절연 및 인간의 탯 유래 중간 엽 줄기 세포 Preterm와 기간 유아에서의 특성화

요약

인간의 탯 (UC) preterm, 용어, 결과로 perinatal 기간 동안 얻을 수 있습니다 하 고 postterm 배달. 이 프로토콜에서 우리 기술 분리와 UC 유래 중간 엽 줄기 세포 (UC-MSCs)의 태아/유아에서 임신 19-40 주.

초록

중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 상당한 치료 잠재력 있고 생물 의학 분야에서 증가 관심을 유치. MSCs는 원래 고립 된 골 수 (BM)에서 특징 그리고 지방 조직, 막, 피부, 치과 펄프와 같은 태 반, 태아 부속을 포함 하 여 조직에서 획득 한 탯 줄 혈액 (UCB), 그리고 탯 (UC). MSCs는 이종 세포 인구 (1) 표준 문화 조건, (2) 표면 마커 표현의 CD73 플라스틱 준수 한 용량⁺/CD90⁺/CD105⁺/CD45^-/CD34^-/CD14^-/CD19 ^-/HLA-DR^- 고기, 그리고 (3) trilineage 차별화 adipocytes, osteocytes, 및 chondrocytes, 현재 국제 사회에 의해 세포 치료 (ISCT)에 대 한 정의를 실현. BM은 MSCs의 가장 널리 사용 되는 소스, BM 포부의 침략 적인 본질은 윤리적 접근을 제한 합니다. MSCs의 확산 및 감 별 법 용량 BM에서 얻은 일반적으로 기증자의 나 이와 함께 감소. 대조적으로, UC에서 얻은 태아 MSCs 활발 한 증식 및 분화 능력 등 장점이 있다. 그것은 일반적으로 의료 폐기물로 간주 UC 샘플링에 대 한 윤리적인 우려가입니다. 인간의 UC 4-8 주 임신에서 양수 내 구멍의 성장을 지속적으로 개발을 시작 하 고 성장 하는 길이, 50-60 cm를 도달할 때까지 계속 전체 신생아 배달 기간 동안 격리 될 수 있습니다. 다루기 힘든 질병의 이상에 대 한 통찰력을 얻으려면, UC 파생 MSCs (UC-MSCs) 다양 한 임신 나가에 전달 하는 유아에서 사용 했습니다. 이 프로토콜에서 분리와 19-40 주 임신의 태아/유아에서 UC MSCs의 특성을 설명합니다.

서론

중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 원래 고 골에서 (BM)^1,2 특징 하지만 또한 다양 한 지방 조직, 막, 피부, 치과 펄프 및 태아 부속을 포함 하 여 조직에서에서 얻을 수 있습니다. ³. MSCs 격 증 하 고 adipocytes, osteocytes, 및 chondrocytes 차별화 수 있는 다른 유형의 세포 인구로 서 인식 됩니다. MSCs 상해의 사이트로 마이그레이션할 억제 하 고 면역 반응을 조절 하는 능력을 소유 하는 또한, 개장 하 고 상해를 복구. 현재, 서로 다른 소스에서 MSCs 이식-비교-호스트 질병, 심근 경색 및 뇌^{4,5 포함 하 여 다루기 힘든 질병의 숫자에 대 한 세포 치료에 대 한 원본으로 성장 관심을 받고 있다} .

BM은 MSCs의 가장 좋은 특징이 소스, BM 포부의 침입은 윤리적 접근을 제한 합니다. MSCs의 확산 및 감 별 법 용량 BM에서 얻은 일반적으로 기증자의 나 이와 함께 감소. 반면, 태 반, 탯 줄 혈액 (UCB) 등 태아 부속에서 얻은 태....

프로토콜

이 연구에 대 한 인간의 샘플의 사용 고베 대학 대학원의 학부 (승인 제 1370, 1694)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었고 승인된 지침에 따라 실시.

1. 격리와 UC MSCs의 문화

참고: UC-MSCs 성공적으로 격리 된, 교양, 그리고 확장된 (이상 통로 번호 4) 200 이상에서 UCs이이 프로토콜을 복종. 이상의 200 간에 UCs, 100% 나타났습니다 성공적인 UC MSC 격리, 5% 미만 15%로 나타났습니다 성장 검거 하 고 80% 이상 성공적인 UC MSC 확장 우발적인 오염 나타났습니다.

1. UC를 수집 합니다.
   1. 50 mL 플라스틱 튜브를 준비, 무 균가 위, 그리고 알파의 500 mL 병 4 ° c.에이 글의 최소 필수 매체 (알파 MEM) 수정
   2. Aseptically 길이에서 대략 5-10 cm에서 수술 시저와 UC 잘라 고 제왕 절 개 하 여 신생아 출생 후 곧 그것을 수집 합니다.
   3. 즉시는 UC 50ml 플라스틱 튜브에 놓고 MEM 튜브에 알파의 20-30 mL를 추가 합니다.
   4. 그것은 실험실에 수송 될 때까지 실 ....

결과

MSC 문화 UC 컬렉션에서 절차는 그림 1에서 요약 된다. 길이 약 5-10 cm의 UC 제왕 절 개에 의해 전달 하는 모든 신생아에서 수집할 수 있습니다. UC는 임신의 4-8 주에 개발을 시작 하 고 그림 2와 같이 길이, 50-60 cm까지 성장 하 고. 그림 3 과 그림 4에서 같이 두 동맥 (A), 한 맥 (V), 코드 (CL), 안 감과 튼의 젤리 (WJ) UC에 있습니다. UC-MSCs 모든 코드 영역 또는 전체 코드¹³에서 격리 될 수 있습니다. 초기 임신 연령대와 유아에서 UC는 취약 하며 단일 코드 영역으로 해 부에 대 한 어려운, 때문에 UC MSCs 전체 코드^11.......

토론

MSCs는 다양 한 조직에서에서 고립 될 수 있다 고 할 모든 익스프레스 같은 phenotypic 표식 셀의 이종 인구. 여기, 우리는 preterm와 기간 유아에서 수집 및 UC의 해 부 가이드 및 절연 UC MSCs의 문화를 가능 하 게 하는 프로토콜을 설명 했다. 이 프로토콜에 따라 우리는 성공적으로 고립 된 UC-MSCs ISCT 기준¹⁹ 태아/유아 임신 19-40 주에 전달 하 고 다루기 힘든 질병 이상의 일부 측면을 나타내는 시연에서 충족 동안 태아 개발^11,12.

BM 파생 MSCs (BM-MSCs), 젊은 기증자 파생 BM MSCs 일반적으로 이전 보다 더 큰 증식 및 differentiative 잠재력을 표시 하 고 셀 치료^20,

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
50 mL 플라스틱 튜브	AS One Coporation, 오사카, 일본	Violamo 1-3500-22
12-웰 플레이트	AGC Techno Glass, Tokyo, Japan	Iwaki 3815-012
60 mm dish	AGC Techno Glass, Tokyo, Japan	Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μ m)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Falcon 35-2360
세포 여과기 (70 μ m)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Falcon 35-2350
Alpha MEM	Wako Pure Chemical, Osaka, Japan	135-15175
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	172012
Reduced serum medium	Thermo Fisher Scientific, waltham, MA	OPTI-MEM Gibco 31985-070
항생제-항진균제	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA	Wako Pure Chemical, Osaka, Japan	209-16941
PBS	Takara BIO, Shiga, Japan	T900
정제 효소 혼합물	Roche, Mannheim, Germany	Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	347497	Lot: 3220644, RRID:
CD19 BD Bioscience에 대한 AB_400312 PE 결합 마우스 1차 항체	, Franklin Lakes, NJ	340364	Lot: 3198741, RRID:
CD34 BD Bioscience에 대한 AB_400018 PE 결합 마우스 1차 항체	, Franklin Lakes, NJ	555822	Lot: 3079912, RRID:
CD45 BD Bioscience에 대한 AB_396151 PE 결합 마우스 1차 항체	, Franklin Lakes, NJ	555483	Lot: 2300520, RRID:
CD73 BD Bioscience에 대한 AB_395875 PE 결합 마우스 1차 항체	, Franklin Lakes, NJ	550257 Lot	: 3057778, RRID: CD90
에 대한 AB_393561 PE 결합 마우스 1차 항체	, Franklin Lakes, NJ	555596	Lot: 3128616, RRID:
CD105 BD Bioscience에 대한 AB_395970 PE 결합 마우스 1차 항체	, Franklin Lakes, NJ	560839	Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE 복합 마우스 1차 항체 HLA-DR	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	347367 Lot	: 3219843, RRID: AB_400293
PE 복합 마우스 IgG1 k isotype	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	555749	Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE 결합 마우스 IgG2a k isotype	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	555574	Lot: 3035934, RRID: AB_ 395953
PE 결합 마우스 IgG2b k isotype	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	555743	Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent	Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan	Block Ace UKB80
FCM	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	BD FACS아리아  III 세포 분류기
FCM 소프트웨어	BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ	BD FACSDiva
지방 생성 분화 배지	Invitrogen, Carlsbad, CA	StemPro 지방 형성 분화 키트 A10070-01
골 형성 분화 배지	Invitrogen, Carlsbad, CA	StemPro 골 형성 분화 키트 A10072-01
연골 생성 분화 중간	Invitrogen, Carlsbad, CA	StemPro 연골 형성 분화 키트 A10071-01
포름알데히드	Polyscience, Warrigton, PA	16% 초순수 포름알데히드 EM 등급 #18814
오일 레드 O	시그마 Aldrich, St. Louis, MO	O0625
Arizarin Red S	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	A5533
Toluidine Blue	Sigma Aldrich, St. Louis, MO
현미경	Keyence, 일본 오사카	BZ-X700

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