정 맥 합성 펩 티 드, 단백질 키 니 아 제 C 델타 억제제, 국 소 빈 혈 reperfusion 유발 급성 폐 상해 감소를 제공 하는 골드 나노 펩 티 드 하이브리드를 사용 이전 했습니다. 여기 우리가 약물 배합의 상세한 프로토콜을 보여줍니다. 다른 세포내 펩 티 드 유사 하 게 공식화 될 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 키 니 아 제 C 델타 억제제 (PKCδi)은 국 소 빈 혈 reperfusion 유도 장기 부상을 방지 하기 위해 유망 약 이다. 그것은 일반적으로 세포 관통 펩 티 드, 문신, 세포내 전달에 활용 됩니다. 그러나, 문신 일반적인 생물 학적 활동을 보이고 있다. 금 나노 입자 (GNPs) 인식된 독성 없이 약물 전달 매개체로 사용할 수 있습니다. 따라서, PKCδi를 제공 하는 한나라당/펩 티 드 하이브리드를 사용 했습니다. 두 개의 짧은 펩 티 드 (P2: CAAAAE 및 p 4: CAAAAW), 95:5 비율로 한나라당의 표면 특성을 수정 하는 데 했다. GNPs PKCδi (한나라당/PKCi)와 함께 활용 된 증류수, 안정는 0.9 %NaCl, 그리고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 소 혈 청 알 부 민 또는 소 태아 혈 청에 포함 된. 한나라당-PKCi의 정 맥 주입 이전 폐의 국 소 빈 혈 reperfusion 상해를 방지 하기 위해 표시 했다. 이 문서는 한나라당/PKCi 공식화 한나라당/PKCi의 physiochemical 속성을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다. 한나라당과 다른 펩 티 드 기반 약물을 공식화 하 유사한 방법을 사용 했습니다. 이 문서 잘하면이 소설 세포내 약물 전달 기술을 vivo에서 응용 프로그램에 더 많은 관심을 그릴 것입니다.
서론
폐 이식 말기 폐 질환1환자를 저장합니다. 그러나, 폐 이식 후 심각한 합병증 걸림돌이 남아 있다. 폐 이식 다음 초기 단계에서 기본 이식 부전 가장 유해한 합병증1이며 그 주요 원인이 국 소 빈 혈 reperfusion (IR)-유도 된 급성 폐 손상2.
차가운 보존에서 기증자 폐 물질 대사는 매우 낮은 수준으로 제한 됩니다. 그러나, 반응 산소 종 및 산화 질소 합성 혈액 흐름3의 중단으로 인해 활성화 됩니다. 이식 후 혈액 순환을 복원 하 고 반응성 산소 종 및 냉 허 혈 중에 생성 된 산화 질소 염증과 세포 죽음, 조직 상해의 결과 강화 한다.
부상을 방지 하기 위해 IR, 단백질 키 니 아 제 Cδ 억제제 (PKCδi)은 마음, 두뇌 및 폐4,,56,7,8에서 사용 되었습니다. 이러한 연구는 그 PKCδi 감소 염증 그리고 apoptosis reperfusion 동안 보여주었다. 그것은 또한 쥐 및 폐 이식 모델6폐 IR 부상을 하지 못했습니다. PKCδi은 일반적으로 세포 관통 펩 티 드, 문신, 세포내 배달용으로 활용 됩니다. 그러나, 그것은 혼자 문신 펩타이드는 일반적인 생물 학적 효과, angiogenesis, apoptosis, 그리고 여러 cytokines9,,1011의 금지의 승진을 포함 하 여 표시 되었습니다. 나노 입자, 작은 입자를 1에서 100 까지의 직경12nm 마약 배달13촉진에 후보자로 탐험 되었습니다. 특히, 금 나노 입자 (GNPs) 비 침 투 하 고 무 독성으로 간주 됩니다. 따라서, 우리는 펩 티 드 근거한 약14,15약물 전달 매개체로 GNPs를 개발 했습니다.
GNPs의 표면 분자 인식16,17, 화학 감지18, 이미징19, 약물 전달 등 특정 응용 프로그램에 대 한 조작할 수 있습니다. 20 nm GNPs 및 2 개의 짧은 펩 티 드를 포함 하는 한나라당/펩 티 드 하이브리드 시스템 개발 되었습니다 (P2: CAAAAE 및 p 4: CAAAAW) 비율로 95:5, GNPs의 표면 특성을 수정 하려면. P2 펩 티 드, 끝, 부정 청구 글루탐산 (E)와 함께 수성 해결책에서 GNPs 안정화 하 고 끝에, 소수 성 트립토판 (W)와 P4 펩타이드, GNPs 셀14로 입구. 이러한 펩 티이 드의 N terminus에 시스테인 (C) 잔류물 골드 표면14켤레 수 thiol 그룹을 포함 합니다. 이 펩 티 드/한나라당 하이브리드 추가 PKCδi (CSFNSYELGSL)를 전달 하기 위해 사용 되었다. PKCδi에 P2:P4의 최적화 된 어 금 니 비율은 47.5:2.5:50 이다. GNPs PKCδi (한나라당/PKCi)와 함께 활용 된 증류수, 0.9%에에서 안정적인 NaCl, 그리고 PBS 소 알 부 민 또는 소 태아 혈 청14를 포함 하는. 한나라당/PKCi의 정 맥 주입 폐15의 국 소 빈 혈 reperfusion 상해를 방지 하기 위해 표시 되었습니다. 이 문서에서는 한나라당/PKCi를 공식화 하는 방법에 설명 하 고 한나라당/PKCi의 물리 화학적 특성을 평가 하는 방법에 설명 합니다. 한나라당20,,2122에 활용 된 다른 펩 티 드 기반 약물을 공식화 하기 위해 유사한 방법을 사용 했습니다. 이 문서는 세포내 약물 전달에 대 한 소설이 공식에 더 많은 관심을 그릴 것입니다 바랍니다.
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프로토콜
1입니다. 펩타이드 솔루션의 준비
- 검색은 펩 티 드 (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL)-20 ° C 냉장고를 상 온 (RT) 해 동.
참고: 병은 펩 티 드에 비응축에서 습기를 방지 하기 위해 폐쇄 유지. - 한 눈금에 각 펩 티 드의 0.01 g 무게. 별도 50 mL 원뿔 관으로 각 펩 티 드를 넣어.
- P2 튜브에 이온된 (DI) 수의 18.74 mL를 추가 합니다.
- P4 튜브를 디 물 16.93 mL를 추가 합니다.
- PKCδi 튜브를 디 물에 희석 50% 이기의 8.21 mL를 추가 합니다.
- 소용돌이 짧게 펩 티 드 솔루션. 5 분 동안 sonicator (40 MHz)에서 50 mL 원뿔 튜브를 넣어.
- Biosafety 캐비닛을 펩 티 드 솔루션을가지고. 준비 하는 모든 펩 티 드 솔루션 1 m m 이어야 한다입니다.
- 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 각 펩 티 드 솔루션의 1 mL를 전송. P2, P4의 튜브에 디 물 19 mL을 추가 하 고 각 솔루션은 50 µ M을 희석 하 고 자체 튜브에 저장 되도록 PKCδi 튜브를 50% 이기의 19 개 mL를 추가.
2입니다. 한나라당/PKCi의 정립
- 펩 티 드 BSC에 한나라당 솔루션에 추가 되어야 한다
- 15 mL 튜브에 475 μ p2, P4의 25μL 및 δPKCi 솔루션의 500 μ를 추가 합니다. 같은 15 mL 튜브에 20 nm 한나라당 솔루션 (7.0x1011 입자/mL)의 9 mL를 추가 합니다.
- Biosafety 내각을 종료 합니다. 15 mL 튜브를 알루미늄 호 일로 감싸 줍니다. 두고 RT에서 통에 하룻밤.
- 캐비닛에 biosafety 샘플을 반환 합니다. 각 1.5 mL microtubes에 한나라당/PKCi의 aliquot 1 mL.
- 원심에 4 ° c.에 15,294 x g에서 30 분 동안 마이크로 원심 분리기 튜브
- 상쾌한 biosafety 캐비닛 아래 각 튜브에서 제거 합니다.
참고: 한나라당 펠 릿 그대로 유지 하 고 발음 하지는 상쾌한 제거를 주의 해야 합니다. - 다시 요구 하는 농도 따라 원하는 용 매에는 펠 릿을 일시 중단 합니다. 적용 가능한 용 매 디 물, 수 PBS, 0.9 %NaCl.
참고: 한나라당/PKCi의 1 mL에서 출발, 한나라당 펠 릿 1011 입자, 제조업체에서 제공 하는 한나라당 농도에 따라 x 6.3을 포함 되어 있습니다. 1.3 x 0.9%의 500 µ L에 1012 입자 관리를 NaCl, 0.9%의 232 µ L 추가 3 알 약의 각각에 NaCl. 함께 그들을 풀링 후 우리 다음 한나라당/PKCi 솔루션의 500 µ L을 수집할 수 있습니다.
참고: 원하는 혼합 용 매 한나라당/PKCi 펠 릿을 희석 하기 전에, 그렇지 않으면 한나라당/PKCi를 집계 합니다.
3. 한나라당/PKCi 하이브리드 용 해도의 평가
- 아크릴 베트에 한나라당/PKCi 솔루션의 0.5 mL를 붓으십시오. 대 일 분 광 광도 계에 아크릴 베트를 놓고 피크 흡수15를 테스트 합니다.
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결과
주의 해야 한나라당/PKCi 하이브리드의 생물 속성을 평가 하기 위해 한나라당 경향으로 용 매에서 집계. 한나라당 집계 되는 경우 솔루션의 색상 분홍색에서 자주색 (그림 1a) 변경 합니다. 대 일 분 광 광도 계 더 민감하게 변화를 감지할 수 있다. 한나라당/PKCi 집계 되지 경우 흡수 피크 525에 있어야 한다 nm (그림 1b). 한나라당은 집계 흡수 피크 오른쪽으로 이동 됩니다. 분석, 집계 ΔOptical 밀도 형성 하는 경우의 대체 방법으로 (ΔOD 525에서 OD = nm-440에서 OD nm) 감소.
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토론
적절 한 배합을 보장 하기 위해, 그것은 중요 δPKCi 솔루션 1.6에서 설명 쥡니다 단계를 겪 습입니다. ΔPKCi 펩 티 드 순서는 sonicator 50% 이기 솔루션에서 PKCi를 녹이는 데 도움이 그래서 소수 moieties를 포함 되어 있습니다. 또한, 그것은 매우 꼼꼼하게, 2.7 단계에 설명 된 용 매를 혼합 하는 것이 중요입니다. 다음이 단계는 제대로 하지, 때문에 δPKCi 펩 티 드23의 집계 경우이 한나라당/PKCi 하이브리드는 하지 잘 공식화 됩니다.
한나라당 기반 약물 배합에는 여러 가지 이점을 제공합니다. 첫째, GNPs 종합 될 수 쉽게 몇 나노미터에서 ~ 100에 이르기까지 잘 제어 크기에 nm. 일반적으로, 더 작은 크기의 GNPs 제공할 수 있습니다 약물 세포로 큰 것 작은 것 들 수 쉽게 그들의 대상 지역24로 확산으로 보다 더 효율적으로. 둘째, GNPs는 그들에 게 안전한 약물 수송을...
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공개 사항
저자는이 프로젝트에 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회 (PJT-148847), 사역의 연구와 혁신의 온타리오 (재-08-029), 캐나다 첫 번째 연구의 우수 프로그램, 토론토 대학에서 디자인 하 여 의학에서 연구 보조금에 의해 지원 됩니다. 박사 Mingyao 리 우 제임스와 메리 Davie의 자 폐 상해, 수리, 및 재생 이다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 음전하를 띤 글루탐산 펩타이드 (P2) | CanPeptide | 서열 : CAAAAE-NH2 길이 : 6aa 개질 : C- 말단 아미드 < > 수량 : 50mg 순도 : >95 % | |
| 소수성 트립토판 펩티드 (P4) | CanPeptide | 서열 : CAAAAW-NH2 길이 : 6aa 수정 : C 말단 아미드 < > 수량 : 50mg 순도 : >95% | |
| &델타; PKCi 펩타이드 | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 길이: 11aa 개질: C-terminal amidation 수량: 50mg 순도: >95% | |
| 원뿔형 튜브(50ml) | 코닝 생명 과학 | 3582070 | |
| 원뿔형 튜브(15ml) | 코닝 생명 과학 | 3582096 | |
| 아세토니트릴 | 시그마-알드리치 | 271004-100ML | |
| 초음파 발생기 | 브랜슨 초음파 공사 | Branson 2510MTH | |
| 마이크로튜브 | Diamed.ca | AD 150-N | |
| 금 나노 입자 용액 | Ted Pella | 15705-5 | 입자 크기는 20nm |
| 록킹 플랫폼 쉐이커 | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis 분광 광도계 | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
참고문헌
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