방법 논문

유전자 치료 DNA 종이 접기 Nanostructures의 보호를 위한 Polycation 코팅을 영감

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⸱

DOI:

10.3791/58771

⸱

2019년 1월 19일

 , 
1Molecular Diagnostics, Centre for Health and Bioresources, AIT Austrian Institute of Technology GmbH

이 논문에서

요약

여기, 키토 산 천연 양이온 다 당 류 및 합성 선형 polyethyleneimine (LPEI) 코팅을 사용 하 여 Mg 고갈 및 nuclease 리치 미디어에서 DNA 종이 접기 nanostructures의 보호를 위한 프로토콜 제공 됩니다.

초록

DNA 종이 접기 nanostructures 생물학 및 의료 응용 프로그램에 사용할 수 있는 엄청난 잠재력을 보유. 그러나, 낮은 소금 조건과 생리 적 체액에서 nucleases 유도 자기 조립된 DNA nanostructures의 저하 및 변성. 비 바이러스 성 유전자 전달, DNA의 효소 저하 양이온 셸에서 부정 청구 DNA의 캡슐화에 의해 극복 이다. 여기, 유전자 배달 발전, 단순 하 고에 의해 영감을 한 단계 및 강력한 방법론은 제시한 DNA 종이 접기 nanostructures의 안정화에 대 한 chitosan와 선형 polyethyleneimine 코팅. Polycation 코팅 Mg 고갈 및 nuclease 리치 미디어에서 DNA 종이 접기 nanostructures를 효율적으로 보호합니다. 이 메서드는 또한 DNA nanostructures의 효소 및 aptamer 기반 기능화의 전체 접근성을 유지합니다.

서론

DNA는 자기 조립 나노 구조1의 프로그래밍에 대 한 다양 한 빌딩 블록 이다. DNA nanostructures를 만들기 위한 가장 인기 있는 방법은 DNA 종이 접기 기술에 근거 하는 자기 조립 긴 원형, 단일 좌초 된 DNA의 짧은 모양 결정 합성 스테이플의 수백의 도움으로 비 계2가닥. 오늘, 거의 모든 형상과 형태에서 DNA nanostructures의 생성은 쉽게 가능 합니다. DNA nanostructures 높은 정밀도3,4 site-specifically functionalized 수 고 allosteric 구조적 변화5,6을 프로그래밍할 수 있습니다. 따라서, DNA를 사용 하 여 건축 자재로 바이오 센 싱, 진단 및 약물 전달에 응용 프로그램, 프로그래밍 가능 하 고 반응이 맞춤형 nanostructures를 만드는 독특한 기회를 제공 합니다. 그러나, DNA nanostructures는 엑 소-및 엔도소화에 취약-nucleases, 및 격자 기반 3D DNA 종이 접기 nanostructures 일반적으로 높은 염 분 버퍼 필요 (예., 5-20 m m Mg+ 2)을 유지 하기 위해 그들의 무결성7,8.

Nucleases 혈액과 세포 외 매트릭스에 의해 DNA의 급속 한 저하 효율적인 vivo에서 납품에 유전자 제품의 셀9에 중요 한 장애 이다. 비 바이러스 성 유전자 전달에서이 제한을 극복 하기 위해 DNA는 정의 된 충전 N/P 비율 (DNA에서 인산 염을 polycation에 있는 아민의 비율)10에서 양이온 폴리머 혼합입니다. 양이온 중합체, polyplex로 알려진 DNA의 복합 nuclease 중재 저하에서 DNA를 보호 하 고 그것의 세포질 통풍 관11를 향상 시킵니다. 유전자 전달 발전, oligolysine12, oligolysine-폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 공중 합체13, 폴 리 (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)에 의해 영감-기반 고분자14및 바이러스 capsid 단백질15 DNA 종이 접기 nanostructures 안정화에 대 한 사용 되었습니다.

최근, 우리 DNA 종이 접기 nanostructures Mg 소진에 보호 하는 방법을 보고 하 고 천연 양이온 다 당 류 키토 산 및 합성 선형 polyethyleneimine (LPEI)를 사용 하 여 nuclease 리치 미디어는 보고16. 이 문서는 우리의 이전 작품의 적응 이다 하 고 polyplexes, 그들의 특성, 낮은 소금 및 nuclease 리치 미디어에서 적나라 하 고 보호 nanostructures의 안정성 테스트 및 검사의 준비에 대 한 자세한 프로토콜에 설명 합니다는 polycation 코팅 시 효소 및 aptamer 기능성된 DNA 종이 접기 nanostructures의 접근성.

프로토콜

1. 준비 Polycation 재고 솔루션

  1. LPEI 재고 솔루션
    1. LPEI의 포함 하는 유리 비 커에 10 mg을 추가 < H2o.의 10 mL
    2. 완전히 분해 LPEI, pH 2.0에 도달까지 HCl (32%)를 추가 합니다.
    3. NaOH (10 M)를 추가 하 여 7.0에 pH를 조정 합니다.
    4. 1 mg/mL의 최종 농도에 볼륨을 조정 합니다.
    5. LPEI 재고 솔루션 0.22 μ m 세포 막을 통해 여과.
  2. 키토 산 재고 솔루션
    1. 16.6 m g 키토 산 올리고 당 젖 산의 분해 (Mw




  7. figure-protocol-1


    figure-protocol-2


    figure-protocol-3




  4. figure-protocol-4


    figure-protocol-5




결과

다른 구성의 3 개의 DNA 종이 접기 nanostructures 하이퍼 (NR), nanobottle (NB)와 (는 nanostructures의 3D 모델은 그림 2에 나와 있는) 와이어 프레임 nanostructure (WN)을 포함 하 여 설계 되었습니다. NR 및 주의 설계 된 광장과 벌집 격자에 따라 각각, Daedalus 소프트웨어18를 사용 하 여 만들어진 caDNAno17 WN을 사용 하 여. 포괄적인 프로토콜을 디자인 하 고 DNA nanostructures의 자기 조립 되었습니다 이미19,20,,2122출판. 모양 관련 주식 가닥 주문, 자기 조립 되었고 더 정화 스탈 외에 의해 설명 하는 프로토콜에 따라. 23 (2 단계)입니다.

Polyplexes 젤 지체 분석 결과 및 nsTEM 영상 특징 이었다. DNA 종이 접기는 polycations, 혼합 시 음극 쪽으로 벌 거 벗은 nanostructure 밴드에 변화 (그림 1A) 관찰 되었다. 이것은 인산 염 그룹에 바인딩 polycations 및 전체 크기에 따라 단지의 증가의 네거티브 차지의 상계를 지정할 수 있습니다. Dextran 황산 같은 polyanions의 추가 금액을 추가 하는 것은 polyplex 형성을 변경할 수 있습니다. 이 점에서 더 높은 분자량의 dextran 황산 (MW ~ 40 kDa) 더 낮은 분자량 dextran 황산 염에 비해 decomplexation에 대 한 효율적으로 보였다 (MW ~ 4 kDa) (그림 1B).

Uranyl 아세테이트 부정적인 얼룩 가장에 의해 LPEI polyplexes 이미징, 하는 동안 어떤 입자의 이미지를 어려웠다. 그것은 가설 되었다 그 LPEI DNA 종이 접기의 꽉 실드 때문에 인산 염 등뼈를 바인딩에서 uranyl 아세테이트를 방해할 수도 있습니다. 따라서, nsTEM 이미징, 이전 dextran 황산의 초과 금액은 LEPI polyplexes에 추가 되었습니다. Unraveled DNA 종이 접기 nanostructures 결함도 분해의 흔적을 보여주었다. 반대로, 키토 산 polyplexes polyanion 치료 (그림 2)에 대 한 필요와 함께 성공적으로 몇 군데 있었다.

NsTEM 영상에 의해 확인 (그들의 다른 구성)에 관계 없이 모든 벌 거 벗은 DNA nanostructures Mg 0 버퍼에서 37 ° C에 외피의 1 일 후 완전히 변성 했다. 대조적으로, LPEI 또는 N/P≥1에서 키토 산 코팅 nanostructures 그대로 남아. 마찬가지로, DNase I 적정 분석 실험 효소 소화도 보호 되지 않은 nanostructures의 민감성을 보여주었다. 알몸 nanostructures 했다 완전히 내가 2 h, LEPI 또는 키토 산 캡슐 DNA 종이 접기 후에 그대로 남아 1 U/mL DNase 존재 소화 하는 동안 밀리 그램-0 버퍼 보충 10 U/mL DNase 나 최소 1 일 (그림 2). Nucleolytic 소화도 높은 안정성은 polyplexes의 N/P 비율을 증가 하 여 달성 되었다. 또한, LPEI 보호 (그림 3A, 그림 3C), 키토 산에 비해 효율적으로 더 많은 DNA nanostructures 아마 LEPI, 그리고 이렇게, 더 높은 친화 력을 바인딩 DNA24 쪽으로 더 높은 충전 밀도 때문 . 다른 분자량의 LPEI를 사용 하는 동안 차이가 관찰 되었다 (그림3B).

폴리머 셸에서 캡슐화 후 DNA nanostructures의 기능적인 그룹의 접근성은 중요 한 기능입니다. 또한, 양 고추냉이 과산화 효소 효소 (HRP)와 hemin 바인딩 aptamers (HBA) 기능성된 DNA 종이 접기 polycation 코팅의 호환성 시험 되었다. 3 biotinylated 주식 가닥 NR의 표면에서 protruded 되었고 HRP 활용 streptavidin (3 효소 DNA 종이 접기 당)와 기능성. 촉매로 높은 활성 (Kd: 439 nM) HBA aptamer PS2. M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3')이 실험25에 대 한 선정 되었다. 24 주식 가닥까지 5 nm 길이 링커 함께 NR 표면에서 protruded 했다 (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3')는 p s 2에 의해 따라. M 시퀀스 (24 aptamers DNA 종이 접기 당). 효소의 놀라운 방해 없음 또는 aptamer 활동 HRP 또는 HBA 기능성된 DNA 종이 접기 LPEI와 변형 N/P 비율 (그림 4A-B)16에서 키토 산 코팅 시 관찰 되었다. 그러나, HRP 효소의 활동적인 극적으로 변경 되었습니다 바인딩을 DNA 종이 접기 (그림 4C) 후.

figure-results-1
그림 1 : Polyplex 형성과 decapsulation의 대표 나이 이미지. (A) 키토 산 0.01-8의 N/P 비율에 혼합 주의 대 한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험. 각 레인 1 nmol NB. 포함 첫 번째 차선은 NB. 참조 (B) Decapsulation polyanionic dextran 황산 (DS)에 의해 polyplexes의. 이 그림은 이전에 게시 그림16에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-2
그림 2 : DNA 종이 접기 및 polyplexes의 부정적인 얼룩 TEM 현미경 사진. 벌 거 벗은 DNA 종이 접기 nanostructures (열 1과 2)의 3D 모델과 nsTEM 현미경. nsTEM LPEI polyplexes (후 decapsulation) 및 키토 산 polyplexes (열 3, 4)의 현미경 사진. nsTEM 이미지 벗고 보호 된 DNA 종이 접기 (polyplex)의 대상이 Mg 고갈 (열 5, 6 및 7), 효소 저하 (열 8, 9), 37 ° c.에 1 일에 대 한 혈 청 소화 (열 10, 11) LPEI-5 kDa는이 분석 결과에서 사용 되었다. 내가 1 U/mL DNase의 나이에 검출 넘어 벌 거 벗은 DNA nanostructures 타락 했다 또는 TB + 10%에서 37 ° c.에 외피의 2 시간 후 FBS 스케일 바: 100 nm. 이 그림은 이전에 게시 그림16에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-3
그림 3 : DNase의 대표적인 결과 나 보호 분석 실험. (A) 는 DNase I LPEI-5 kDa, LPEI-10 kDa와 2, 4, 8 및 10의 N/P 비율로 준비 LPEI-25 kDa WN의 polyplexes에 대 한 분석 결과 보호. 샘플 10 U/mL DNase를 복종 되었다 37 ° c.에 24 h에 대 한 나 마지막 레인 WN 컨트롤입니다. polyplexes decapsulated 이전에 젤에 로딩 했다. (B) 다른 DNA origamis의 polyplexes에 대 한 정규화 된 뜻 밴드 강도 LPEI 나 이미지-.가 추출 Y 축 정규화 의미 밴드 강도를 나타냅니다. (C)는 DNase I 키토 산-WN polyplexes의 보호 시험 준비 N/P 1, 2, 4, 10, 20의 비율. 샘플 10 U/mL DNase를 복종 되었다 37 ° c.에 24 h에 대 한 나 레인 6 제어 polyplex (N/P 20) 이다. 마지막 레인 WN 컨트롤입니다. 모든 키토 산 polyplexes decapsulated 젤으로 사전 로드 했다. 이 그림은 이전에 게시 그림16에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-4
그림 4: 대표 색도계 효소-및 aptamer-기능성된 DNA 종이 접기 분석 실험의 결과. (A) 효소 기능성된 nanostructures (HRP-NR) 키토 산 3.7 h 반응 시작 후 코팅의 색도계 분석 실험. Aptamer 기능성된 nanostructures (HBA-NR) 키토 산, 반응 개시 후 6 분 코팅의 색도계 분석 결과 (B) . Y 축은 정규화 된 흡 광도를 나타냅니다. (C) 시간이 지남에 HRP와 HRP-NR의 색도계 분석 결과 모니터링합니다. 이 그림은 이전에 게시 그림16에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

양이온 중합체키토 산LPEI-5 kDaLPEI-10 kDaLPEI-25 kDa
폴리머 (kDa)의 분자량551025
단위체 (g/mol)의 Molecualr 무게161434343
단위체 당 아민의 수1111
폴리머 당 아민의 수28116232581

표 1입니다. Polycation 당 아민 그룹의 수를 계산합니다.

Dextran 황산 (kDa)의 분자량440
단위체 (g/mol)의 분자량366366
단위체 당 황산의 수22
폴리머 당 황산의 수22220

표 2입니다. Polyanion 당 황산 염 그룹의 수를 계산합니다.

토론

에 자기 조립 DNA 종이 접기의 주식 물가 일반적으로 추가 5-10 초과 비율에 발판. 이러한 초과 주식 가닥도는 polycation 및 polyplexes monometer 범위에서 DNA 종이 접기 polyplexes에서 분리 하기가 더는 바인딩할. 따라서, polyplex 형성에 중요 한 단계는 초과 주식 가닥을 제거 하 고 잘 순화 된 DNA 종이 접기 nanostructures 사용입니다.

다른 방법은 통해 클릭 반응26DNA 가닥의 cyclization 같은 DNA nanostructures 안정화에 대 한 개발 되었습니다. 이 기술은 작은 nanostructures 같은 DNA catenane의 안정화에 대 한 제한 되며 그것은 쉽게 큰 DNA 종이 접기에 대 한 확장 가능한 주식 가닥 alkyne 아 지 드 수정 연동된 단일 가닥 링의 대형을 위한 필요는, 이 프로토콜에 사용 된 같은 구조. 최근, Gerling 동부 표준시는l.27 보고 DNA nanostructures 자외선 방사선 조사를 사용 하 여 내 이웃 thymidines 사이 화학식 cyclobutene pyrimidine 이합체 (일일) 채권을 만들기 위한 방법. 비록이 방법 사이트 선택 하 고 확장 가능한 DNA 종이 접기 보호의 효율은 polycation 코팅 보다 훨씬 낮은. 예를 들어 일일 비용 안정화 DNA 종이 접기 개체 견딜만 0.4 U/mL DNase 내가 1 시간 동안 polyplexes 안정 10 U/mL DNase 존재 나 적어도 하루에 대 한.

간단히, 유전자 치료 영감 키토 산 및 LPEI 코팅은 낮은-비용, 단계 및 Mg 고갈 및 nuclease 리치 미디어에서 DNA 종이 접기 nanostructures의 장기 안정성을 해결 하기 위해 효율적인 방법. Polyplex 대형의 가역 다단계 진단 테스트 nucleolytic 저하 또는 소금 고갈에 대 한 DNA 접기의 보호 한 단계에서 매우 중요 하지만 다른 DNA 단계에서 문제가 발생할 수 있습니다에서 응용 프로그램을 용이 하 게 증폭입니다. 또한, polycation 코팅은 약물 전달 응용 프로그램28DNA 종이 접기 nanostructures의 세포질 통풍 관을 강화 하기 위한 잠재적인 접근 이다.

공개 사항

저자는이 보고서와 관련 된 관심 없음 충돌 선언 합니다.

감사의 글

이 프로젝트는 부여 계약 번호 686647에서 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램에서 자금을 받았다. 가장 이미지 Morgagni 80에서 운영 하는에 기록 되었다 kV EM 시설에서 비엔나 Biocenter 코어 시설 GmbH (VBCF는)의. 우리는 와이어 프레임 nanostructure 디자인 그래픽 디자인 및 Elisa 드 LIano에 Tadija Kekic 감사 하 고 싶습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10&번; DNase I 반응 완충액New England Biolab (NEB)B0303
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt)Alfa AesarJ65535
Amicon ultracentrifugation columnsMerck MilliporeUCF500308, UCF510024
키토산 올리고당 젖산염 (Mn ~ 4000-6000, > 90% 탈아세틸화, 60%. 구성 올리고당Sigma-Aldrich523682
디자인별 스테이플 가닥통합 DNA 기술(IDT)
덱스트란 황산염 나트륨 염(Mr ~ 4kDa)시그마-알드리치75027
덱스트란 황산염 나트륨염(씨 ~ 40kDa)시그마-알드리치42867
DNA 겔 로딩 염료(6×)ThermoFischer sceintificR0611
DNase I (RNase free)New England Biolab (NEB)M0303
에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N′-테트라아세트산(EGTA)Sigma-AldrichE3889
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) BioUltra, 무수, ≥ 99% (적정)Sigma-AldrichEDS
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin ColumnsBiorad7326165
HeminSigma-AldrichH9039
HEPESSigma-AldrichH3375
Hydrogen peroixde slution (32 wt%)Sigma-Aldrich216763
LPEI-25 kDaPolysciences, Inc23966-1
NuPAGE 샘플 환원제 (500 mM 디티오 트레이톨 (DTT))ThermoFischer sceintificNP0004
폴리에틸렌 글리콜 (PEG, M W < / sub > ~ 8000 Da)Carl RothØ263.1
폴리 에틸 렌 이민, 선형, 평균 Mn 10,000, PDI ≤ 1.2시그마-알드리치765090
폴리에틸렌이민, 선형, 평균 Mn 5,000, PDI ≤ 1.3Sigma-Aldrich764582
Proteinase K 용액 (20 mg/ml)ThermoFischer sceintificAM2548
Streptavidin-conjugated HRPThermoFischer sceintificN100
SYBER safe DNA gel stainThermoFischer sceintificS33102

참고문헌

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