효 모에 Polyglutamine 독성 분석 실험을 사용 하 여 퓨전 파트너에 형광 단백질의 영향

요약

이 문서에서는 집계에 형광 단백질의 효과 형광 기자 들의 맥락에서 새로 새롭거나 형광 단백질의 급속 한 평가 misfolded polyglutamine 확장의 독성을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다.

초록

단백질 지 방화 및 라이브 셀 이미징 사용 하 여 매매의 수사에 대 한 연구는 종종 형광 기자에 게 관심사의 그들의 단백질을 융합에 의존 합니다. 끊임없이 진화 목록이 유전자 인코딩된 형광 성 단백질 (FPs) 형광 퓨전 디자인에 관해서 여러 대안을 가진 사용자를 선물 한다. 각 FP는 특정 광학 및 생물 속성이 결과 형광 융해의 생화학, 세포, 및 기능 속성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 여러 FPs 융합 파트너의 기능에 방해에 취약 일반 올리고를 형성 하는 경향이 있다. 불행히도, 몇 가지 방법만 형광 기자의 행동에 FPs의 영향을 테스트 위해 존재 합니다. 여기, polyglutamine (polyQ) 독성 분석 실험을 사용 하 여 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 FPs의 영향의 급속 한 평가 가능 하 게 간단한 방법을 설명 합니다. PolyQ 확장 huntingtin 단백질 확장된 huntingtin 독성 올리고 포함 시체로 집계 Huntington의 질병 (HD)의 증상과 연결 됩니다. 집계 및 효 모에 polyQ 확장의 독성은 높은 FPs의 행동에 미치는 영향을 공부 하는 이상적인 실험 플랫폼을 제공 하는 형광 태그의 존재를 포함 하 여 polyQ 지역 측면 시퀀스에 따라 그들의 퓨전 파트너입니다.

서론

이후 Aequorea 빅토리아¹, 유전자 인코딩된 FPs의 넓은 팔레트에서에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 초기 특성을 개발 하 고, 허용 동시에 지역화 및 추적 세포 생물학 여러 생활에서 셀룰러 이벤트/단백질 세포^2,3. FPs는 산호, 그리고 그러므로, 표시 특정 생물 속성을 광범위 하 게 그들의 각각 형광 스펙트럼 넘어 전환에 해파리에서 여러 유기 체에서 파생 됩니다. 이러한 속성에는 밝기, photostability, 및 다른 사람의 사이에서 oligomerize^2,4경향이 포함 됩니다. 부적절 한 상호 작용 및 융합 파트너의 기능 변경 최소화 하 고 대 한 기자 효율 극대화 형광 기자를 설계할 때 적합 한 태그의 선택에 중요 한 측면 이다 단위체 FPs를 선택 하는 주어진 세포 구획^4,,56. GFP는, 시간이 지남에 진화 되었습니다 융합 파트너

프로토콜

1. 새로운 붙일 태그가 Htt^ex1 효 모에는 식에 대 한 기자 들의 세대

참고:이 섹션은 프로토콜에서에 의해 수정 된 장 외. ¹⁶ 및 Albakri 외. ¹⁹.

1. 형광 단백질 또는 PCR에 의해 관심을 인코딩 순서를 증폭 하는 뇌관 디자인. 앞으로 뇌관 리더 시퀀스 소화 (GATC) 동안 제한 효소 SpeI 제한 사이트 (ACTAGT) 및 관심사의 형광 단백질 유전자의 ATG (ATG 제외)의 하류 20 기초를 지원 하기 위해 포함 되어야 합니다. 반전 뇌관 사리 제한 사이트 (GTCGAC)와 (를 포함 하 여 중지) FP 시퀀스의 정지 codon의 상류 20 기지의 반전 보수 지도자 시퀀스 (GATC)를 포함 해야 합니다.
2. Thermocycler는 다음 설정을 사용 하 여 PCR 반응을 수행 단계 1.1에서에서 설계 하는 뇌관을 사용 하 여: 1 분 및 30 주기 95 ° C에서 95 ° C에 열 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 PCR 제품의 kB 당 2 분 동안 72 ° C. 18 주기를 수행 하는 것입니다 충분 한.
3. (트리 스-아세테....

결과

FPs는 다른 생물 속성, oligomerize에 그들의 추세를 포함 하 여 형광 기자 들의 맥락에서 그들의 융합 파트너의 동작에 영향을 미칠 수 있다. 이 프로토콜에는 여러 FPs 독성 polyQ 확장을 융합 하는 수 있는 간단한 방법을 설명 합니다. PolyQ 독성 측면 polyQ 스트레치¹⁵시퀀스에 상당히 의존 때문에,이 분석 결과 형광 polyQ 퓨전 기자 (그림 1)의 신속 하 고 직접적인 비교를 허용 한다. HD 관련 된 polyQ 길이 (25Q) 부정적인 제어로 사용 되 고 중요 한 독성 또는 집계^15,16,,2122표시 하지 않습니다........

토론

이 문서에서는, Htt^ex1 polyQ 확장 및 효 모 성장에 미치는 영향의 집계를 측정 하기 위해 다양 한 분석 공부 어떻게 다른 형광 모델로 채택 되었다 단백질 형광 기자 들의 맥락에서 그들의 퓨전 파트너 변경 . 우리이 polyQ 독성 및 집계 다른 형광 태그 사이 상당한 변화를 감지 하 고 polyQ FP 퓨전 성능에 대 한 직접적이 고 빠른 비교에 대 한 수 보여 긍정적인 컨트롤로 GFP 변형 (ymsfGFP)를 사용 하 여, GFP 태그 구문을^16,19.

현재 프로토콜은 형광 단백질에 초점을 맞추고, 하는 동안 프로토콜의 다양 한 부분 다른 단백질 태그의 결과 테스트 하는 쉽게 적응 수 있습니다. 또한, 현재 프로토콜 복사 번호 (일반적으로 1 ~ 2 부) 셀²⁵에 측면에서 다를 수 있는 낮은 복사 효 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5-alpha 유능한 대장균(고효율)	New Englanfd Biolab	C2987
SpeI-HF	New Englanfd Biolab	R3133	고충실도 효소가 선호됨
SalI-HF	New Englanfd Biolab	R0138	고충실도 효소가 선호
Agarose	Fisher Scientific	BP160
LB-Agar	Fisher Scientific	BP1425
LB-Broth	Fisher Scientific	BP1426
Ampicilin	Fisher Scientific	BP1760
PfuUltra 고충실도 DNA 중합효소	애질런트 기술	600382
EPOCH2 마이크로플레이트 분광 광도계	BioTek Instruments inc	EPOCH2TC
효모 핀 복제기	V& 주식회사 P 사이언티픽
SPI 이미저	S& P 로보틱스 Inc.	spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan	Carl Zeiss Microscopy	LSM 800
8 well Lab-Tek 이미징 챔버	Fisher Scientific	12565470
Bio-Dot 장치	Bio-Rad	1706545
Chemi Doc XRS+	Bio-Rad	1708265
anti-FLAG M1 항체	Sigma-Aldrich	F3040
염소 항-마우스 IgG alexa 555 보조 항체	Thermo	A32727
플라스미드 MiniPrep 키트	Fisher Scientific	K0503
플라스미드 겔 추출 키트	Fisher Scientific	K0831
PCR 정제 키트	Fisher Scientific	K0702
Prizm	GraphPad	N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA)	Fisher Scientific	BP13354

됨 VP407AH