Candida albicans 인간의 곰 팡이 병원 체 게놈 편집 CRISPR 중재

Candida albicans 는 가장 널리 퍼진 인간 곰 팡이 병원 체^1,2,3. C. albicans 및 포유류 분자 생물학의 이해 차이 항진균 치료제의 다음 세대의 개발에 매우 중요 하다. 신속 하 고 정확 하 게 유전자 조작 C. albicans수를 조사 해야 합니다.

C. albicans 의 유전자 조작 역사적으로 도전 하고있다. C. albicans 플라스 미드를 유지 하지 않습니다, 그리고 따라서 모든 구조는 게놈으로 통합 되어야 합니다. 또한, C. albicans 는 2 중; 따라서, 유전자 밖으로 노크 하거나 소개 하는 돌연변이, 그것 중요 한 경우 되도록 복사본 모두 변경된⁴되었습니다. 또한, 일부 C. albicans loci heterozygous, 더 복잡 한 유전 심문⁵있습니다. C. albicans유전자 조작 동종 재결합⁶의 여러 라운드를 수행 하는 일반적입니다. 그러나, 게놈 및 힘 드는 구조 개발의 2 중 특성이 만들었습니다이 잠재적으로 지루한 과정을, 특히 여러 변경이 필요한 경우. 이러한 제한 및 C. albicans 의 의학 중요성 조사 C. albicans 게놈 보다 쉽게 조작할 수 있도록 새로운 기술 개발을 요구 한다.

정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 클러스터-중재 게놈 편집 연구자는 게놈의 순서를 변경할 수 있는 강력한 도구입니다. CRISPR 세 가지 구성 요소가 필요 합니다: 대상 DNA 앞 1) Cas9 nuclease 2) 20 시퀀스, 관심의 대상으로 Cas9 가이드 RNA를 기반 및 3) 복구 템플릿 DNA 분열 사이트를 복구 하 고 만들어진된 변경^{7, 통합 하는 8}. 일단 가이드 제공 대상 게놈 시퀀스 Cas9, Cas9 protospacer 인접 한 모티브 (PAM) 시퀀스 (NGG) 필요 직접 DNA⁹다니엘 가이드 시퀀스의 업스트림. 모두 20 기본 가이드 및 팸 시퀀스 특이성을 표적으로 하기의 높은 학위를 제공 하 고 제한 대상에서 분열.

CRISPR 시스템은 다양 한 생물의 게놈 편집과 다양 한 문제¹⁰태 클을 설계 되었습니다. 여기에 설명 된 관심사의 C. albicans 유전자를 편집 하기 위해 유연 하 고 효율적인 CRISPR 프로토콜이입니다. 실험 번역 종료를 일으키는 원인이 되는 유전자를 정지 codon를 소개 합니다. 다른 편집 도입 수리 템플릿에 따라 만들 수 있습니다. 조각 nourseothricin (Nat^r)로 표시 된 효 모에 포함 된 코 돈 최적화 된 Cas9 (CaCas9)과 가이드 RNA 중립 사이트에서 C. albicans 게놈으로 통합 됩니다. Cotransformation 복구 서식 파일 인코딩을 원하는 돌연변이와 동종 재결합 하 고 효율적인 게놈 편집 분열의 복구 이끌어 낸다. 아래에서 설명 하는 것은 TPK2, 하지만 모든 C. albicans 오픈 프레임 대상으로 지정할 수 여러 번 CRISPR에 의해 읽기의 편집 이다. CRISPR 시스템 FRT 사이트에 의해 형벌 이다 고 flippase CaCas9 식 플라스 미드에 인코딩된의 유도 의해 C. albicans 게놈에서 제거할 수 있습니다. C. albicans CRISPR 시스템에는 정확 하 고 빠르게 편집 C. albicans 게놈^11,12조사 수 있습니다.

1. 식별 및 가이드 RNA 시퀀스의 복제

1. 가이드 RNA 시퀀스의 식별
   1. 5'-NGG-3 식별 ' 정지 codon 삽입 되는 위치에 가까운 팸 시퀀스. (그림 1A) 표시 된 팸 시퀀스 모두에서 발견 된다 TPK2 (그림 1A)의 처음 100 기본적인 쌍.
      참고: Http://osf.io/ARDTX ^11,12각 C. albicans 열려있는 독서 프레임을 대상으로 하는 가이드 시퀀스를 찾을 수 있습니다.
   2. 20 있을 것입니다 앞으로 가이드 Primer_3 시퀀스 식별 기지 직접 상류 NGG 팸의 사이트 및 5 개 이상 포함 되지 것입니다 연속에서 Ts. 직접 기초에 왼쪽 상류 끌어서 NGG의 커서 20 기초, 다음 추가 뇌관 뇌관 탭에 클릭.
   3. 앞으로 가이드 시퀀스에 보완 될 것입니다 반대로 가이드 Primer_3 시퀀스를 식별 합니다.
      참고: PAM_3를 사용 하는 가이드는 표시 (그림 1B).
   4. 뇌관을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 "뇌관 데이터 복사" 선택 합니다. 텍스트 편집 프로그램에는 시퀀스를 붙여 넣습니다.
2. (표 1, 그림 1B) 복제를 촉진 하기 위하여 앞으로 반전 가이드 oligos에 걸리다 시퀀스를 추가 합니다.
   1. 구입 하기 전에 앞으로 가이드 Primer_3의 5' 끝에 뉴클레오티드 순서 ATTTG를 추가 합니다.
   2. 구입 하기 전에 앞으로 가이드 Primer_3의 3' 끝에 G를 추가 합니다.
   3. 구입 하기 전에 반전 가이드 Primer_3의 5' 끝에 뉴클레오티드 순서 AAAAC를 추가 합니다.
   4. 구입 하기 전에 반전 가이드 Primer_3의 3' 끝에 C를 추가 합니다.
3. BsmBI와 다이제스트 CaCas9 식 벡터 pV1524입니다.
   참고: pV1524 포함는 암 피 실린 (앰프^r)과 nourseothricin (Nat^r). Cas9 C. albicans코 돈 최적화 되었습니다.
   1. 추가 하 여 플라스 미드를 소화: pv1524, 버퍼 x 10의 5 μ, BsmBI, 그리고 H의 1 μ의 2 μ g을 1.5 mL 튜브에 50 μ₂O. 20 분 55 ° C에서 품 어 (또는, pv1524 Esp3I, 37 ° c.에 BsmBI의 isoschizomer와 함께 15 분 소화)
   2. 실내 온도 (RT) 고 스핀 30에 대 한 튜브의 하단에 응축을가지고 2,348 x g 에서 s. 1.4 단계로 진행 또는-20 ° c.에 소화 플라스 미드를 저장
4. 인산 가수분해 효소 소화 등뼈를 취급 합니다.
   1. 종 아리 장 인산 가수분해 효소 (CIP)의 1 μ 소화 혼합물에 추가 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
   2. 상업적으로 사용할 수 있는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 정화 키트 (키트와 함께 제공 하는 지침)를 사용 하 여 소화 플라스 미드 정화 하 고 차입 버퍼 (EB)의 30 μ에 elute.
5. Phosphorylate 고 anneal 가이드 Primer_3 앞으로 반전 가이드 Primer_3.
   1. 추가 앞으로 100 μ M의 0.5 μ 가이드 Primer_3, 100 μ M의 0.5 μ 가이드 Primer_3 역, 10 x T4 리가 버퍼의 5 μ, T4 polynucleotide 키의 1 μ 및 H₂O를 PCR 튜브의 43 μ.
   2. 두 번째 PCR 튜브에서 10 x T4 리가 버퍼의 5 μ, T4 polynucleotide 키의 1 μ 그리고 분자 생물학 급 H₂O의 44 μ를 추가 합니다.
      참고: 이 부정적인 제어 될 것입니다.
   3. 다음 5 분 동안 95 ° C에서 30 분 동안 37 ° C에서 thermocycler에서 반응 혼합물을 품 어.
   4. Anneal에 16 ° C에 느린 경사로 속도에 혼합물을 냉각, oligos. 다음 4 ° c.에 단련 된 oligo 혼합물을 놓습니다
6. 1.4.3 단계에서 소화 pv1524로 단련된 oligos를 선.
   1. PCR 튜브에 다음을 추가: 10 x T4 리가 버퍼, T4 DNA 리가의 0.5 μ, 단련된 올리고 믹스의 0.5 μ 1 μ CIP 처리 소화 플라스 미드 (20-40 ng) 및 H₂O 10 μ 총 볼륨을 정화.
   2. PCR 튜브에 다음을 추가: 10 x T4 리가 버퍼, T4 DNA 리가의 0.5 μ의 1 μ 소화 CIP 처리 정화 벡터 (20-40 ng), 부정적인 컨트롤 혼합, 그리고 H₂O 10 μ 총 볼륨 최대의 1 μ.
   3. 다음 10 분 동안 65 ° C에서 30 분, 16 ° C에서 thermocycler 두 튜브를 품 어 다음 25 ° c에 냉각
7. 결 찰 혼합물의 5 μ를 화학적으로 유능한 병원 성 대장균 DH5α 표준 열 충격 변환 프로토콜을 사용 하 여 변환 합니다. LB 앰프/Nat 미디어 (200 μ g/mL 앰프, 50 μ g/mL Nat) 선택 합니다.
   참고: PV1524와 더블 선택 미디어에 파생 상품 선택 실패 Nat/CaCas9/가이드 모듈의 손실 FLP/FRT 절단 박테리아에 의해 발생 합니다.
8. Miniprep에 의해 4 개의 transformants에서 플라스 미드를 정화 하 고 시퀀싱 뇌관 (표 1) 삽입 시퀀스를 시퀀스.
   참고: 4 transformants를 시퀀싱 하는 시간의 대부분 적어도 1 정확한 복제를 식별 하기 위해 충분 하다.
9. 잘라-20 ° c.에 사이트 BsmBI에 한 번 복제 가이드 RNA 순서 있는 플라스 미드를 저장

2. 설계 및 수리 서식 파일의 생성

1. 유전자 시퀀스에 정지 codon 및 제한 소화 사이트 (그림 1C표 1) 인코딩 뉴클레오티드를 추가 하 여 정지 codon를 삽입 합니다.
   참고: 삽입 팸 시퀀스를 중단 됩니다.
   참고: 제한 소화 사이트 클론 (그림 1C)의 효율적인 심사를 용이 하 게 복구 템플릿 순서로 포함 됩니다.
2. 10 돌연변이 만들 수의 하류 기초 끌어서 커서 60 기초 상류 왼쪽 클릭 하십시오. 추가 뇌관 뇌관 탭에서 왼쪽 클릭 하십시오. 이 복구 템플릿 Forward_3을 추가 합니다. 10 돌연변이 만들 수의 상류 기초 끌어서 커서 60 기초 하류 왼쪽 클릭 하십시오. 추가 뇌관 뇌관 탭에서 왼쪽 클릭 하십시오. 복구 템플릿 리버스 3 추가 됩니다. (그림 1C)
3. 뇌관 연장 수리 서식 파일 생성을 수행 합니다.
   1. 100 μ m 복구 템플릿 앞으로 뇌관, 100 μ m 복구 템플릿 리버스 뇌관의 1.2 μ, deoxynucleotide 된 (dNTPs)의 6 μ의 1.2 μ 추가 (총 농도 40 m m), 6 버퍼, Taq 중 합 효소 (3 단위)의 0.6 μ H₂O 4 PCR의 각각의 45 μ의 μ 튜브입니다.
   2. 뇌관 연장 PCR의 20과 30 라운드 사이의 실행을 수행 합니다. 예제 확장 조건: 95 ° C에서 2 분 (30 s 95 ° C, 50 ° C, 68 ° C에서 1 분에 1 분에서) x 34, 68 ° c.에서 10 분
   3. 1.5 mL 튜브에 모든 4 PCR 튜브의 내용을 결합 하 고 PCR 정화 키트를 사용 하 여 H₂o.의 50 μ에서 제품을 정화
   4. 뇌관 연장 제품 260에서 흡 광도 결정 하 여 충분 한 DNA를 확인을 quantitate nm.
      참고: 뇌관 연장 제품의 전형적인 마지막 농도 ~ 200-300 ng / µ L.

3. C. albicans 복구 템플릿 및 플라스 미드의 변화

1. 테/리튬 아세테이트를 확인 합니다.
   1. 믹스 10 mM Tris Cl, 1 mM EDTA, 100 m m 리튬 아세테이트, 그리고 H₂O (모든 재고 솔루션 pH 7.5) 50 mL 전체 볼륨을 달성 하기 위해.
2. 플레이트 만들기
   1. 믹스 40% 말뚝 3350, 100 m m 리튬 아세테이트, 10 mM Tris Cl, 1 mM EDTA, H₂O (모든 재고 솔루션 pH 7.5) 50 mL 전체 볼륨을 달성 하기 위해.
3. 소화 단계 1.9에서에서 올바르게 복제는 플라스 미드.
   1. 플라스 미드, 10 x 버퍼의 4 µ L, 10 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 0.4 µ L의 10 μ g, 0.5 µ L KpnI의, SacI의 0.5 µ L 및 H₂0 ~ 40 µ L 총 1.5 mL 튜브에 볼륨. 37 ° C에서 하룻밤 (그림 1D) 품 어.
4. C. albicans SC5314, 야생-타입 prototroph OD₆₀₀ 6 미만 이상적으로 0.27 m m Uridine (YPD + Uri), 보충 효 모 펩 포도 당에서 25 ° C에서의 숙박 문화를 성장.
   1. 2,348 x g 에 5 분 동안 회전 하 여 5 세₆₀₀ 단위 변환 당 세포의 작은 고 5 세₆₀₀ 100 µ L 테/리튬 아세테이트에 수송과 셀의 중단.
5. 나열 된 순서로 1.5 mL 튜브에 다음을 추가: 단계 3.4.1, 삶은 고 빠른 냉각 연어 정자 DNA (10mg/mL), 플라스 미드 소화 단계의 3.3.1, 순화 된 복구 서식 4) 6 µ g의 3) 10 µ g의 2) 40 µ L에서에서 세포의 1) 100 µ L 및 5) 접시의 1 mL.
6. 나열 된 순서로 1.5 mL 튜브에 다음을 추가: 셀의 1) 100 µ L, 삶은 고 빠른 냉각 연어 정자 DNA (10mg/mL), 3) H₂O 볼륨 단계 3.5 판의 4) 1 mL에서 DNA 변형의 동등의 2) 40 µ L.
   참고:이 부정적인 제어 될 것입니다.
7. Pipetting으로 변환을 부드럽게 혼합 하 고 하룻밤 25 ° C에서 품 어 보자.
8. 열 44 ° C 물 목욕 25 분에 배치 하 여 세포를 충격.
9. 벤치탑 원심 분리기에서 2,348 x g 에 5 분 동안 회전 시키십시오 하 고 표면에 뜨는 접시 혼합물을 제거 합니다. 2,348 x g에서 YPD + Uri와 다시 5 분 동안 원심 분리기의 1 mL을 추가 하 여 한 번 세척.
10. 0.1 ml YPD + Uri의 세포를 중단 하 고 하룻밤 롤러 드럼 또는 25 ° C에서 셰이 커에 품 어.
11. 플레이트와 200 μ g/mL nourseothricin YPD + Uri에. 식민지는 2-5 일에 표시 됩니다.

4입니다. 단일 식민지를 위한 줄무늬

1. 분기에는 100 x 15 mm 페 트리 접시를 분할 하 고 각 사분면을 라벨.
   1. 사분면의 긴 측면에 걸쳐 메 마른이 쑤 시 게 또는 주걱와 행진 변환 접시에서 식민지 중 하나를 터치 합니다.
   2. 무 균 기술을 사용 하 여 단일 식민지를 위한 streak 고 30 ° C에서 2 일 동안 성장 식민지.

5입니다. 식민지 PCR

1. 앞으로 체크 뇌관 (FCP) ~ 200 기지 상류의 쌍 도입 된 제한 사이트 및 역방향 체크 뇌관 (RCP) ~ 300 자료 쌍 하류 디자인.
   1. FCP, RCP, 내 중 합 효소 (ExTaq 1.5 단위)의 0.3 μ, dNTPs의 3 μ의 0.3 μ의 0.3 μ 추가 (총 농도 40 m m), 3 ExTaq 버퍼, 그리고 H₂O 1.5 mL 튜브에의 23 μ의 μ.
      참고: 0.5 μ/반응 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 추가 PCR 효율을 개선할 수 있습니다.
   2. 4.1.2 단계에서 단계 5.1.1, P10 피 펫 팁을 사용 하 고는 agar를 방해 하지 않도록 주의 복용에서 혼합물 단일 효 모 식민지의 0.25 μ를 추가 합니다.
   3. PCR에 의하여 DNA를 증폭 하 고 증폭 성공, 튜브의 아래쪽에 셀 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용 되도록 젤에 PCR의 5 μ를 실행 합니다.

6. 식민지 PCR의 제한 소화

1. 추가 10 μ의 PCR 제품 (튜브의 아래쪽에 셀 펠 렛을 방해 하지 않기로 돌), 버퍼의 3 μ, 제한 효소, 1 μ H₂O, 16 μ 그리고 제조업체의 지침에 따라 품 어 리를 식별 하는 agarose 젤에 해결 ct 게놈 편집입니다.
   참고: 여기에서 사용 하는 제한 효소 TPK2 특정 복구 서식 파일에 인코딩 하는 사이트입니다.

7. 종자 저장

1. 성장 제한 소화 YPD + Uri에서 30 ° c.에 의해 확인 된 식민지에서 숙박 문화
2. 스토리지-80 ° c.에 대 한 적합 한 튜브를 1 mL의 문화 및 (글리세롤의 최종 농도 25%를 데리고) 50% 글리세롤의 1 mL을 추가
3. -80 ° c.에 정확한 복제품을 저장하시오
   참고: 올바른 종자 몇 년 동안-80 ° C에 저장할 수 있습니다.

8. Nat^r 마커 제거

1. 효 모 펩 糖 (YPMaltose)에 올바른 transformant 행진 (2% 糖).
2. 질주 된 접시에서 식민지를 선택 하 고 액체 YPMaltose 20 g/L 맥 아당에서 30 ° C에서 48 h에 대 한 효 모 문화.
3. YPMaltose 20 g/L 맥 아당에 200-400 셀 접시 하 고 24 시간에 30 ° C에서 품 어.
4. YPMaltose 및 YPMaltose 200 μ g/mL 자연과학에 접시를 복제
5. 24 h 30 ° C에서 품 어.
   참고: 더 이상 YPMaltose 200 μ g/mL nourseothricin에 성장 하지만 YPMaltose에 성장 식민지 Nat^r 마커 (CaCAS9)을 잃 었 하 고 RNA를 안내 합니다.
6. Nat^r 마커 (CaCAS9) 및 가이드 RNA 7.1-7.3 단계에서 다 잃은 긴장을 저장 합니다.
   참고: 유사한 플라스 미드, pV1393, SAP2 MAL2 promotor 반대로 사용합니다. YCB-BSA에 성장 pV1393 유전자 편집에 사용 되는 경우 flippase 및 Nat^r 의 제거를 유발 한다.

시퀀스의 가이드 C. albicans TPK2, 대상 복구 서식 파일 및 RNAs c 앰프 니 촉매 소 단위, 위에 제안한 지침에 따라 설계 되었습니다. 시퀀스 (표 1, 그림 1)에 표시 됩니다. 가이드 RNAs CaCas9 식 벡터에 복제 되었고 야생-타입 C. albicans서식 파일 복구 cotransformed. 에코리 제한 소화 사이트 복구 서식 파일에서 정지 codons 팸 사이트 중단 및 올바른 돌연변이 (그림 1)에 대 한 심사를 용이 하 게. Transformants 단일 식민지를 위한 줄무늬 그리고 복구 템플릿 (그림 2)의 설립에 대 한 식민지 PCR 및 제한 소화에 의해 상영. 제한 소화는 신속 하 게 돌연변이 시퀀스에서 야생-타입을 구분합니다.

표 1:이 연구에 사용 하는 올리고 뉴클레오티드의 목록. 사이트 목적 복제에 대 한 추가 대문자로 하 고 가이드 뇌관에 굵게 시퀀스. 게놈 DNA를 변형 복구 서식 파일에서 시퀀스는 대문자로 하 고 굵게.

그림 1 : 가이드 RNA 및 복구 템플릿 디자인의 다이어그램. (A)의 TPK2의 처음 100 개의 뉴클레오티드의 모든 PAM 시퀀스 표시. 이 연구에서 사용 하는 순서는 팸 시퀀스 3 (PAM_3) 강조 표시 됩니다. (B) 가이드 RNA PAM_3를 사용 하 여 디자인 합니다. SnapGene를 사용 하 여 디자인의 기본 뇌관 20 개는 소문자 파란색입니다. 복제에 필요한 추가 기지 오프셋 표시와 녹색 있습니다. (C) 수리 TAA 정지 codon 및 에코리 사이트 템플릿 뇌관 TPK2 독서 프레임에 삽입 됩니다. 야생-타입 시퀀스와 다른 DNA는 빨간색과 대문자. (D) 예 방법 가이드는 PAM_4를 사용 하 여 DNA의 긍정적인 물가에 설계 되었습니다. (E) 가이드 RNA와 KpnI와 SacI 소화의 복제 후 pV1524의 회로도. Neut5L-5'-Neut5L-3' C. albicans 게놈에 있는 Neut5L 사이트에 벡터를 대상. CaENO1p promotor를 누 룩에 최적화 된 CaCas9의 표현 이다. Natr nourseothricin 저항 카세트입니다. CaSNR52p promotor 운전 가이드 RNA 식 (sgRNA) 이다. FRT 사이트 죽 습 고 flippase (FLP) flippase 식 시 CRISPR 카세트를 제거 하 여 재결합. 회로도 (E)와 유사한 Vyas 외에 의해 출판 되었다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 소개 및 정지 codon 그리고 에코리 제한 사이트 TPK2를 확인. 뇌관 증폭에 사용 되는 표 1에 나열 됩니다. 야생-타입 및 돌연변이 시퀀스 젤 아래 표시 됩니다. 이 그림은 Vyas 외.11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 삭제 (A) 및 (B) 삽입 생성 복구 템플릿 설명 만화. 회색 (A)에 대시 묘사 중간 시퀀스 복구 템플릿 뇌관에는 없음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

저자는 공개 없다.