3D 인쇄에 대 한 새로운 과정 Decellularized 행렬

요약

이 프로토콜의 구조 조직 구조 엔지니어링 3D 인쇄를 decellularized 행렬 (DM)를 포함 하는 임베디드 polylactic 산 (PLA) 스피어와 polycaprolactone (PCL) 필 라 멘 트의 생산을 설명 합니다.

초록

3D bioprinting 사용자 정의 건설 기계는 생물학적으로 활성화 되며 원하는 크기 및 형상을 만드는 것을 목표로. 생물 학적 요원 원래 조직 reconstitute 그들의 이동, 확산, 그리고 차별화 선도 조상 세포, 작곡 단서 제공 열가 소성 백본 기본 조직에 유사한 기계적 안정성을 제공할 수 있습니다 / 장기^1,2. 불행히도, 많은 3D 인쇄 호환, bioresorbable 고분자 (polylactic 산, PLA) 등 210 ° C의 온도에서 인쇄 또는 높은-온도 인터 루 킨에 해로운. 다른 한편으로, polycaprolactone (PCL), 폴 리 에스테 르의 다른 종류는 bioresorbable, gentler 인쇄 온도 65 ° c.의 3D 인쇄 자료 따라서, 가상 했다 decellularized 세포 외 매트릭스 (DM) 열 보호벽 PLA에 포함 된 PCL 필 라 멘 트 내에서 인쇄할 수 및 그것의 기능 형태에 남아. 이 작품에서는, osteochondral 복구 가설을 테스트 하는 응용 프로그램을 했다. 이와 같이, 돼지 연골 decellularized 고 3D 구문을 통해 됐 증 착 모델링 생산 하 필 라 멘 트로 polycaprolactone (PCL)와 다음 압출 했다 polylactic 산 (PLA) 스피어에 캡슐화. 구조는 스피어의 유무에 관계 없이 (PLA-DM/PCL와 PCL(-), 각각) 표면 기능에서 차이 대 한 평가 했다.

서론

뼈, 연골, 힘 줄, 인 대 재건 등 임상 응용 프로그램에 대 한 현재 조직 공학 기술을 사용 하 여 자동-이식 손상 된 조직을 복구 하. 이러한 기술 각각을에서 수행 됩니다 정기적으로 "금 표준"으로 임상 연습으로 먼저 기증자 조직 환자 또는 일치 하는 시체에서 수확 후 기증자 조직 결함 사이트²에. 그러나, 이러한 전략은 기증자 사이트 사망률, 기증자 사이트 부족 큰 결함, 감염, 그리고 어려움 원하는 형상을 일치 하는 이식의 위험에 의해 제한 됩니다. 또한, 연구 재건을 위해 사용 하는 이식 기계 및 생물 학적 속성 기본 조직³에 비해 감소 했다 나타났습니다. 염두에 두고 이러한 고려 하 여 조직 엔지니어 최근을 아닙니다 생산을 생물학적으로 활성 결함 크기와 모양 제공 하면서 충분 한 수용 하도록 설계 된 사용자 지정, 복잡 한 형상의 3 차원 (3D) bioprinting 기계적 생물 학적 개장 완료 될 때까지 속성입니다.

이상적으로, 3D 인쇄 비 계 이루어져 있을 것입니다 통합된 biologics 세포, 그들의 이동, 확산에 지도 주변에 생 화 확 적인 신호를 제공 하는 동안 네이티브 조직의 필요한 기계적 안정성을 유지할 수 있는 고분자 백본 차별....

프로토콜

1. 고 스피어 전처리

1. 원하는 매트릭스와 생산 스피어 캡슐화 (PLA-DM)².
   참고: 균일 한 크기의는 스피어는 필수적 이다. 이러한 이유로, 체질 스피어 이전 사용에 필수적 이다. 매트릭스 decellularization 및 캡슐화 이전 간행물²상세한 되었습니다 있지만 프로세스의 간략 한 요약 다음과 같습니다.
   1. 첫째, 돼지 뒷 다리 사지에서 연골 플러그 수확. 0.05 %trypsin / 0.5 m m tetrasodium ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 세척의 시리즈에서 연골을 decellularize, Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM), 그리고 1.5% 초 산 2.0 %4 h 각 증류수 세척에 대 한 Triton X-100 ²각 단계 전후.
   2. Decellularized 매트릭스, 동결, lyophilize, 갈기, 배수와 펩 신 솔루션으로 해산. 해산, 다음 dichloromethane에 해산 되었습니다 PLA 펩 신 솔루션 믹스.
   3. 물 솔루션에서 3% 폴 리 비닐 알코올에 dropwise 혼합물을 추가 합니다. Centrifuge 결과 스....

결과

체질, 후 스피어 유니폼 표시 하 고 집계에서 무료로 해야 합니다. SEM, 아래 체질된 스피어 그들의 표면에 작은 숨 구멍을 있을 수 있습니다 하지만 그렇지 않으면 되며 구형 부드러운, 그림 1에서 보듯이. 모든 압출 된 필 라 멘 트 균일 한 직경의 원형 단면 이어야 한다. 필 라 멘 트 스피어 (PLA-DM/PCL)를 포함 하는 약간 더 매트는 PCL 전용 동안 마무리 해야한다 (PCL(-)) 필 라 멘 트 더 광택 보이는 것 이다. PLA-DM/PCL 필 라 멘 트 또한 PCL(-) 필 라 멘 트 보다 터치 coarser 느낄 것 이다. 건설 기계 4.1 단계에서 소프트웨어에 의해 쓰게 했다 원하는 형상을 인쇄 되어야 한다. 반복 하 고 다른 한 인쇄에서 균일 한 비 계 품질 및 모양 이어야 한다. 인쇄, 후 건설 기계와 스피어 없이 거시적, 구별 하기 어려울 것입니다 하지만 SEM, 아래 스피어와 구문을 통해.......

토론

두 행렬을 decellularized 하 고 3D 인쇄 PCL 건설 기계는 독립적으로 접착 및 osteochondral에 대 한 그들의 사용의 유효성을 검사 하는 셀의 확산 복구^10,,1112수 있도록 하지 표시 되었습니다. 조직 복구 엔지니어링 접근에서 decellularized 매트릭스를 사용 하 여 많은 관심과 최근^2,3,,1415과거에 성공의 주제 되었습니다. 우리는 이전 증가 마이그레이션, 접착, 확산, 및 전반적인 유지 보수 결과 조직의 전통적인 기법^2,,.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
체 기계	Haver & Boecker Tyler	Ro-Tap RX 29-E Pure
Sieve 90 um	Fisherbrand	170328156	No. 170
Sieve 53 um	Fisherbrand	162513588	No. 270
Sieve 106 um	Fisherbrand	162018121	No. 140
Sputter coater	Leica	n/a
주사전자현미경	Hitachi, USA	n/a
Filabot EX2	Filabot.com	FB00061
Filabot 스풀러	Filabot.com	FB00073
CAPA 6506	Perstorp	24980-41-4
인산염 완충 식염수, PBS	Gibco	10010023
6" 팬	컴포트 존, 아마존	n/a
초음파 수조	Cole Parmer	SK-08895-13
Dreamer	FlashForge	드럼
믹서	맞춤 제작	n/a	유사한 장비: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no& gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE
Micro Balance	Mettler Toledo, Fisher Scientific	01-913-851
Simplify3D	Simplify3D	해당 없음
솔리드 웍스	해당	없음
마이크로 스피어	사내에서 생산, 동시 참조 제출된 JoVE 제출
p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate	Millipore	4876-5GM
Phosphatase, alkaline	Roche Diagnostics GmbH	10 713 023 001
흡광도 리더	Tecan	Sunrise
Tris-HCl Buffer	Sigma-Aldrich	T6455-100ML
가열식 쉐이커	New 브런즈윅 사이언티픽	엑셀라 E24