셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

요약

우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 감염 분석 호스트 인코딩 요인의 활동을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다.

초록

세균성 병원 체 생존 하 고 한 번 진 핵 세포 안에 증식 고용 전략의 다양 한이 있다. 소위 'cytosolic' 병원 균 (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, 그리고 리케차 종)에 의해 감염 된 세포 cytosol에 액세스 육체적으로 그리고 효소 저하 기본 vacuolar 막. 일단, cytosol에서이 균 모두 증식 뿐 아니라 새로운 세포를 감염 하기 위하여 주인 세포의 원형질 막에 침투 하는 충분 한 기계적인 힘을 생성. 여기, 우리 보여 어떻게 L. monocytogenes (Lm)의 세포 감염 주기의이 터미널 단계 식민지 형성 단위 분석 및 cytometry 양이 정해질 수 있다이 어떻게 모두 병원 체 및 호스트 인코딩된 요인 영향의 예를 들 프로세스입니다. 우리 또한 보여 쥐에서 파생 된 간 세포의 감염 및 배양된 세포의 Lm 감염 역학의 가까운 통신 감염 생체 외에서 vivo에서. 이러한 함수 기반 분석 실험은 상대적으로 간단 하 고 변조기의 진 핵 세포의 기능에 대 한 높은 처리 화면 검색 기반 쉽게 확장 될 수 있습니다.

서론

감염-기반 실험 모델은 호스트와 병원 체, 다양 한 병원 체 감염 전략, 그리고 병원 체 및 호스트-기반 프로세스를 할당의 어려움의 시작 상태 조건에 그들의 의존 때문에 본질적으로 도전 결과 기반으로 합니다. Listeria monocytogenes (Lm) 박테리아의 유전과 미생물의 추적성, 그것의 급속 하 고 processive 세포 감염 전략 및 상대적으로 분명 호스트 방어 응답을 이상적인 병원 체 되고있다 그것의 휴대 organismic-수준 감염 고기 사이의 관계. Lm 의 세포 감염 4 가지 단계¹를 통해 진행: (i) 세포 침공 Lm 공포; 포함 되 고로 종결 (ii) Lm-공포 막의 해체 그리고 cytosol;에 Lm 의 릴리스 감독 (iii) intracytosolic 복제; 그리고 (iv)는 플라즈마 막 직접 인접 한 세포 (상피 시트 등)의 감염 또는, 독방 세포, extracellular 환경으로 Lm 의 출시의 물리적 침투. 이러한 단계의 각 특정 Lm에 의해 추진 됩니다-인코딩된 요소 ('독성 요인' 라고도 함), 삭제, 감염 결함 세포 및 동물 모델에서 발생할. 이 일반적인 감염 전략은 독립적으로 진화 되었습니다 아니라 소위 'cytosolic' 병원 체²의 숫자에 의해.

콜로 니 형성 단위 (CFU) 분석 실험 둘 다 생체 외에서 평가를 널리 고용 됩니다 (즉, 셀룰러) 뿐으로 vivo에서 (즉, organismic) 감염 결과. Vivo에서 감염에 대 한 특히 그들의 높은 감도 뿐만 아니라 분석 실험 CFU 병원 체 침입 및 세포내 생존/확산에 대 한 명확한 판독을 제공합니다. CFU 분석 광범위 하 게 영향을 미치는 감염 Lm 및 호스트 셀 결정 요인 분석에 사용 되었습니다. 이러한 사전 연구 분석 세포 침입과 intracytosolic 복제 하 왔다 유익한, CFU 분석 사용 되지 않은, 우리의 지식의 최선을 Lm 감염 과정의 4 단계를 추적 하: 셀룰러 탈출. 여기, 우리는 상대적으로 간단한 CFU 분석 결과 (물론 cytometry) ('출현' 라 함)는 어떻게 세포 탈출 수단을 모니터링할 수 있습니다 및 어떻게 두 병원 체 및 호스트 인코딩된 요소의 표시 예 규제 Lm의이 단계 설명 감염 주기. 세포질 Lm 감염 사이클의 터미널 단계 분석 추가 병원 체 및 호스트 세포 감염 관련 요인 및 활동 파악 가능 할 수 있습니다.

프로토콜

마우스는 치료에 대 한 모든 적절 한 정부 지침에 따라 고통 없이 치료 했다 하 고 사용의 실험실의 동물 건강의 국가 학회 및 그들의 사용 마이애미 대학 기관 동물 관리가 전체 연구에 대 한 승인 했다 그리고 사용 위원회 (프로토콜 16-053).

1. 감염에 대 한 셀을 준비합니다.

1. 마우스 대 식 세포와 같은 세포 선 RAW 264.7 DMEM 조직 문화 미디어 10% 태아 종 아리 혈 청 (이제부터 DMEM/FCS 라고도 함)와 보완에 전파 125 mL 플라스 크 및 37 °C/5% CO₂에서 유지 관리 하는 조직 문화 인큐베이터를 사용 하 여.
2. 감염, 전날 확장 플라스 크에서 셀을 제거 하 고 15 mL 원뿔 튜브를 나사 모자에 수집을 셀 스 크레이 퍼를 사용 합니다. 800 x g 10 분에 세포를 원심, 상쾌한 가만히 따르다 (항생제) 없이 DMEM/FCS의 1 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단 하 고 titer를 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 결정.
3. 2 x 10⁶ 셀/ml titer를 조정 하 고 48-잘 조직 배양 접시의 우물을 0.10 mL (2 x 10⁵ 셀) 추가. 세포 현 탁 액 우물의 전체 표면을 커버를 확인 합니다.
   1. 바른된 미디어의 최신 소스에 대 한 추가 스 판 셀. 또한 '더 셀 컨트롤'로 3 개의 추가 스 DMEM/FCS의 0.10 mL를 놓습니다.
4. 37 °C/5% CO₂조직 문화 인큐베이터에서 밤새 품 어. 다음 날, 박테리아 inoculum 준비 하 고 사용할 준비가 될 때까지 인큐베이터에서 제거 하지 마십시오.

2. 감염 Listeria monocytogenes (Lm) 준비

1. 갓 줄무늬 천 배지에서 단일 식민지와 두뇌 심 혼 주입 (BHI)의 2 개 mL를 접종 (< 2 일) Lm 의 130 회전/분 떨고와 37 ° C에서 밤새 품 어 고.
2. 다음 날, 하룻밤 문화 2 mL를 0.10 mL 미리 BHI를 예 열 하 고 광학 밀도 (OD₆₀₀)는 0.4 ~ 0.6까지 떨고와 37 ° C에서 배양을 계속 추가 합니다.
3. 대략적인 세균성 titer를 실험적으로 파생 된 변환 수식을 사용 하 여 결정 합니다. 우리 실험실에서 BHI에 기 하 급수적으로 성장 Lm 문화는 약 1.3 x 10⁹ 콜로 니 형성 단위 (CFU) /OD₆₀₀. 세균성 문화는 실내 온도에 노출 되는 시간을 최소화 합니다.
4. 방금 전에 감염 titer 5 x 10⁷ CFU/mL 희석 액으로 미리 데워 DMEM/FCS를 사용 하 여 조정 합니다.

3입니다. 감염

1. 20 µ L을 추가 신속 하 고 정확 하 게, 작업 (1 x 10⁶ CFU, 감염, 나의 다양성 = 5)는 갓 Lm inoculum (2.4 위의 단계)으로 접시를 약간 기울이기 조심 스럽게 피펫으로 팁 overlying 미디어;에서 웰 스의
   참고: 피펫으로 팁과 우물의 벽을 만지지 마십시오.
2. 부드럽게 피펫으로 되도록 각의 내용을 완료 혼합; 동요 하지 또는 우물의 벽에 Lm 를 확산 것이 접시를 크게 기울. 37 °C/5% CO₂ 배양 기에 세포 배양 접시를 반환 합니다.
3. 희석제로 감염 되지 않은 우물에서 바른된 미디어를 사용 하 여 10 µ g/mL gentamicin 솔루션을 준비 합니다.
4. 30 분에 감염 (mpi) 게시물, 신중 하 게 37 °C/5% CO₂ 인큐베이터에 gentamicin 솔루션 (최종 농도 2.5 µ g/mL)와 부드럽게 피펫으로 30 µ L 뿐만 아니라 전에 반환 셀 문화 접시의 내용을 추가.
5. (아래 섹션에서 설명한 대로 4 및 5, 각각) 60 mpi에서 CFU 분석 결과 (60 mpi 시간 포인트) 또는 FCM 분석에 대 한 적절 한 우물을 수확.
6. 나머지 우물에 대 한 다양 한 시간 그 후에 수확 셀 또는 전에, Lm 출현 분석 결과, 전적으로 우물에서 미디어를 제거 하 고 바른 미디어 gentamicin 무료 150 µ L를 바꿉니다.

4. 샘플링 처리 및 CFU 분석 결과 의해 세포내 및 응급 Lm 의 분석

1. 수확, 약간 기울기는 요리 하 고 우물에서 전체 미디어를 조심 스럽게 제거 합니다. 우물에 멸 균 증류수 (dsH₂O) 0.50 mL를 추가 합니다. 30 후 s, lysate 결과 물 전송 (10⁰) 1.5 mL microcentrifuge 튜브 및 10에 대 한 적극적으로 소용돌이 s.
2. 10^-1 과 10^-2 희석 및 추가 하 여도 4.5 µ L 또는 lysate dsH₂O 450 µ L를 물 50 µ L 짧게 소용돌이 철저 하 게 혼합 되도록 준비 합니다.
3. 확산은 10의 50 µ L⁰, 10^-1 / lysogeny (파운드) 국물 한 접시에 10^-2 샘플.
4. 응급 Lm (단계 위의 3.6)에 대 한 분석 결과, 입히는 미디어의 10 µ L을 제거 하 고 두 5 µ L aliquots로 그것을 분할 하: 한 약 수에 5 µ L DMEM/FCS의와 두 번째 약 수를 포함 하는 5 µ g/mL gentamicin DMEM/FCS의 5 µ L 추가 추가. 후자의 제어 extracellular Lm (민감한 gentamicin)를 구분 하 고 세포내 Lm (gentamicin 저항) 후속 CFU에서 시험.
5. 실 온에서 5 분, 후 파운드 한 천 배지에서 dsH₂O, 10 s에 대 한 적극적으로 소용돌이의 90 µ L 및 확산 50 µ L를 추가 합니다.
6. Lm 식민지 파운드 한 천 배지는 37 ° c.에 외피의 2 일 다음에 열거

5. 샘플링 처리 및 Cytometry (FCM)에 의해 세포내 및 응급 Lm 의 분석

1. 1.1-4 단계에 설명 된 대로 RAW 264.7 세포를 준비 합니다. 1 x 10⁶ 셀/mL로 세포를 조정 하 고 6 잘 조직 배양 접시의 우물 1 mL (1 x 10⁶ 셀) 추가.
2. 2.1-2.3 단계에서 설명한 대로 박테리아 inoculum을 준비 하 고 볼륨 inoculum 해당 50 (5 x 10⁷ CFU)의 나 하의 세포를 감염.
3. 1.5 시간 게시물 감염 (hpi)에서 웰 스의 첫 번째 집합에서 미디어를 수집 하 고 모든 우물 처리 된 때까지 microcentrifuge 튜브 1.5 mL 500 µ L의 4 %paraformaldehyde (PFA)와 얼음에 장소에에서 장소.
4. 세포내 Lm를 수집 하려면 dsH₂O의 1 mL에 추가 잘 60 후 s, 4%의 500 µ L 1.5 mL microcentrifuge 튜브 lysate 결과 물 전송 PFA. 10 s와 모든 우물이 처리 될 때까지 얼음에 대 한 적극적으로 소용돌이. (샘플 처리 단계 5.8 아래에 설명 되어 있습니다.)
5. 나머지 우물에 대 한 미디어를 제거 하 고 extracellular Lm 를 죽 일 셀 인큐베이터에 즉시 반환을 5 µ g/mL gentamicin와 DMEM/FCS의 1 mL를 바꿉니다.
6. 30 분 (2 hpi) 후 미디어를 제거 하 고 gentamicin 없이 DMEM/FCS를 바꿉니다.
7. 2, 4 h (4 및 6 hpi) 후 두 번째 고 3 단계 5.3 및 5.4로 미디어와 lysates 수집 하 여 포인트를 시간.
8. 10000 x g 방해 펠 릿 없이 7 분 제거 상쾌한에 튜브 원심
9. 4%의 50 µ L의 칵테일을 얼룩에 각 펠 릿 중단 PFA와 phalloidin의 15 µ L. 20 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 튜브를 품 어.
10. 부 화 후 각 튜브를 위아래를 섞어 피 펫 FACS 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.
11. 10000 x g 방해 펠 릿 없이 7 분 제거 상쾌한에 튜브를 회전 합니다.
12. 즉각적인 사용을 위해 FACS 버퍼의 400 µ L 또는 FACS 버퍼의 200 µ L와 4%의 200 µ L 각 펠 릿을 중단 PFA 나중에 분석을 위해 저장 하는 경우.
13. cytometry에 샘플을 실행 하 고 수집 된 데이터를 분석.

6. 샘플링 처리 및 Lm 식민과에 호스트 응답의 분석

1. 2.1-2.3 단계에서 설명한 대로 감염에 대 한 Lm 를 준비 합니다.
2. 3 x 10⁶ CFU/mL의 원하는 titer에 대 한 2 차 배양의 필요한 금액을 계산 합니다.
3. 감염 직전 계산 된 박테리아와 미리 데워 진된 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1 mL의 최종 볼륨에서의 양을 희석. 이것은 마우스에 주입 입력된 inoculum 이다.
4. 28 G½ 100U 인슐린 주사기를 사용 하 여 입력된 inoculum의 100 µ L (3 x 10⁵ CFU) 그리고 어떤 눈에 보이는 기포를 제거.
5. 지주 구속으로 (스트레인 C57BL/6, 6, 12 주 오래 된 사이 남성) 마우스를 배치 하 고 따뜻한 물 (이상의 45 ° C)를 사용 하 여 꼬리 정 맥을 팽창 다음 입력된 inoculum을 정 맥에 주입.
6. 10^-2 와 파운드 agar 10bcm 접시에 입력된 inoculum의 10^-3 희석 하십시오 고 실제 입력된 복용량을 결정 하기 위해 37 ° C에서 밤새 품 어.
7. 18 hpi에서 고통 없이 안락사 마우스 (CO₂ 질 뒤에 자 궁 경부 전위)를 사용 하 여 멸 균가 위로 잘라 오픈 마우스 복 막의 내부와 외부에 대 한 별도 쌍의 핀셋과가 위를 사용 하 여 간 전 두 엽을 수집 마우스입니다. 간 6 cm 얼음에 페 트리 접시에에서 놓습니다.
8. 간 작은 조각으로 잘라 고 자기 저 어 바와 유리 병 합니다. 2 mg/mL 콜라 D FCS 없이 DMEM 재구성의 2 개 mL를 추가 합니다. 30−45 분 자력에 37 ° C에서 튜브를 품 어. 일단 조직 무 균 DMEM/FCS는 콜라를 비활성화 하려면 3 mL를 추가 합니다.
9. 필요한 경우 더 많은 DMEM/FCS를 추가 원뿔 관으로 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 셀을 필터링 합니다.
10. 셀을 10 분 동안 4 ° C에 작은, 상쾌한 붉은 혈액 세포를 lyse ACK 버퍼의 500 µ L에 셀 펠 릿을 중단 800 x g 에서 원심
11. ACK 버퍼에 5 분 동안 실내 온도에 세포를 품 어. DMEM/FCS의 1 mL에 셀을 일시 중단 합니다.
12. 셀을 10 분 동안 4 ° C에 작은, 상쾌한 DMEM/FCS의 1 mL에 중단 800 x g 에서 원심 그런 다음는 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
13. 1.5 mL microcentrifuge 튜브와 작은 스핀을 1 x 10⁶ 셀을 전송 합니다. DsH₂O 및 세포를 lyse에 소용돌이의 1 mL에 다음 일시 중단 합니다. 타지에서 파운드 접시에 50 µ L와 10^-2 희석 하십시오 그리고 Lm CFU 분석에 대 한 열거를 37 ° C에서 품 어.
14. FACS 튜브 셀 개수에 따라 각 조직 샘플에 대 한 1 x 10⁶ 셀을 전송 및 FACS 버퍼의 1 mL로 씻어.
15. 10 분 동안 4 ° C에서 작은 고 상쾌한 제거 800 x g 에서 셀 원심
16. 각 항 체와 FACS 버퍼에 대 한 권장된 농도에 따라 관심의 항 체를 포함 하는 항 체 칵테일을 준비 합니다. 분석에 사용 하는 권장된 금액에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
17. 항 체 칵테일의 100 µ L에 펠 릿을 일시 중단 하 고 30 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 튜브를 품 어.
18. 부 화, 후 각 튜브를 FACS 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 고 셀을 일시 중단.
19. 셀 4 ° C에서 펠 렛을 삭제는 상쾌한 800 x g 에서 원심 다음 400 µ L의 즉각적인 사용을 위해 FACS 버퍼 또는 FACS 버퍼의 200 µ L와 4%의 200 µ L에 펠 릿을 중단 PFA 나중을 위해 저장 하는 경우.
20. Cytometry 세포 분석 (단계 5.13 참조).

결과

병원 체와 세포 감염에 영향을 미치는 호스트 인코딩된 요인의 역할 평가
위에서 설명한 감염 조건 사용 하 여, 입력된 야생-타입 Lm 의 0.15%는 배양된 세포 (그림 1A)를 가진 공동 외피의 1.5 h 후 복구 됩니다. 공동 보육 (3 h 게시물 감염, hpi)의 후속 1.5 h에서 가능한 Lm 의 복구에 4-fold 증가 하 고 3 ~ 6 hpi 가능한 Lm의 복구에 추가 7.5-fold 증가 했다. 이후 셀 스며들 지 않는 항생제 gentamicin extracellular Lm제거 1 hpi에서 공동 문화에 추가 됩니다, 1.5와 6 hpi 사이 가능한 Lm 수준에 30-fold 증가 독점적으로 세포내 확산을 나타냅니다.

토론

그것의 급속 하 고 processive 세포 감염 프로그램 Lm 은 감염에 영향을 주는 세포 활동을 조사 하는 이상적인 병원 체. 호스트 요인의 수는 긍정적으로 또는 부정적으로 영향을 미칠 Lm 세포 감염^11,12,,1314확인 되었습니다. 두 같은 Perforin 2와 헤 규제 억제제 우리의 실험실에서 특징 요소 호스트 (P2와 안녕), Lm 감염 프로세스의 고유 기능을 조절. 그림 3에서 보듯이 P2 결핍 세포는 Lm 에 매우 취약 그리고이 향상 된 민감도 또한 P2 녹아웃 쥐⁴의 사실 이다. 표현 하는 P2 및 P2 불충분 한 세포의 상세...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ACK Lysing Buffer	Gibco
ArC 아민 반응성 보상 비드	Life Technologies	A10346
BHI (Brain Heart Infusion) 국물	EMD Milipore 110493
Cell Strainer, 70 µ m	VWR	10199-656
콜라겐 분해 효소 D	Roche	11088858001
DMEM 미디어	기코	11965-092
FACS 튜브	BD Falcon	352054
FBS - 열 비활성화	시그마-알드리치	F4135-500ML
행크스 균형 잡힌 소금 용액	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
LB 아가	그로우 셀 MS	MBPE-4040
LIVE/DEAD 고정 가능한 옐로우 데드 셀 스테인 키트	라이프 테크놀로지	L349S9
로다민 팔로이딘	Thermo Fischer	R415
SP6800 스펙트럼 분석기	Sony
주사기 28 G 1/2" 1cc	BD	329461
TPP 조직 배양 48 웰 플레이트	MIDSCI	TP92048
TPP 조직 배양 6웰 플레이트	MIDSCI	TP92406
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42
Antigen
CD11b	바이오레전		플루로크롬 = PE Cy5, 희석 = 1/100, 클론 = M1/70
CD11c	바이오레전		플루로크롬 = AF 647, 희석 = 1/100, 클론 = N418
CD45	바이오레전		플루로크롬 = APC Cy7, 희석 = 1/100, 클론 = 30-F11
F4/80	바이오레전		플루로크롬 = PE, 희석 = 1/100, 클론 = BM8
Live/Dead	Invitrogen		플루로크롬 = AmCyN, 희석 = 1/100
Ly6C	바이오레전		플루로크롬 = PacBlue, 희석 = 1/200, 클론 = HK1.4
MHC II	바이오레전		플루로크롬 = AF 700, 희석 = 1/200, 클론 = M5/114.15.2
NK 1.1	바이오레전		플루로크롬 = BV 605, 희석 = 1/100, 클론 = PK136