이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량

5.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58753

⸱

2019년 1월 22일

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne

이 논문에서

요약

에이즈 효율적인 재 활성화의 기능 평가 및 잠재 proviruses의 높은 처리량 프로토콜 설명 이며 HIV 전사에 개입의 영향을 테스트 하 고 접합 하 여 적용 합니다. 대기 시간 반전 LTR 기반 전사에 에이전트와 접합의 효과의 대표적인 결과 제공 됩니다.

초록

HIV에 안정적이 고 잠재적인 바이러스, 면역 체계에 보이지 않는 유지 하 고 현재 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 의해 타겟이 되지 형태의 항구 셀의 저수지의 존재 때문에 불 치이 남아 있다. 전사 및 접합 CD4 + T 세포 휴식에서 HIV-1 대기 시간을 강화 하기 위해 표시 되었습니다. 대기 시간 대기 시간 반전 에이전트 (LRAs) "충격 및 죽이기" 접근의 사용에 의해의 반전이이 저수지를 제거 하기 위해에서 광범위 하 게 공부 하고있다 하지만 있다 지금까지 표시 되지 않습니다의 적절 한 개발의 부족으로 인해 임상 시험에 있는 성공 분자가이 저수지를 교란 효율적으로 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜에는 안정적이 고 효율적으로 HIV 전사에 대기 시간 반전 에이전트 (LRAs) 평가 및 접합 방법을 제공 한다. 이 방법은 LTR 기반 듀얼 컬러 기자 동시에 전사 및 접합에 아이라의 효과 측정할 수 있는의 사용 cytometry에 의해을 기반으로 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 부착 셀에에서 셀에 대 한 적절 한입니다. 그것은 높은 처리량의 시스템에서 약물의 많은 수를 테스트 하기 위한 유용 합니다. 메서드는 기술적으로 구현 하는 간단 하 고 비용 효율적인. 또한, cytometry 사용 세포 생존 능력의 평가 허용 하 고 따라서 동시에 독성 약물.

서론

효과적인 장기 투여 요법에도 불구 하 고 HIV 메모리 CD4 + T 세포1에 통합된 provirus로 숨겨진 상태로 유지 됩니다. 에이즈-1 5의 염색 질 구조 ' 긴 단말기 반복 (LTR) 발기인 및 히스톤 메 틸 화 등 DNA methyltransferases (DNMT) 및 히스톤 deacetylases (HDAC) deacetylation 후 성적인 수정은에 지도 하는 중요 한 메커니즘 transcriptional 억제 하며 따라서 사후 통합 대기 시간2,3 대기 시간 역전 에이전트 (LRAs)의 큰 다양 한 생체 외에서 바이러스 생산을 유도 하기 위해 그들의 효 험에 대 한 조사 및에서 vivo에서 latently 감염 휴식 CD4 + T 세포4,,56,7 ,8. LRAs 중 테스트, HDACi (HDAC 저 해제)와 내기 bromodomain 억제제 (베티스) 유도 chromatin decondensation 및 긍정적인 녹음 방송 신장 요인 b (P-TEFb)의 출시 각각,는 transcriptional의 완화 후속으로 이어지는 5' LTR 억압 고 에이즈 식9,10,11,,1213의 활성화. 그러나 Ex vivo14,15셀 관련 unspliced HIV mRNA (미국 RNA), 바이러스 성 전사의 지표에 겸손 한 증가 관찰 했다, 이러한 LRAs 여 재 활성화의 크기 제한 되었다. 중요 한 것은, 이러한 LRAs latently 감염 된 세포의 주파수에 있는 감소를 유도 하지 못했습니다.

에이즈 식 비효율적인 접합16 곱하기 접합된 HIV RNA (MS RNA)17의 핵 수출에서 결함에 의해 더 제한 될 수 있습니다. 따라서, 식별 새로운 유형의 LRAs 더 강력한 바이러스 생산 후 통합의 영향을 미칠 수 필요 합니다. 또한, 대기 시간을 효율적으로 반대로 최적의 화합물을 정의 하는 데 도움이 소설 분석 실험의 개발이 필요 합니다.

여기, 프로토콜 제공 됩니다, 에이즈 LTR 기반 전사 및 접합에 개입의 영향의 기능 평가 위한 높은 처리량 접근 활용. 간단 하 게, 새로운 LTR 기반 듀얼 컬러 기자 시스템 pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (그림 1) cytometry HIV 재 활성화를 평가 하기 위해 사용 됩니다. 이 형광 기자에서 unspliced HIV mRNA (4 kb)의 식 접합된 mRNA (2 kb)의 표현 Discosoma sp. 레드 (DsRed) 형광 단백질 표정으로 이어질 것 이라고 하는 동안 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 식에 지도 한다. 간단히, 형광 환경을 EGFP 융해 단백질, gp140unc를 사용 했습니다. EGFP, EGFP의 코딩 시퀀스 봉투 (Env) 유엔 쪼개진 고 잘린 형태의 프레임에 배치 했다 Ablate 분열 사이트에 gp120 그리고 gp41 EGFP 환경의 분리를 방지 하 고 올바른 접는 용이 하 게 하는 수용 성 환경을 아날로그 만드는 막 횡단 도메인 이전 gp160 단백질 자를 변경 도입 된 및 EGFP의 표현입니다. 셀 내에서 식에 따라 계 그것 4 kb 환경 을의 핵-세포질 수출을 중재 하는 핵에 localizes mRNA (RRE) 계 반응 요소와 상호 작용을 통해. Env의 잘림 gp120 그리고 gp41, A7 3' 스플라이스 사이트 사이 RRE 타협 하지 않습니다. 이 시스템에 V-1에 접합 기증자 4 (SD4)를 결합 하 고 acceptor 7 (SA7) 2 kb의 생산에 결과 mRNA 아미노산 38에서 잘린 기능 비 계 단백질 인코딩 융합 DsRed 형광 단백질, RevΔ38-DsRed. 간단히, DsRed 중첩 확장18아미노산 38에 레 브의 2nd exon에 삽입 되었다. Unspliced mRNA의 핵 수출을 촉진 하기 위하여 포유류 표정 벡터 계 (pCMV-레 브NL4.3) 인코딩 형광 기자 구조 (그림 2)와 페 공동 했다. 여기에 설명 된이 독특한 기자 구문 HIV 전사 및 접합, 바이러스 성 벡터를 사용 하지 않고도 높은 처리량 평가에 유용 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

참고: 복제에 대 한 절차, 변환 및 시퀀싱은 다른18,19논의. 본 프로토콜 transfection 포유류 식 벡터 (그림 3)에서 시작합니다.

1. 듀얼 컬러 기자와 HEK293T 세포의 transfection 구성

  1. Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 μ g/mL) 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 보충에 HEK293T 세포 배양 녹고, 후 2-3 회 transfection에 그들을 사용 하기 전에 통행 HEK293T 세포 실험. 이 녹고 절차에서 회복 하기 위해 세포 시간을 줄 것 이다.
    주의: Mycoplasma 세포 배양의 오염 심각한 문제가 남아 있습니다. 좋은 실험실 연습 및 세포 배양의 일상적인 테스트 mycoplasma 오염의 위험을 감소 하 고 유포20방지에 필수적입니다.
  2. 뿌리기 전에 1:2 1 일 셀을 분할 하 고 신선한 DMEM 매체에 그들을 전송. 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 24 h에 대 한 셀을 육성
  3. Transfection, 전날 포부에 의해 플라스 크에서 매체를 제거 하 고 혈 청의 흔적을 제거 하려면 Dulbecco의 인산 염 버퍼 (DPBS) 염 칼슘 (캘리포니아2 +), 마그네슘 (마그네슘2 +)의 무료 셀을 세척.
  4. 문화 그릇에 트립 신-EDTA 용액 (0.05%-PBS에서 10 m m)의 5 mL을 분배 하 고 2 ~ 5 분 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 그것을 배치.
  5. 세포를 분리 하는 때 더 세포를 손상 시킬 수 있는 트립 신 활동을 억제 하기 위해 10% (v/v) FBS 보충 DMEM의 5 mL을 추가 합니다.
  6. 부드럽게 아래로 풀 헤어 셀 정지를 pipetting으로 resuspend.
  7. Trypan 푸른 얼룩 (0.4%)에 셀 1시 10분 희석.
  8. 할을 차지 하지 trypan 블루 현미경 (10 x 목표)는 haemocytometer을 사용 하 여 라이브 셀을 계산 합니다.
  9. 세포 수의 평균 10000 곱한 여 밀리 리터 당 가능한 셀의 수를 계산 하 고 얼룩 trypan 블루에서 희석 비율 (1:10).
  10. DMEM 매체 10% 보충의 100 μ 2 × 104 셀 접시 바닥이-96-잘 빠진 접시 24 h에 대 한 항생제 없이 FBS.
  11. 각 잘 희석 400 pLTR.gp140/EGFP의 ng. RevD38/DsRed, 20 pCMV 계NL4.3 및 100의 ng pCMV Tat101AD8의 ng-혈 청 자유로운 매체의 50 μ에 플래그 DNA. 부드럽게 혼합. 일치 빈 문신 벡터 pcDNA3.1 (-)을 사용 하 여 문신 없이 실험에 대 한 있습니다.
    참고: 내 무료 DNA의 사용이 좋습니다. 그것을 위해 내 무료 DNA midi 또는 maxiprep 핵 산 정화 키트를 사용 하 여 준비 합니다. 1.7와 1.9 사이 여야 260/280 세 비율을 측정 하 여 DNA의 순도 결정 합니다.
  12. 부드럽게 사용 하기 전에, 지질 시 약을 혼합 한 다음 희석 혈 청 자유로운 매체의 50 μ에 0.65 μ. 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.
  13. 희석된 지질 시 약 희석된 DNA 결합 되어 있습니다.
  14. 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어. 솔루션은 흐린 나타날 수 있습니다.
    참고: 1.15 단계를 진행 합니다. 30 분 이내
  15. 100 μ 셀 위에 drop-wise 지질 시 DNA 복합물의 당 분배.
  16. 접시와 락으로 부드럽게 혼합.
  17. 5 h 5% CO2 습도 인큐베이터에서 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어
    1. 각 반응 혼합은 단일 잘 (96-잘) transfection에 대 한 충분 합니다. 조정 금액 및 약물 및 테스트, 조합 수에 따라 부품의 볼륨 및 pipetting 변형에 대 한 계정. 모든 조건 일반적으로 triplicates에서 테스트 합니다.
    2. 100 추가 우물 transfect CMV 구동 EGFP와 DsRed 익스프레스 DNA 플라스 미드 보상 목적의 ng.

2. Transfected HEK293T의 치료 대기 시간 반전 하는 에이전트와 세포

참고: 각 분석 결과 이전 셀 확산 분석 결과와 약물의 높은 복용량에 노출 된 후 세포의 생존 능력을 측정 하 여 각 아이라의 생리 상태를 결정 합니다.

  1. 각 아이라 성장 매체와 적절 한 작동 농도를 희석 (예:, JQ1(+))에 대 한 1 μ M.
    주의: 10 m m의 농도를 적절 한 용 매로 동결 건조 된 약 reconstitute 동결-해 동 주기를 반복된을 피하기 위해-80 ° C에서 모든 재고 LRAs 단일 사용 약 수 (각 5 μ)에 저장 합니다.
  2. 신중 하 게 transfection 매체는 멀티 채널으로 발음 하 고 적절 한 아이라 (표 1)를 포함 하는 100 μ 중간으로 바꿉니다. 매체 문화 플레이트 표면에서 쉽게 분리 알려져 있습니다 transfected HEK293T 셀을 분리 하지 않으려면 우물의 벽 함께 매우 부드럽게를 추가 합니다.
  3. 48 h 5% CO2 습도 인큐베이터에서 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어

3. 교류 Cytometry 분석에 대 한 고칠 수 생존 염료와 Transfected 세포의 얼룩

주의: 죽은 세포와 파편 제거 가양성을 제거 하 고 최고 품질의 결과 얻기 위해 필수적 이다.

  1. 잘 당 고 부드럽게 pipetting 위아래 (~ 5 번)는 다중 채널와 미디어의 볼만 피하 면 서 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 100 μ를 사용 하 여 미디어에 셀을 분리 합니다. 필요한 경우, 트립 신-EDTA 용액 (0.05%-PBS에서 10 m m)의 당 35 µ L를 사용 하 여 혈 청을 포함 하는 매체와 중화 전에 37 ° C에서 5 분을 배양 접시에서 세포를 분리 합니다.
  2. 96-잘 V-하단 플레이트에 셀을 전송 합니다.
  3. 4 ° C에서 500 x g 에 5 분에 대 한 셀을 회전 다음 셀을 건드리지 않고 매체/PBS를 신중 하 게 발음 합니다.
  4. 워시 세포 단백질/혈 청 무료 PBS의 200 μ와 적어도 1 시간.
  5. 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g 에서 centrifuge 다음는 상쾌한 접시를 기울이기 및 셀을 건드리지 않고 워시 버퍼를 제거 하 여 삭제 합니다.
  6. 단백질/혈 청 무료 PBS에 생존 염료 1:1000를 diluting 하 여 고칠 수 생존 염료의 작업 솔루션을 준비 합니다. 잘 당 희석된 얼룩의 50 µ L를 준비 합니다.
    참고: 생존 염료 파란색, 빨간색, 보라색 레이저와 함께 사용 하기 위해 적합 한 색상의 범위에서 사용할 수 있습니다. Resuspending 50 μ 무수 DMSO (구성 요소 B)으로 동결 건조 된 염료 (구성 요소 A)의 한 유리병으로 고칠 수 생존 염료의 재고 솔루션을 준비 합니다. 단일 사용 하는 aliquot (1 μ 각),-20 ° C에 게는 빛 으로부터 보호.
  7. 각 잘을 희석된 가능성 염료의 50 μ를 추가 하 고는 멀티 채널을 위아래로 pipetting으로 세포를 혼합.
  8. 얼룩 빛 으로부터 보호 4 ° C에서 10-15 분.
  9. 워시 버퍼 (1% 소 혈 청 알 부 민 및 2 mM EDTA와 PBS)의 150 μ 1-2 번 씻어.
  10. 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.
  11. 어둠 속에서 4 ° C에서 10-15 분에 대 한 워시 버퍼에서 갓된 1% 포름알데히드의 100 μ와 셀을 수정 합니다.
    주의: 포름알데히드는 매우 독성이 있다. 피하기 위해 장갑과 보호를 위한 안전 유리를 착용 하는 동안 흡입 증기 두건에서 1% 포름알데히드 솔루션을 준비 합니다.
  12. 워시 워시 버퍼의 100 μ로 1-2 번 셀.
  13. 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.
  14. 워시 버퍼의 70 μ에 셀 펠 릿을 resuspend.
    참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 고정된 셀 흐름 cytometer에 다음날 분석을 위해 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다.

4. EGFP 및 DsRed Cytometry 및 데이터 분석에 의해 측정

참고: 교류 cytometer에 HIV 전사 (%EGFP) 및 접합 (DsRed %)를 분석 합니다. 70 μ m 세포-스 트레이너 또는 100 μ m 나일론 메쉬 노즐 막힘 방지를 실행 하기 전에 샘플을 필터링 합니다.

  1. 적어도 cytometer 및 컴퓨터를 시작 10 분 전에 워밍업 레이저를 사용 하 여.
  2. 샘플을 실행 하 고 데이터 수집을 시작, 이전에 칼 집 탱크 0.9% 식 염 수 솔루션와 염소 태블릿 폐기물 탱크에 추가 되도록.
  3. 기포의 흐름 셀을 확인 합니다.
  4. 탐지기와 필터는 실험에 대 한 적절 한 확인 합니다.
    참고: EGFP, 블루 레이저의 사용 (488 nm) 및 530/30 대역, DsRed 익스프레스 최적으로 노란 레이저를 사용 하 여 검색 하는 동안 (561 nm) 및 610/20 대역. 블루 레이저 (488 nm) 610/20 대역 또한 DsRed 식 검색을 사용할 수 있습니다.
  5. Cytometer 성능 및 감도 감지기에 걸쳐 교정 비즈를 실행 하 여 확인 합니다.
  6. 앞으로 조정 (FSC-A) 및 측면 (SSC-A) 분산형 전압으로는 주요 인구 화면 샘플 및 명확 하 게 뚜렷한 흠 없는.
    참고: FSC (앞으로 흩어져 빛)은 빛의 측정 SSC (측면-흩어져 빛) 동안 셀 셀 면적 (크기)의 볼륨에 따라 평면 각도에서 회절은 비례 하는 직각에 광 회절 측정 셀 단위 그리고 내부 복잡성입니다.
  7. 인구의 EGFP + DsRed 발견자와 반대로 최소 좀 보장 단일 스테인드 샘플을 사용 하 여 수동 또는 자동 보정을 수행 합니다.
    주의: 보상으로 각 셀 단독으로 고칠 수 생존 염료와 스테인드 뿐만 아니라 단 하나 색깔 형광 성 단백질을 표현 하는 세포의 샘플을 사용 합니다. FITC와 PE 보상 구슬 EGFP 및 DsRed 형광 단백질 보상 다른 스펙트럼 특성 때문에 사용 하지 마십시오. 보상 제어 충분히 밝은 긍정적이 고 부정적인 인구를 해결 해야 합니다.
  8. 플롯 만들고 게이츠 형광 마이너스 1 (FMO) 컨트롤을 사용 하 여 설정 합니다.
  9. 취득 하 고 샘플 당 10000 가능한 셀 이벤트의 최소. 남자 통과 레이저 요격을 피하기 위해 중간 또는 낮은 속도로 샘플을 실행 합니다. 펄스 형상 게이팅 같은 사용 SSC-A SSC-H 남자 제거 대. 안정성 확인 SSC-A 대 시간을 그려서 실행의 어떻게 볼 흐름은 실행 하는 동안.
  10. 실행의 끝에, 집중된 청소 에이전트와 교류 cytometry 응용 청소 다음 5 분 동안 물.
  11. 셧다운 시스템, 폐기물을 폐기 하 고 다시 취득 후 칼 집 탱크를 채우기.
  12. 교류 cytometry 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다. 세포 파편과 덩어리 (남자) 앞으로 옆 분산형 기반 제외 다음 생존 색소 얼룩을 사용 하 여 죽은 세포를 제거 (부정 인구 라이브 셀에 =). 접합된 제품 DsRed의 비율 뿐만 아니라 EGFP와 DsRed (그림 4), 셀을 식별 /(DsRed + EGFP) (그림 5).
  13. HIV 전사 및 치료 세포와 개인 또는 LRAs (그림 5)의 조합에 노출 하는 셀을 비교 하 여 접합에 아이라의 효과 결정 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

에이즈-1의 표현 (EGFP) unspliced 및 bromodomain 억제제 JQ1와 치료 다음과 (DsRed) 제품을 접합에 대 한 대표적인 결과 그림 5 에 나와 있습니다. JQ1(+)와 문신 크게 EGFP 표현 세포의 비율 증가 (2.18 및 4.13 FC DMSO에 각각; n = 3) unspliced 성적 지표. 또한, JQ1(+) 크게 접합된 제품 (7.37 FC DMSO에) 문신으로 비슷한 레벨의 비율 뿐만 아니라 DsRed (46.6 FC DMSO에)를 표현 하는 세포의 백분율을 증가 (59.6 및 5.83 FC DMSO, 이상 각각) JQ1(+)의 능력을 확인 HIV 전사 및 접합 설정 하려면 다른 한편으로, stereoisomer 제어 JQ1(-)와 치료 곧 에이즈 전송 및 프로토콜의 성공을 확인 접합에 JQ1(+) 효과.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

Ex vivo 바이러스 재 활성화를 측정에 어려움을 감안할 때, 모델 시간 내내 latently 포함 HIV 대기 시간을 공부 하기 위하여 개발 되었다 생체 외에서 다양 한 범위의 감염 T 세포-라인 (J-라트, ACH2, u 1), (휴식의 잠재 감염의 기본 모델 O'Doherty, Lewin, 그린 및 Spina 모델) 또는 미리 활성화 된 CD4 + T 세포 (Sahu, 마리니, Planelles, Siliciano, 깐 모델) 단일 라운드 또는 복제 유능한 기자 바이러스22. HIV CD4 + T 세포 휴식에서 대기 하는 시간의 생리 적 상태를, 듀얼 형광 기자 시스템 LTR 기반 개 그-eGFP 마커 및 장소에 CMV 구동 mCherry 이반 사도 스키의 그룹에 의해 개발 된 RGH (빨강-녹색-HIV) 기자 등 일어 났 죠 Nef23의. 비슷한 컬러 듀얼 기자 바이러스, 듀오-Fluo, LTR 구동 EGFP 식와 EF1α 발기인

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품 프로젝트 그랜트 APP1129320 및 호주의 NHMRC에서 프로그램 그랜트 APP1052979에 의해 지원 되었다. 우리가이 작업의 성공적인 완료를 위한 필수 구문 및 통보를 제공 하기 위한 박사 아담 틀리는, 박사 마리나 알렉산더, 박사 제니 L. 앤더슨과 미셸 Y.이 감사 합니다. 우리는 또한 그들의 조언과이 연구에 사용 된 교류 cytometer 유지에 관대 한 지원에 대 한 DMI 흐름 시설 직원을 감사 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강>세포 배양
HEK293T 세포(인간 배아 신장 세포)ATCCCRL-3216SV40 복제 영역을 운반하는 벡터를 복제합니다.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)Gibco10569-010+ 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate
Fetal Bovine serumGibco10099-141원산지 호주
페니실린-스트렙토마이신SigmaP4458
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS), 칼슘 없음, 마그네슘 없음Gibco14190-136
Trypan blue stain, 0.4%Gibco15250
Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드Gibco25300054
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019Lipid transfection reagent
Opti-MEM I (1x) reduced serum mediumGibco31985-070무 혈청 배지
NucleoBond Xtra MaxiMarcherey-Nagel740414.50
pEGFP-N1 플라스미드클론텍 (TaKaRa)6085-1포유류 세포에서 EGFP의 발현, CMVIE promoter.
pDsRed-Express-N1Clontech(TaKaRa)632429포유류 세포에서 DsRed-Express의 발현, CMVIE promoter.
pLTR.gp140/EGFP. RevD38 / DsRedAddgene115775
pCMV-RevNL4.3Addgene115776
pCMV-Tat101AD8-FlagAddgene115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Millipore67-68-5
JQ1 (+)Cayman Chemical11187DMSO에서 10 mM 재고; 작업 농도 1 μ M
JQ1 (-)케이맨 화학물질 11232DMSO에서 10 mM의 재고; 작업 농도 1 μ M
Phorbol Myristate 아세테이트 (PMA)Sigma-Aldrich16561-29-8100 &mu에 재고; DMSO의 g/mL; 작업 농도 10 nM
Phytohaemagglutinin (PHA)RemelHA15 / R308527011 &mu 재고; 지/&무; PBS의 L; 작업 집중 10 Μ g / mL
Vorinostat (VOR)케이맨 화학10009929DMSO에서 10 mM의 재고; 작업 농도 0.5 μ M
Panobinostat (PAN)TRCP180500 DMSO에서 10 mM의 재고; 작동 농도 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation AssayPromega63581
Venor GeM ClassicMinerva Biolabs11-1100Mycoplasma Detection Kit, PCR 기반
NameCompany카탈로그 번호코멘트
유세포 분석 시약
LSR FortessaBD Biosciences유세포 분석기 (4 레이저 - 파란색, 빨간색, 보라색 및 노란색)
LSR IIBD Biosciences유세포 분석기 (3 레이저 - 파란색, 빨간색 및 보라색)
LIVE/DEAD 고정성 근적외선 데드 세포 염색 키트Life TechnologiesL34976생존도 염료: 633 또는 635nm 여기용, 400 분석. 구성 요소 A와 B는 모두 키트에 제공됩니다.
소 혈청 알부민시그마A2153
EDTA 0.5M pH8Gibco15575-038
포름알데히드 용액 37/10 (37%)Chem-SupplyFA010
BD FACS Diva CS& T Research BeadsBD Biosciences655050캘리브레이션 비드
Sphero Rainbow Calibration Particles(8 피크)BD Biosciences5591233.0 - 3.4 mm
Sheath solutionChem-SupplySA04690 g NaCl in 10 L
water HAZ-TabsGuest MedicalH8801소독용 염소 방출 정제
Decon 90Decon Laboratories LimitedN/A유세포 분석기의 농축 세척제. 작업 솔루션 Decon 90 5%.
차아염소산나트륨 (12-13% 용액)LabcoSODHYPO-5L유세포 분석기의 농축 세척제. 작업 용액 표백제 1 %.
7xMPBioIM76670유세포 분석기의 농축 세척제. 작업 솔루션 7x 1%.
NameCompany카탈로그 번호Comments
Materials
Tissue culture plasks (75 cm2, canted neck, cap vented)Corning430641U
조직 배양 플레이트(96웰 플랫 바닥) 뚜껑 포함)Costar3599
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid)Costar3896
Centrifuge tubes (10 mL)SARSTEDT62.9924.284100x16 mm
원심분리기 튜브 (50 mL)CellStar22726130x115 mm
마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 mL)Corning AxygenMCT-150-C
Serological 피펫(25 mL), 멸균CorningCLS4489-200EA
혈청 피펫(10 mL), 멸균CorningCLS4488-200EA
혈청 피펫(5 mL), 멸균CorningCLS4487-200EA
시약 저장용기(50 mL), 멸균CorningCLS4470-200EA
5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관, 셀 스트레이너 캡포함 Corning35223512 x 75mm 스타일, 70mm
나일론 메쉬SEFAR03-100/32100mm
적정 튜브 마이크로 시험관, 벌크BIO-RAD2239391마이크로 튜브
5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관, 캡 없음Corning35200812x75mm 테스트 튜브용 12x75mm
스타일 스냅 캡Corning352032
계수 챔버, Neubauer는 이중 그물 룰링, 브라이트 라인 (적혈구계, LO-Laboroptik)ProSciTechSVZ4NIOU 1mm의 3x3 큰 사각형2; 깊이 0.100mm; 부피 0.1 mL; 최소 면적 0.0025 mm2
Coverslips (Menzel-Glä ser)Grale ScientificHCS202620 x 26 mm
현미경Nikon TMS310528
Centrifuge 5810R, 냉장Eppendorf5811000487로터 A-4-81 포함, 15/50 mL 코니컬 튜브용 어댑터
FLUOstar Omega microplate readerBMG LabtechN/APlate reader. 필터 490nm.
NameCompany카탈로그 번호Comments
Softwares
FACS DivaBD BiosciencesFlow Cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1
FlowJoFlowJoFlowJo 10.4.2유세포 분석기 데이터 분석 프로그램, FlowJo Engine v3.05481
OmegaBMG LabtechFLUOstar 다중 사용자 리더 제어, 버전 5.11
Omega - 데이터 분석BMG LabtechMARSFLUOstar 데이터 분석, 버전 3.20R2
Microsoft ExcelMicrosoftExcel:mac 2011버전 14.0.0
PrismGraphPadPrism 7버전 7.0c
, , , , 세포 증식 분석용

참고문헌

  1. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  2. Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).
  3. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67(2013).
  4. Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
  5. Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
  6. Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
  7. Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
  8. Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
  9. Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
  10. Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
  11. Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
  12. Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
  13. Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071(2014).
  14. Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
  15. Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
  16. Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
  17. Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
  18. Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
  19. Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
  20. Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
  21. Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36(2018).
  22. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  23. Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17(2014).
  24. Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
  25. Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955(2015).
  26. Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
  27. Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
  28. Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
  29. Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60(2011).
  30. Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
  31. Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
  32. Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
  33. Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
  34. Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
  35. Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
  36. Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
  37. Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

HIVLTRHIV
대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.