가장자리 지역 B 세포 (MZBs) 다시 흐름을 그들의 마이그레이션 경로 향하는 여 전단 흐름의 힘에 응답할. 이 프로토콜에는 기록 하 고 분석 응용 장치, 펌프, 현미경 이미징 시스템, 그리고 무료 소프트웨어를 사용 하 여 마이그레이션 방법을 보여 줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
가장자리 지역 B 세포 (MZBs)는 낭 봉투 마우스 비장 한계 영역에 있는 B 세포의 인구. 모 낭에 도달, 혈액 흐름의 전단 힘을 MZBs 마이그레이션 해야 합니다. 선물이 여기 생체 외에서이 흐름 유도 MZB 마이그레이션 분석 하는 방법. 첫째, MZBs 마우스 비장 으로부터 격리 됩니다. 둘째, MZBs 흐름 챔버 슬라이드에서 integrin ligands에 정착, 전단 흐름에 노출 되며 마이그레이션 동안 현미경 이미지. 셋째, 이미지는 마이그레이션할 MZBs의 MTrack2 자동 셀 ImageJ를 위한 플러그인을 추적을 사용 하 여 처리 되 고 결과 셀 트랙 Ibidi chemotaxis 도구를 사용 하 여 정량은. 마이그레이션 데이터 셀 이동 하는 얼마나 빨리, 얼마나 자주 그들은 방향을 변경, 전단 흐름 벡터의 이동 방향에 영향을 미치는 여부 및 어떤 integrin ligands 관련 공개. MZBs를 사용 하 고, 비록 메서드를 쉽게 전단 흐름의 힘에 응답 하는 백혈구의 마이그레이션 분석 하는 데 적용할 수 있습니다.
서론
면역 세포는 인체에서 가장 운동 셀 이며 종종 혈액과 림프 흐름에서 전단 힘에 맞설 해야 합니다. 그러나, 백혈구1,2,3,,45의 전단 힘 유도 마이그레이션에 비교적 몇 가지 연구 있다. 선물이 여기 흐름 체 외에 면역 세포의 응답을 분석 하는 안정적이 고 양적 프로토콜. 수행 하는 분석 결과의 구성 요소, 제조 필요 하지 않습니다 그리고 모든 장비 및 소모품을 상업적으로 사용할 수 있습니다. 프로토콜, 세포 정화 및 마이그레이션 분석을 포함 하 여 하루에 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 한계 영역 B 세포 (MZBs)의 마이그레이션 설명, 비록 프로토콜 마이그레이션 다른 종류의 면역 세포의 흐름에 대해 분석 하 적응 될 수 있다. 따라서, 그것은이 분석 결과 사용 하 여 조건의 종합 패널 백혈구의 광범위 한 범위를 체계적으로 분석 가능 합니다.
MZBs, 마우스에서 발견 되는 비장에 셔틀만 B 세포의 인구는 여 포의 인테리어와 한계 영역
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프로토콜
동물의 사용을 포함 하는 모든 실험은 이전 OVGU 마그데부르크 대학교의 의학 교수진의 모든 지침에 따라 Landesverwaltungsamt 할레 (작센안할트), 독일에 의해 승인 되었습니다.
1. MZB 셀 정화
-
백혈구를 격리 합니다.
- 16 주-오래 된 마우스를 8을 희생 하 고 비장16를 제거 합니다. 얼음 처럼 차가운 셀 버퍼의 5 mL에 비장 해리 [인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) + 0.5% 지방산 무료 소 혈 청 알 부 민 (BSA)], 조직 dissociator를 사용 하거나 부드럽게 6-잘 접시에 잘으로 70 µ m 셀 여과기 메시 통해 비장을 mashing에 의해 5 mL 주사기에서 플런저와.
- 15 mL 원뿔 튜브로 셀 셀 버퍼에 전송 합니다. 조직 dissociator 튜브 또는 우물에서 나일론 메쉬를 얼음 처럼 차가운 셀 버퍼의 또 다른 5 mL을 추가 하 여 추가 셀을 수집 합니다. 셀 버퍼 플러스 셀의 추가 5 mL 원뿔 튜브에 전송. 실 온 (RT, 20 ° C)에서 10 분 동안 300 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
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결과
우리는 마이그레이션 MZBs의 흐름 (0 dyn/cm2) 없이 ICAM-1-코팅 슬라이드에 비교 하 여 위에 약술 된 프로토콜을 사용 하 고 전단 흐름 (4 dyn/cm2)에 노출. 세포는 아무 흐름 (0 dyn/cm2) 및 (4 dyn/cm2) 분포를 보여 셀 마이그레이션 영화와 트랙 (그림 4A)의 모양에 MTrack2, 및 결과 추적 파일이 중첩 된 자동 추적 했다. 셀 트랙 다음 트랙 (그림 4B) 각 영화의 플롯을 생성 하기 위해 Ibidi Chemotaxis 도구 (ICT)으로 수입 했다. 평균 마이그레이션 인덱스 (ICT에서 "FMIy" 라고 함), 속도, 직진도 ("ICT에서 똑 바 름" 이라고 함), 및 4 영화 두 조건이 각각에서 계산 된 셀 트랙의 직선 거리 (ICT .......
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토론
여기 전단 흐름의 힘을 감지 하 고 그들의 마이그레이션 변경 하 여 응답 하는 셀의 마이그레이션 분석 하는 방법을 설명 합니다. MZBs의 분석이 보여주었다 MZBs 마이그레이션 저절로 ICAM-1과 흐름의 존재, 흐름을 마이그레이션할 것입니다. 우리의 이전 작품에서는, 우리는 MZBs VCAM-1에 흐름을 마이그레이션하지 마십시오 하지만 대신 자리에 고정 남아 보였다. Murine 비장 한계 영역 되어 주로 ICAM-1, 빨간 펄프 ICAM-1와 VCAM-1 모두 포함 됩니다. 이러한 데이터에서 MZBs 동안 흐름 빨간 펄프에만 한계 영역을 마이그레이션할 것이 유추 될 수 있습니다. 분석 흐름12의 힘에 의해 비장 빨간 펄프를 mislocalized 했다 결함이 접착으로 MZBs를 사용 하 여 생체 내에서 검증 되었다. 이러한 이유로, MZBs 시스템은 다른 세포 유형 공부에 사용 하는 경우에 여기에 설명 된 흐름 마이그레이션 시스템을 테스트 하기 위한 좋은 긍정적인 제어를 나타냅니다.......
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공개 사항
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
감사의 글
이 작품 K. 시티에 "도이치 가운데" SFB 854/TP11에서 교부 금에 의해 지원 되었다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| VWR 세포 여과기, 70 µ m | VWR | 10199-656 | |
| 사전 분리 필터, 30 &마이크로; m | Miltenyi | 130-095-823 | |
| MZB 및 FOB 세포 분리 키트 | Miltenyi | 130-100-366 | |
| B220 CD45R, 클론 RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 | |
| CD21 / CD 35, 클론 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 | |
| CD23, 클론 B3B4, PE | Biolegend | 101608 | |
| HBSS | Biochrom | L2035 | |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 | |
| BSA 알부민 분획 V, 지방산 무함유 | Roth | "0052.3" | |
| ICAM-1 | R& D Systems | 796-IC-050 | |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, 소수성, 코팅되지 않은 | Ibidi | 80601 | |
| 관류 세트, 흰색, 50cm, 0.8mm | Ibidi | 10963 | |
| Ibidi 펌프 시스템 | Ibidi | 10902 |
참고문헌
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A.
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재인쇄 및 허가
