낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

요약

우리는 인간의 세포의 proteomic 서명을 macrophage 분극에 낮은 산소 환경 영향의 결정에이 적용 하는 프로토콜을 제시.

초록

대 식 세포는 타고 난 면역 세포 조직의 항상성 전염 성 병원 균에 대 한 응답에서 배열 하는 생리 기능 수에 관련 된. 이러한 셀의 다양 한 기능 활성화 상태로 또한 양극 화 라는 관련이 있습니다. 이러한 다양 한 분극의 정확한 분자 설명 대 식 세포 생물학의 분야에서 우선 순위입니다. 그것은 현재 다차원 접근은 분극 환경 신호에 의해 제어 되는 방법을 설명 하는 데 필요한 인정 했다. 이 보고서에서 우리는 인간의 세포에 다양 한 분극의 proteomic 서명을 얻기 위해 설계 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 대 식 세포 단백질 표정에-젤 분류 한 내용과 리스 C/트립 신-소화 세포 세포의 용 해에서 얻은의 레이블 없는 정량화를 기반으로 합니다. 우리는 또한 프로토콜 기반 솔루션에서 소화 하 고 전자 안으로 사용 하는 분류를 초점을 제공 합니다. 산소 농도 조직에 관련 된 환경 매개 변수, 때문에 우리는 어떻게 대기 구성 탐험이 프로토콜을 사용 또는 저 산소 환경에 영향을 미치는 macrophage 분극의 분류.

서론

대 식 세포는 여러 전염 성 병원 균에 대 한 응답에서 조직의 항상성, apoptotic 세포의 제거를 포함 하 여, 세포 외 기질¹의 리 모델링에 이르기까지 생리 기능에 타고 난 면역 세포. 이 세포는 강한 phenotypic가 소성² 분극 라고도 하는 많은 가능한 활성화 상태를 변환 하는 특징. 이러한 다양 한 분극의 정확한 분자 설명 대 식 세포 생물학³의 분야에서 우선 순위입니다. 그것은 소위 M1/M2 이분법, 있는 m 1 프로-염증 성 나타내고 M2 염증 세포를 사용 하 여 이러한 분극 분류 제안 되었습니다. 이 모델은 급성 감염, 알레르기, 비만⁴같은 다양 한 병 적인 상황에 잘 맞는. 그러나, 만성 염증된 조직 및 암, 그것은 증명 되었습니다이 분류는 대 식 세포 특정 세포 환경^5,6, 에서 제공 하는 광범위 한 phenotypic 레 퍼 토리를 파악 수 없습니다. ⁷. 현재 일치는 대 식 세포 양극 화 더 나은 설명 다차원 모델을 사용 하 여 특정 microenvironmental 신호⁸을 통합 하는. 이 결론은 M1/M2 모델은 획득된 분극⁹에 비효율적 보여주는 인간 대 식 세포의 transcriptomic 분석을 통해 확인 됐다.

연구를 인간의 세포에 다양 한 분극의 proteomic 서명 프로토콜을 제공 하는 것을 목표로 제시. 우리는 다양 한 산소 레벨의 환경에 인간의 세포를 분화 하 고 레이블 없는 정량화를 수행 하기 위해 전체 대 식 세포 프로테옴에서 펩 티 드를 얻을 하는 방법을 설명 합니다. 이 정량화 다양 한 단백질의 표현 레벨의 비교를 허용 한다. 줄기 세포에 대 한 연구 환경 키 매개 변수¹⁰으로 산소의 중요성을 계시 했다, 우리는이 조직 매개 변수 인 간에 있는 대 식 세포 분극 영향을 미칠 수 어떻게 이해를 추구 합니다. 산소의 부분 압력에서에서 발견 되었습니다 범위 3 (총 대기 압력)의 20% ~ 20% (정확한 값은 약 18.6% 물의 존재 하면서 세포 문화 인큐베이터에서 일반적으로 사용 되는 약 해당 인체 에 계정).

이전 작품과 형태학의 조회¹¹ 지점과 이러한 차이 아마 부분적으로는 그들은 노출된¹²다른 산소 수준 때문에 치경 다 기능에서 중간 세포를 보이고 있다. 또한, 골 수 유래 세포 박테리아¹²낮은 산소 환경 노출 되 면 phagocytize를 증가 능력을 보여줍니다. 인간의 세포 THP1 차별화 된¹³, 반대의 효과가 발견 되었습니다 있지만 이러한 결과 산소 대 식 세포 생물학의 레 귤 레이 터는 고 인간의 세포에 분자 수준에서이 역할을 명확히 하는 데 필요한 아이디어를 지 원하는. 이전 연구에서 우리는 이러한 문제를 해결 하는 proteomics 접근 방식을 적용 했습니다. 단백질의 수천에 대 한 식 레벨을 동시에 측정 하 여 우리는 분극에 산소의 영향을 강조 하 고 새로운 분자 마커의 목록을 제공. 우리는 또한 일부 세포 기능에 이러한 연구 결과 관련 된 수 있습니다. 특히, 우리는 apoptotic 세포의 식 균 작용의 속도 증가 되었다 IL4/IL13-편광 세포에서 밝혀 proteomic 분석¹⁴ALOX15의 upregulation에 연결 했다 발견. 현재 연구에서 우리는 이러한 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

프로토콜

건강 하 고, 취소 확인 된 기증자 로부터 인간의 혈액 샘플 (LRSC) 인증된 프로토콜 (CODECOH DC-2018-3114)의 일환으로 EFS (프랑스 국가 혈액 서비스)에서 얻은 했다. 기증자는 혈액의 사용에 대 한 서명된 동의 했다.

1. 미디어와 버퍼 준비

1. 대 식 세포 매체 [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x 비 본질적인 아미노산 (NEAA)]를 준비 하 고 37 ° c.에 따뜻한
2. 대 식 세포 매체 + AB 플라즈마 (SAB)에서 10% 인간의 혈 청을 준비, 그것은 (0.22 μ m 필터) 필터 다음 37 ° C에 따뜻한 (macrophage 매체 + 10%로이 SAB).
3. 정렬 버퍼 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) + 0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) + 2 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) x [1]를 준비 하 고, 그것은 (0.22 μ m 필터), 필터링 하 고 4 ° c.에 그것을 유지합니다

2. 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) Leukoreduction 시스템 챔버 (LRSC)에서 격리

1. 밀도 그라데이션 세포 분리 솔루션의 15 mL를 넣어 ( 재료의 표참조) 50 mL에 원심 튜브는 LRSC를 수신 하기 전에 실내 온도 (RT)에 따뜻한 수 있습니다 그래서.
   참고: 밀도 온도에 따라 다릅니다. 이 단계 실시간에 equilibrate 수 있도록 사전에 수행 해야 합니다이 제품을 4 ° C에서 저장으로
2. 50 mL 원심 분리 관으로는 LRSC를 빈 1 x PBS의 최대 50 mL를 추가 하 고 혼합. 아주 천천히, 혼합 밀도 그라데이션 솔루션 2.1 단계 워밍업의 15 mL 위에 2.2 단계 준비의 25 mL를 추가 합니다.
   참고: 수 단계가 단계를 혼합 하지 않도록 주의 하십시오. 혈액이 단계의 어떤 소요도 없이 밀도 그라데이션 솔루션에 추가 되어야 합니다.
3. 휴식 없이 700 x g에 25 분 동안 원심 분리 튜브 두 원심
   참고: 조밀도 기온 변화도 원심 분리의 끝에, 맨 아래쪽에서 레이어는: 적혈구와 granulocytes 펠 릿, 밀도 그라데이션 솔루션 위상, PBMCs, 그리고 플라즈마의 레이어를 형성.
4. 피펫으로와 함께 그것을 발음 하지 않고 플라즈마 단계를 통과 하 고 새로운 50 mL 원심 분리 관으로 PBMC 레이어를 수집 합니다. 세척 단계 및 300 x g에서 10 분 원심 분리기로 서 PBMCs에 1 x PBS의 최대 50 mL를 추가 합니다.
5. 발음은 상쾌한 고 대 식 세포 매체의 40 mL에 펠 릿을 resuspend.

3. 자기 라벨의 및 절연 CD14⁺ 세포 (Monocytes)

1. Malassez 챔버에 PBMCs를 계산 합니다. PBMCs (일반적으로 100 ~ 300 x 10⁶ 셀) 실험 수행에 필요한 금액을 철회, 원심 관, 및 300 x g에서 10 분 원심 분리기에 넣어.
2. 발음은 상쾌한 고 펠 릿 10 당 1.3 단계 준비 정렬 버퍼의 80 µ L에서 resuspend⁷ PBMCs. 추가 20 µ L 10 당 CD14 microbeads의⁷ PBMCs 믹스 잘 하 고 지속적인 동요에서 4 ° C에서 15 분 동안 품 어.
3. 세척 단계 및 300 x g.에서 10 분 원심 분리기는 상쾌한 발음 하 고 펠 릿 당 10⁸ PBMCs 버퍼를 정렬의 500 µ L에서 resuspend 10⁷ PBMCs 당 버퍼를 정렬의 1 mL를 추가 합니다.
4. 자기 필드 구분 기호에서 열을 배치 합니다. 버퍼를 정렬의 3 mL와 함께 그것을 rinsing 하 여 열을 준비 합니다.
5. 열에 세포 현 탁 액을 적용 합니다. 열 격리 되어야 하는 셀의 수에 따라 달라 집니다 (여기, 최대 10⁹ PBMCs LS 열 사용 됩니다). 포함 레이블된 셀 흐름을 통해 수집 합니다.
   참고:이 단계에서 시작, 모든 튜브 (부정과 긍정적인 선택) cytometry에 의해 나중의 다른 단계 검사에 대 한 보관 됩니다.
6. 열 정렬 버퍼의 3 x 3 mL을 씻어. 레이블이 없는 세포 단계의 3.12 같은 튜브를 통해 전달 수집 합니다. 추가 정렬 버퍼에 의해 세척 단계를 수행, 열 건조 하지 않도록 주의 하십시오. 열 컬렉션 튜브를 놓고 구분 기호에서 그것을 제거 합니다.
7. 버퍼 열에 정렬의 5 mL 플라스틱 즉시 단단히 열에 플런저를 추진 하 여 자석으로 레이블이 지정 된 셀에 밖으로 플러시. CD14의 순도 높이기 위해⁺ 두 번째 열에 셀, eluted 분수 농축입니다.
8. 새로운 열 3.4 3.7 단계 반복 합니다.

4입니다. 도금 Monocytes의

1. Malassez 챔버에 monocytes를 계산 합니다. CD14의 순도 확인⁺ cytometry에 의해 세포. Monocytes는 실험에 필요한 금액을 철회 하 고 원심 분리 관에 넣어.
2. 10 분에 300 x g. Aspirate는 상쾌한 centrifuge 고 대 식 세포 매체에 monocyte 펠 릿 resuspend. 셀 접시와 SAB + 25 ng/mL 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 차별화를 유도 하는 것 1 h. 50 분 매체를 발음 하 고 대 식 세포 매체와 + 10%에 대 한 합의 하자.

5입니다. 하루 6 대 식 세포의 양극 화

1. 매체 발음 대 식 세포 매체 + 10% 대체 SAB 다양 한 자극으로. 예를 들어 10 ng/mL 인터페론 감마 (INFγ) + 1 ng/mL lipopolysaccharide M1 양극 화를 (LPS) 또는 20 ng/mL 인터 루 킨 4 (IL4) + 20 ng/mL 인터 루 킨 (IL13) 13 m 2 양극 화에 대 한 추가 합니다.
   참고: 자극 사이 24 및 48 h 다른 테스트를 진행 하기 전에 수행할 수 있습니다.
2. 파견 솔루션 또는 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 수확.

6. 낮은 산소 조건 세포 배양

1. 4 단계에서 starting, monocytes 그리고 대 식 세포 hypoxic 조건 분석을 수행 하는 산소 제어 환경에서 유지 관리 합니다. Hypoxia 작업 역을 사용 하 여 실험 기간 동안 원하는 산소 부분 압력 하에서 세포를 유지 하기 위하여.
   참고: 낮은 산소 압력 하에서 작업 하는 경우 그것은 중요 한 모든 미디어와는 역 아래 세척 버퍼를 준비 하 고 액체에서 올바른 부분 압력을 얻기 위해 충분히 기다릴. 예를 들어 60 mm 페 트리 접시에에서 10 mL PBS의 대략 2 h O₂ 부분 압력 시작 대기 압력에서 (우리 광섬유 산소 센서를 사용 하 여 측정)에 대 한 25 mmHg에 도달 필요 합니다. 많은 hypoxic 역 또는 incubators, 산소 압력 대기압의 백분율로 설정 됩니다. 정확한 측량이 필요한 경우 직접 mmHg에 산소 압력을 설정 하는 권한을 부여 하는 역을 사용 하 여이 낫다.

7. 세포와에서 젤 소화 (프로토콜 1)

참고: 에이 다음 섹션, 펩 티 드를 가져오고 LC-MS/MS 분석을 수행 하는 데 사용 하는 두 개의 프로토콜을 설명 합니다. 세포 세포의 용 해 및 젤에 분류 및 소화, 프로토콜 1 설명 하 고 솔루션에서 소화 및 분류는 전자 초점 메서드를 사용 하 여 솔루션에 셀 세포 프로토콜 2에 설명 합니다.

1. 세포 세포의 용 해 Laemmli 버퍼 [234 mM Tris-HCL (pH 6.8), 7.5 %SDS, 37% 글리세롤, 33.3% (v/v) β-mercaptoethanol, bromophenol 파랑 0.2 %w / v]를 수행 합니다. 4-12% 두번째-트리 스 아크릴 아 미드 젤에 각 샘플에 대 한 300000 셀에 해당 하는 단백질을 로드 합니다.
2. 각 단백질 견본 그림3에서 exemplified 6 젤 대역으로 분할 될 수 있도록 전기 이동 이동의 기간을 제어 합니다.
3. (30% 에탄올 + 7.5% 초 산 20 분), 고정 솔루션 젤 수정 다음 얼룩 솔루션 (R-250 Coomassie 파란 45 분)을 추가 합니다. (30% 에탄올 + 7.5% 아세트산 밴드 표시 될 때까지) destaining 솔루션 추가 단백질 밴드 깨끗 한 메스로 절 개 하기 전에.
4. 주사위 각 500 µ L 튜브에 소개 전에 밴드 excised. 깨끗 한 유리 표면 keratins (이온된 수에 5 %SDS 솔루션 표면 청소를 사용할 수 있습니다)와 오염을 피하기 위하여 보증 된다.
5. 워시 젤 조각 한 워시 25 m m 염화 중 탄산염에 이기 (50 %v / v) 뒤 37 ° C에서 20 분 동안 25 m m 염화 중 탄산염의 200 µ L에서 3 번. 10 분 100% 이기의 200 µ L 젤 조각을 탈수.
6. 각 젤 조각 10 m 55 m m iodoacetamide 25 m m 염화 중 탄산염 (200 µ L)에 실시간에 어둠 속에서 35 분 뒤 56 ° C (200 µ L)에서 45 분 동안 25 m m 염화 중 탄산염에 DTT (dithiothreitol)를 품 어
7. 알을 막으려고 품 어 실시간 세척에서 10 분 동안 25 m m 염화 중 탄산염에서 10 mM DTT의 200 µ L와 각 젤 조각 25 m m 염화 중 탄산염의 200 µ L에서 젤 조각 다음 10 분 동안 100% 이기의 200 µ L로 탈수.
8. 제조업체의 지침에 따라 트립 신/리스-C 믹스와 함께 37 ° C에서 하룻밤 단백질 소화.
9. 추가 하 여 15 분, 다음 15 분 동안 5% 포 름 산의 50 μ에 대 한 50% 이기의 50 μ 그리고 마지막으로, 50 μ 15 분 수영장에 대 한 100% 이기의 젤 조각에서 결과 펩 티 드를 추출 하 고 펩 티 드의 흡착을 제한 하는 낮은 흡수 관에 각 분수를 건조 하 고 샘플 손실입니다. 추가 분석까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.

8. 단백질 추출 및 솔루션에 소화 (프로토콜 2)

1. 다음 세포의 용 해 버퍼의 150 µ L로 세포 세포의 용 해 (2 x 10⁶ 셀)를 수행:
   1. 7 M 요소, 2 M thiourea, 40mm 트리 스, 그리고 4% 챕 스, 프로 테아 제 억제제 (완전 한 미니, EDTA 무료 프로 테아 제 억제 물 칵테일)와 보충.
2. thermoshaker와 RT에 30 분 동안 해결책 균질 20 분 RT 13,800 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 유지.
3. 2D 정리 키트와 오염 물질을 제거:
   1. 키트에는 precipitant 솔루션, 공동 비례적 솔루션, 워시 버퍼, 그리고 세척 첨가제 포함 되어 있습니다.
   2. Precipitant 솔루션의 300 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 15 분 추가 300 µ L 공동 비례적 솔루션의 ice에 품 어. 12000 x g 5 분에서 (적어도) 튜브를 원심. 작은 펠 릿은 표시 되어야 합니다. 빠르게 물의 resuspension 또는 펠 릿의 분산을 피하기 위해 다음 단계를 진행 합니다. 펠 릿을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다.
   3. 다시 뚜껑 경첩 및 펠 렛 튜브의 바닥에 남아 있는 액체를가지고 밖으로 직면 튜브 원심 짧은 펄스는 충분 합니다. 아니 보이는 액체 튜브에 남아 있어야 합니다.
   4. 펠 릿을 방해 하지 않고 공동 비례적 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다. 튜브 5 분 5 분 동안 원심 분리기에 대 한 얼음에 앉아 다음 제거 하 고 세척을 삭제 하자. 드 이온의 25 µ L를 추가 합니다. 각 동 5-10에 대 한 관. 펠 릿 분산 해야 하지만 물에 분해 되지.
   5. (사전-20 ° C에서 1 시간 이상 냉장) 워시 버퍼의 1 mL 및 세척 첨가물의 5 µ L를 추가 합니다. 와 동 펠 릿 완전히 분산 될 때까지 20-30 s 마다 10 분 이상 30 분 소용돌이-20 ° C에서 튜브를 품 어
      참고: 튜브 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 최대 1 주일 최소한의 단백질 저하 또는 수정.
   6. 원심 관 (이상) 12000 × g에서 5 분 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 흰색 공 표시 되어야 합니다. (해당 되는 경우 펠 릿이 너무 건조 하 고, resuspend 하는 것이 어려울 것 이다) airdry 더 이상 5 분 동안에 펠 릿을 허용 합니다.
4. 8 M 요소와 0.1 M 염화 중 탄산염의 300 µ L에서 단백질 펠 릿을 resuspend. 1 분에 강하게 소용돌이 색도계 분석 결과 사용 하 여 단백질 농도 결정 합니다.

9. 솔루션 소화 (프로토콜 2)

1. 700 mM DTT 수성 해결책의 5.1 µ L을 추가 하 여 이황화 다리를 감소 (최종 농도 12.5 m m)에서 resuspended 단백질에 8.4 단계와 thermoshaker와 함께 30 분 동안 37 ° C에서 품 어. 700 m m iodoacetamide 용액의 20.3 µ L을 추가 하 여 시스테인 잔류물을 알 (최종 농도 40 m m)는 thermoshaker와 함께 어둠 속에서 30 분 25 ° C에서 배양 하 고.
2. 샘플을 0.1 M 염화 중 탄산염의 990 µ L를 추가 합니다. 트립 신/리스-C 믹스 (효소: 기판 비율 1: 100 w/w)의 해당 볼륨을 추가 합니다. Thermoshaker는 37 ° C 하룻밤에 품 어.

10. 청소 카트리지 (프로토콜 2)

1. 젖은 1 열-볼륨 (1 mL) 메탄올의 카트리지. 1 열-볼륨 (1 mL) 80% 이기/HPLC 급 물 카트리지를 청소 하 고 흐름을 통해 삭제. 4 열-볼륨 (4 mL) 0.1% 포 름 산/HPLC-등급 물 카트리지 equilibrate 그리고 흐름을 통해 삭제.
2. 샘플 10% 개미 산 성 또는 pH 2-3 (pH 산도 표시기 확인)에 물 90 µ L 시 어 지 다. Acidified 샘플을 로드 하 고 흐름을 통해 수집 합니다. 자형 (not 유지 펩 티 드 포함) 다시 로드 합니다. 6 열-볼륨 (6 mL) 0.1% 포 름 산/HPLC-등급 물 카트리지를 씻어.
3. 0.1% 개미의 acid/50% 이기/HPLC 급 물 펩 티 드 1 열-볼륨 (1 mL)으로 카트리지의 elute. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송. 진공 농축 기 (150 x g, 160 mBar에서 진공)를 사용 하 여 샘플을 집중 한다.

11. 전자 초점 (프로토콜 2) 분류

참고: 펩 티 드 3에서 10의 pH 범위 13 cm 스트립 오프 젤 fractionator를 사용 하 여 그들의 전자 포인트에 따라 구분 됩니다. (아래 요약) 공급 업체에서 제공 하는 다음 프로토콜을 사용 했습니다.

1. 준비 하는 다음과 같은 솔루션: 솔루션은 (600 µ L의 글리세롤 솔루션, 60 OFFGEL 버퍼의 µ L, 초순의 4.34 mL) 및 솔루션 (해결책의 1.776 mL)-초순의 444 µ L B.
2. IPG 스트립, 프레임 및 제조업체의 지침에 따라 전극 조립.
3. B 각 잘으로 솔루션의 솔루션 B. 추가 40 µ L의 1.8 mL과 샘플 resuspend 각 잘으로 150 µ L의 샘플을 로드 합니다.
4. 펩 티 드의 기본 방법 선택: OG12PE00 (3100 OFFGEL 낮은 해상도 키트, pH 3-10, 12-잘 프레임 사용에 대 한 펩 티 드 OFFGEL 기본 방법. 이 방법은 완성 된 (~ 20 h) 되었습니다 때까지 기다립니다. 제대로 분류 관에 분수를 수집 합니다.

12. 청소 하버드 장치 열 역 C18 게시물-IEF (프로토콜 2)

1. 1%의 한 번에 몇 μ를 점진적으로 추가 TFA 각 분수 드 이온된 수에 샘플을 시 어 지 다 하. PH는 약 3 또는 아래 pH 종이 사용 하 여 확인 합니다.
2. 준비 하는 다음과 같은 솔루션: 솔루션 1 (이기의 5 mL, 10 µ L의 포 름 산, 초순 4.99 mL) 및 솔루션 2 (이기의 0.5 mL, 포 름 산, 초순 9.49 mL의 10 µ L).
3. -스핀 열 솔루션 1의 150 µ L 젖은. 원심 분리기 90 g와 흐름을 통해 삭제 x 750에서 s. 솔루션 2의 150 μ와 스핀 열 세척. 원심 분리기 90 g와 흐름을 통해 삭제 x 750에서 s.
4. 열을 통해 분수를 전달 합니다. 원심 분리기 90 g와 흐름을 통해 삭제 x 750에서 s. 솔루션 2의 150 μ 씻어. 원심 분리기 90 g와 흐름을 통해 삭제 x 750에서 s.
5. 솔루션 1의 50 μ와 분수 elute 90에 대 한 원심 분리기 s 750 x g.에서 한 번 더 이러한 단계를 반복.
6. 드라이-분수 (150 x g, 진공 160 mBar) 진공 집중 장치를 사용 하 여-80 ° C에서 저장

13. Proteomic 데이터와 생물 정보학¹⁸ 의 분석

1. 나노-LC MS에 의해 얻은 데이터를 분석/MS 질량 분석기 MaxQuant (버전 1.5.2.8) 등 정량화 소프트웨어 안드로메다 검색 엔진을 사용 하 여.
2. 틀린 발견 비율 (FDR) 1% 단백질 및 펩 티 드와 아미노산 7의 최소 길이를 설정 합니다. C 터미널으로 효소 특이성을 설정 Arg를 리스. 프롤린 채권에 2 놓친된 분열을 허용 합니다. 변수 수정으로 고정된 수정 및 N 맨끝 단백질 acetylation 및 메티오닌 산화 시스테인의 carbamidomethylation를 선택 합니다.
3. 추가 통계 분석 소프트웨어와 데이터를 분석 합니다. FunRich 소프트웨어 (www.funrich.org/)를 사용 하 여 기능 농축 분석을 수행 합니다. 데이비드 소프트웨어 (https://david.ncifcrf.gov/)를 사용 하 여 유전자 온톨로지 농축 분석을 수행 합니다.

결과

주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 차등 원심 분리 하 여 얻은에서 시작, 프로토콜 허용 CD14의 인구를 얻는⁺ monocytes cytometry (그림 1)에 의해 98% 이상의 평가 순도 함께. 이러한 monocytes secondarily 다양 한 분극 (그림 2)으로 구분 됩니다. 젤에 분류 선택, SDS 페이지 젤에 마이그레이션 원하는 밴드의 번호에 맞게 이며 밴드 excised 됩니다 (그림 3). 소화는 젤의 삭제 밴드에서 secondarily 수행 후는 펩 티 드 추출 됩니다. 나노-LC (액체 크로마토그래피)를 사용 하는 펩 티 드 분석-MS/MS 질량 분 서 계. MS/MS 스펙트럼 알려진된 펩 티 드 (그림 4A)에 대...

토론

Proteomics 전체 셀 또는 subcellular 구획에서 다른 단백질의 표현을 공부 하는 강력한 도구 이므로 세포 세포의 용 해 프로토콜의 최적화 및 단백질의 소화 연구의 숫자에 의해 수정 되었습니다. 젤 소화 (polyacrylamide 젤 매트릭스에 단백질의 소화)¹⁷, 솔루션¹⁸ 및 필터 지원 샘플 준비¹⁹에서 소화를 포함 하는 방법의 세 가지 주요 클래스 있다. 이 마지막 방법은 보편적으로 설명 하는 처음에 낮은 재현성 및 필터²⁰에 단백질의 가능한 손실에 보고 되었습니다. 젤 소화 가능한 경우 소화의 효율성을 평가 하는 것은 쉽게, 어렵고 불리 될 수 있는 강력한 방법입니다. 솔루션에서 소화 소화와 IEF 후 샘플을 청소 하지만이 가능성을 제공 합니다. 비교 될 때 이러한 두 메서드는 동일한 샘플 사이, IEF 분별 프로토콜 솔루션에 소화 보다...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
저산소증 워크 스테이션	Oxford Optronix	Hypoxylab
C6 유세포 분석기	BD	Accuri C6
Urea	Agilent Technologies	5188-6435
포름산(FA)	ARISTAR	450122M
R-250 Coomassie blue	Biorad	1,610,436
지질다당류, 대장균(LPS)	Calbiochem	437627
2D 클린업 키트	GE Healthcare	80-6484-51
RPMI 1640 매체, 글루타맥스 보충제	Gibco	61870044
HEPES 1 M	Gibco	15630-080
MEM 비필수 아미노산(NEAA) 용액 100X	Gibco	11140-035
인산염 완충 식염수(PBS) 1X	Gibco	14190-094
Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column	Harvard Apparatus	74-4601
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Invitrogen	AM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12%	Life Technologies SAS	NP0321 BOX
CD14 Microbeads human	Miltenyi Biotec	130-050-201
MACS 분리 컬럼 LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
대식세포 집락자극인자 (M-CSF)	Miltenyi Biotec	130-096-485
인터루킨 4 (IL4)	Miltenyi Biotec	130-093-917
인터루킨 13 (IL13)	Miltenyi Biotec	130-112-410
인터페론 감마 (INFγ)	Miltenyi Biotec	130-096-482
CD14-FITC (클론 TÜ K4)	Miltenyi Biotec	130-080-701
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753
트리플루오로아세트산(TFA)	Pierce	28904
Trypsin/Lys-C Mix	PROMEGA	V5073
Complete Mini, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일	Roche	11836170001
밀도 구배 용액( Histopaque 1077)	Sigma Aldrich	10771-100ML
Accumax	Sigma Aldrich	A7089-100ML
인간 남성 AB 혈장(SAB)의 인간 혈청	Sigma Aldrich	H4522-100ML
소 혈청 알부민(BSA) 용액 30%	Sigma Aldrich	A9576-50ML
Trisma base	시그마 Aldrich	T1503
글리세롤	시그마 알드리치	49767
&베타;-메르캅토에탄올	시그마 알드리치	M3148
브로모페놀 블루	시그마 알드리치	114405
소듐 도데실 설페이트(SDS) 20%	시그마 알드리치	5030
암모늄 바이카보네이	시그마 알드리치	9830
아세토니트릴	시그마 알드리치	34888
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	43819
요오도아세트아미드	Sigma Aldrich	57670
Thiourea	Sigma Aldrich	T8656
CHAPS	Sigma Aldrich	C9426
Micro BCA 분석 키트	ThermoFisher	23235
5 mL 멸균 플라스틱 피펫	VWR	612-1685
Thermomixer C Eppendorf	VWR	460-0223
Sep-Pak tC18 역상 카트리지, 100 mg	Waters	WAT036820