 된다 조직 그리고 부정적인 컨트롤 하지 않는. B 세포 등 면역 세포, T 세포 항 원 선물 세포 뿐만 아니라 실질과 상피 세포의 혼합물을 포함 하기 때문에 양성 편도 선 조직 림프 종 항 원에 대 한 좋은 조직 제어로 선택 된다. 후자의 역할을 유용한 부정적인 내부 제어 합니다.....
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결과
mf IHC BCL2 유전자 재배열 (더블 히트 림프 종)와 C-MYC DLBCL 샘플에 대 한 이미지는 그림 1에 표시 됩니다. 그림 2 에서는 시뮬레이션된 밝은 필드 immunohistochemical 이미지를 보여 줍니다. 그림 3 백분율 데이터의 생성을 나타냅니다. 그림 4 는 숫자 데이터의 생성에 대 한 중간 공식의 세부 정보를 표시합니다. 그림 5 angioimmunoblastic T-세포 림프 종에서 T-셀 패널의 mf IHC의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 그림 6 편도 선 컨트롤 샘플 및이 샘플에 대 한 데이터 분석의 최적화 이미지를 보여.......
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토론
mf IHC 병리학 림프 병 리에 diagnosticcriteria를 수정 하 고 임상 결과의 예측으로 특정 세포 유형에서 바이오 마커의 역할 분석을 사용 하도록 가능성이 있다. 새로운 연구 방법으로 mf IHC 점점 종양 세포17의 여러 면역 매개의 양적 및 공간 확인에 적용 됩니다. 종양 마커의 공동 식 mf IHC의 검출 재현성 및 신뢰성5표시 되었습니다. 그러나, 기술은 초기와 시 약 및 조직 고정 및 처리에 불일치 때문에 그들에 같은 조직 관련 요인에서 발생 하는 변화를 복종 남아 있습니다.
기술에 중요 한 특정, 잘 검증 된 항 체 사용 하는 민감하고 재현 가능한 결과 제공. 원래 그들의 항 원에 대 한 구체적 설명 및 나중 시연 노크 아웃 모델14사용 없는 단백질을 인식 하는 항 체의 문학에서 예입니다. 어떤 야생-타입에 노크 아웃 / 눕 .......
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공개 사항
A.D.J.는 사용자 그룹 회의에 여행으로 퍼 킨 엘머에서 자금 지원을 받고 있다. 저자는 공개 다른 충돌의 관심을가지고.
감사의 글
S. B.N. 및 A.D.J. 싱가포르의 보건의 국립 의학 연구 위원회 전환 어워드 (NMRC/TA/0020/2013 NMRC/TA/0052/2016)에 의해 지원 됩니다. 저자는 싱가포르 국립 대학 암 연구소의 Vectra 스펙트럼 영상 현미경의 구입으로에서 A.D.J.에 용 Siew 윤 연구 그랜트를 인정합니다. 이 연구는 싱가포르 NHG 도메인 특정 검토 보드 B에 의해 승인 (2014/00693).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 항체 희석제 | DAKO | REF S3022 | 차단 |
| 과산화효소 차단 용액 | DAKO | S2023 | 과산화물 차단용 |
| Vectra 다중 스펙트럼 자동 현미경 | Perkin Elmer | Vectra2.0.8 | 스펙트럼 이미징 |
| 절대 에탄올 | EMSURE | 1.00983.2500 | 재수화용 에틸 알코올 |
| 증폭 희석제 | PERKIN ELMER | FP1135 | 형광단 희석제 완충액 |
| 안티 마우스 IgG [염소] HRP 표지 | PERKIN ELMER | NEF822001EA | 2차 항체 |
| Anti-Rabbit IgG [염소] HRP 표지 | PERKIN ELMER | NEF812001EA | 2차 항체 |
| BCL2 | DAKO | 클론 124 (로트 번호 20031561)(RRID-AB578693) | 1차 항체 |
| BCL6 | LEICA | NCL-L-BCL6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) | 1차 항체 |
| CD20 | DAKO | Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) | 1차 항체 |
| c-MYC | ABCAM | Y 69 클론 ab32072 (Lot No. GR29511133)(RRID-AB731658) | 일차 항체 |
| Cy 5 | PERKIN | ELMER FP1171 | 적절한 티라미드 기반 형광 시약 |
| Graphpad Prism 7 | Graph pad | Statisitcal software | |
| HistoClear Clearing Agent | SIGMA | H2779-1L | Histoclear for dewaxing and clearing |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | Inform Software 2.2.1 | 데이터 분석 소프트웨어 |
| KI67 | DAKO | Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) | 1차 항체 |
| KOS MILESTONE 다기능 조직 처리기 | Milestone | Microwave for Heat induced epitope retrieval | |
| PANASONIC | NN-ST651M | 마이크로파 스트리핑 | |
| Mowiol | SIGMA ALDRICH | 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 | 장착 매체 |
| 오팔 570 | PERKIN ELMER | FP1488 | 적절한 티라미드 기반 형광 시약 |
| Opal520 | PERKIN ELMER | FP1487B21 | 적절한 티라미드 기반 형광 시약 |
| Opal540 | PERKIN ELMER | FP1494 | 적절한 티라미드 기반 형광 시약 |
| Opal620 | PERKIN | ELMER FP1495 | 적절한 티라미드 기반 형광 시약 |
| Poly-L-lysine 코팅 슬라이드 | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | 일상적인 조직학적 사용에서 조직 단면 접착을 위한 슬라이드 |
| Spectral DAPI | PERKIN ELMER | FP1490 | 핵산 염색 |
| 타겟 검색 솔루션, pH9.0(10x) | DAKO | S2367 | HIER |
| Tris Buffer Saline (TBS) | 1st BASE | BUF3030 20X4L | buffer 워시 |
| 트윈 20 | SIGMA ALDRICH | P1379-1 L | 트윈 |
참고문헌
- Swerdlow, S. H., et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , Revised Fourth Edition, Stylus Pub LIc. (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. <....
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재인쇄 및 허가
