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방법 논문

절연 및 인간의 탯 유래 중간 엽 줄기 세포 Preterm와 기간 유아에서의 특성화

14.5K 조회수

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DOI:

10.3791/58806

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2019년 1월 26일

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1Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2Department of Pathology, Kobe Children's Hospital, 3Department of Pediatrics, Hyogo College of Medicine, 4Department of Developmental Pediatrics, Shizuoka Children's Hospital, 5Department of Pediatrics, Nihon University School of Medicine

이 논문에서

요약

인간의 탯 (UC) preterm, 용어, 결과로 perinatal 기간 동안 얻을 수 있습니다 하 고 postterm 배달. 이 프로토콜에서 우리 기술 분리와 UC 유래 중간 엽 줄기 세포 (UC-MSCs)의 태아/유아에서 임신 19-40 주.

초록

중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 상당한 치료 잠재력 있고 생물 의학 분야에서 증가 관심을 유치. MSCs는 원래 고립 된 골 수 (BM)에서 특징 그리고 지방 조직, 막, 피부, 치과 펄프와 같은 태 반, 태아 부속을 포함 하 여 조직에서 획득 한 탯 줄 혈액 (UCB), 그리고 탯 (UC). MSCs는 이종 세포 인구 (1) 표준 문화 조건, (2) 표면 마커 표현의 CD73 플라스틱 준수 한 용량+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19 -/HLA-DR- 고기, 그리고 (3) trilineage 차별화 adipocytes, osteocytes, 및 chondrocytes, 현재 국제 사회에 의해 세포 치료 (ISCT)에 대 한 정의를 실현. BM은 MSCs의 가장 널리 사용 되는 소스, BM 포부의 침략 적인 본질은 윤리적 접근을 제한 합니다. MSCs의 확산 및 감 별 법 용량 BM에서 얻은 일반적으로 기증자의 나 이와 함께 감소. 대조적으로, UC에서 얻은 태아 MSCs 활발 한 증식 및 분화 능력 등 장점이 있다. 그것은 일반적으로 의료 폐기물로 간주 UC 샘플링에 대 한 윤리적인 우려가입니다. 인간의 UC 4-8 주 임신에서 양수 내 구멍의 성장을 지속적으로 개발을 시작 하 고 성장 하는 길이, 50-60 cm를 도달할 때까지 계속 전체 신생아 배달 기간 동안 격리 될 수 있습니다. 다루기 힘든 질병의 이상에 대 한 통찰력을 얻으려면, UC 파생 MSCs (UC-MSCs) 다양 한 임신 나가에 전달 하는 유아에서 사용 했습니다. 이 프로토콜에서 분리와 19-40 주 임신의 태아/유아에서 UC MSCs의 특성을 설명합니다.

서론

중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 원래 고 골에서 (BM)1,2 특징 하지만 또한 다양 한 지방 조직, 막, 피부, 치과 펄프 및 태아 부속을 포함 하 여 조직에서에서 얻을 수 있습니다. 3. MSCs 격 증 하 고 adipocytes, osteocytes, 및 chondrocytes 차별화 수 있는 다른 유형의 세포 인구로 서 인식 됩니다. MSCs 상해의 사이트로 마이그레이션할 억제 하 고 면역 반응을 조절 하는 능력을 소유 하는 또한, 개장 하 고 상해를 복구. 현재, 서로 다른 소스에서 MSCs 이식-비교-호스트 질병, 심근 경색 및 뇌4,5 포함 하 여 다루기 힘든 질병의 숫자에 대 한 세포 치료에 대 한 원본으로 성장 관심을 받고 있다 .

BM은 MSCs의 가장 좋은 특징이 소스, BM 포부의 침입은 윤리적 접근을 제한 합니다. MSCs의 확산 및 감 별 법 용량 BM에서 얻은 일반적으로 기증자의 나 이와 함께 감소. 반면, 태 반, 탯 줄 혈액 (UCB) 등 태아 부속에서 얻은 태아 MSCs 및 탯 (UC) 샘플링 하 고 강력한 확산 및 감 별 법 용량6 덜 윤리적 문제를 포함 하는 장점이 있다 , 7. 중 의료 폐기물로 폐기 보통 태아 부속, UCB와 UC는 간주 태아 기관 태 fetomaternal 간주 됩니다. 또한, 태 반 및 UCB 샘플링 하 여 태 반 및 UC 수집 하 고 신생아 배달 후 처리 될 수 있습니다 신생아 배달의 정확한 순간에 수집 해야 합니다. 따라서, UC 세포 치료8,9대 유망 MSC 소스 이다.

인간의 UC 4-8 주 임신에서 양수 내 구멍의 진보적인 확장 개발을 시작 하 고 길이, 50-60 cm까지 성장 하 고 신생아 배달10의 전체 기간 동안 고립 될 수 있다. 다루기 힘든 질병의 이상에 대 한 통찰력을 얻으려면, 우리는 다양 한 임신 성 연령11,12에서 제공 하는 유아에서 UC 파생 MSCs (UC-MSCs) 사용 합니다. 이 프로토콜에서 우리는 격리 하 고 19-40 주 임신의 태아/유아에서 UC-MSCs를 특성화 하는 방법을 설명 합니다.

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프로토콜

이 연구에 대 한 인간의 샘플의 사용 고베 대학 대학원의 학부 (승인 제 1370, 1694)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었고 승인된 지침에 따라 실시.

1. 격리와 UC MSCs의 문화

참고: UC-MSCs 성공적으로 격리 된, 교양, 그리고 확장된 (이상 통로 번호 4) 200 이상에서 UCs이이 프로토콜을 복종. 이상의 200 간에 UCs, 100% 나타났습니다 성공적인 UC MSC 격리, 5% 미만 15%로 나타났습니다 성장 검거 하 고 80% 이상 성공적인 UC MSC 확장 우발적인 오염 나타났습니다.

  1. UC를 수집 합니다.
    1. 50 mL 플라스틱 튜브를 준비, 무 균가 위, 그리고 알파의 500 mL 병 4 ° c.에이 글의 최소 필수 매체 (알파 MEM) 수정
    2. Aseptically 길이에서 대략 5-10 cm에서 수술 시저와 UC 잘라 고 제왕 절 개 하 여 신생아 출생 후 곧 그것을 수집 합니다.
    3. 즉시는 UC 50ml 플라스틱 튜브에 놓고 MEM 튜브에 알파의 20-30 mL를 추가 합니다.
    4. 그것은 실험실에 수송 될 때까지 실 온 (RT)에서 UC를 저장 합니다.
      참고: 무 균 UC 최대 2 일 동안 RT에서 혈 청 자유로운 매체에 저장할 수 있습니다. 따라서, 2 일 이내 실험실으로 전달 되는 경우 인근 병원에서 얻은 UC는 수집할 수 있습니다.
  2. UC를 해 부.
    1. 플라스틱 트레이, 소독된가 위, 집게, 10 mL 펫 25 mL 펫, 2 개의 60 m m 조직 문화 요리, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 준비, 정제 효소 혼합 (참조 테이블의 자료, 농도에서 살 균 PBS와 재구성 13 Wünsch 단위/mL의-80 ° C에 저장), 그리고 감소 된 혈 청 매체의 500 mL 병 ( 재료의 표참조).
    2. PBS, 정제 효소를 따뜻한 혼합, 실시간으로 혈 청 매체와 문화 매체 [알파 MEM 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 항생제 antimycotic 솔루션 (AA) 4 ° C에 저장]을 감소
    3. 튜브에서 UC를 꺼내와 플라스틱 쟁반에.
    4. 무게 하 고 소독된가 위 UC의 5 g를 해 부.
    5. 10 mL 피 펫을 사용 하 여 살 균을 위한 UC의 70% 에탄올 10 mL 붓는 다.
    6. PBS는 10 mL 피 펫을 사용 하 여 두 번의 10 mL와 UC를 씻어.
    7. 멸 균된 60 m m 조직 문화 접시에는 UC를 놓습니다 ( 그림 1, 1 단계 참조).
    8. 접시에 감소 된 혈 청 매체의 10 mL를 추가 합니다.
    9. 정제 효소 혼합 약 0.62 Wünsch 단위/mL의 최종 농도 도달의 0.5 mL를 추가 합니다.
      참고: 전통적인 콜라 대신 정제 효소 혼합의 사용 수율을 향상을 보여줘 왔다 그리고 UC MSCs의 UC에서 격리.
    10. 집게 (참조 그림 1, 2 단계)와 소독된가 위는 UC 2-3 m m 조각으로 잘라.
      참고: 이 프로세스는 약 30 분 걸립니다.
    11. UC 조각 5% CO2 배양 기에서 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    12. 부분적으로 소화 된 UC 조각 25 mL 피 펫을 쉽게 통과 하는 작은 조각으로 잘라.
      참고: 이 프로세스는 약 30 분 걸립니다.
    13. 작은 UC 조각 5% CO2 배양 기에서 15-45 분 동안 37 ° C에서 품 어.
      참고: 부 화는 homogenates 점성 될 때까지 계속 해야 합니다. 총 소화 시간은 약 120 분입니다. 그러나 Preterm 유아에서 UCs를 사용 하는 경우, 소화 시간 단축 수 있다 수 있기 때문에 그는 쉽게 잘라 소화.
  3. UC-MSCs를 격리 합니다.
    1. 4 50 mL 플라스틱 튜브와 문화 매체의 500 mL 병을 준비 합니다.
    2. UC homogenate를 2 50ml 플라스틱 튜브 각 튜브에 약 7.5 mL와 함께 25 mL 피 펫을 사용 하 여 나눕니다.
    3. 각 관으로 문화 매체의 20 mL를 추가 하 고 잘 혼합.
    4. 25 mL 피 펫을 사용 하 여 UC 파생 된 세포를 수집 하는 새로운 50 mL 컬렉션 튜브 위에 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 각 UC homogenate를 필터링 합니다.
      참고: 소화 UC 솔루션은 끈 적이 과정 각각 15 분 정도 걸립니다.
    5. 5 분 동안 1000 x g에서 두 튜브 원심
    6. 신중 하 게는 상쾌한 발음 하 고 그것을 폐기.
    7. 문화 매체의 5 mL와 함께 두 개의 튜브에서 셀 펠 릿을 resuspend.
    8. 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 문화와 새로운 60 m m 플레이트에 세포 현 탁 액을 전송 ( 그림 1, 3 단계 참조).
  4. -MSCs 문화 Uc입니다.
    1. PBS, 트립 신-EDTA (0.25 w/v%), 워밍업 및 매체 문화 (알파 MEM 10 %FBS 1 %AA 포함) 실시간을
    2. 셀 60 m m 플레이트에 장착 하는 경우 문화 매체를 제거 하 고 두 번 파편과 적혈구를 제거 하는 PBS의 5 mL로 씻어.
      참고: 연결 된 셀은 일반적으로 초기 도금 후 3-5 일에 나타납니다 ( 그림 1, 4 단계 참조).
    3. 두 번 주당 문화 매체를 대체 하 고 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 90-100 %confluency 품 어.
      참고: 이 일반적으로 초기 도금 후 7-14 일 걸립니다.
    4. 5 mL의 PBS로 세척 세포는 두 번, 트립 신-EDTA의 0.5 mL을 추가 하 고 5-10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    5. 때 셀 반올림 되 고 문화 매체의 9 mL을 추가 하 고 잘 섞어 분리, 트립 신을 비활성화 하려면.
    6. 셀 서 스 펜 션 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 문화와 새로운 100 mm 접시에 전송 ( 그림 1, 5 단계 참조).
    7. 두 번 주당 문화 매체를 대체 하 고 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 90-100 %confluency 품 어.
      참고: 이 일반적으로 초기 도금 후 4-8 일 걸립니다.
    8. 10 mL PBS의 셀을 두 번 씻어 트립 신-EDTA의 1 mL을 추가 하 고 5-10 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    9. 때 셀 반올림 되 고 문화 매체의 9 mL을 추가 하 고 잘 섞어 분리, 트립 신을 비활성화 하려면.
    10. 셀 서 스 펜 션 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 두 문화와 새로운 100 mm 접시에 전송 ( 그림 1, 5 단계 참조).
    11. 10 번째 통로까지 subculture (1:2 분할)을 반복 ( 그림 1, 5 단계 참조).
      참고: 적은 confluent 조건 하에서 경작 하는 세포는 이전 확산 체포를 도달 하는 경향이, 때문에 분할 비율 1: 2의 통로 세포에 중요 하다.
    12. 5 8 통로에 세포를 사용 하 여 세포 표면 마커 분석, 세포 감 별 법 분석 실험, 및 다른 실험에 대 한.
      참고: 유지 하기 위해 가능한 한 길게를 위한 활발 한 증식, 세포 일반적으로 70-80 %confluent 조건 보다 더 아래 교양.

2. 표면 마커 UC MSCs의 표현

  1. 셀 100 mm 접시에 준비 하 고 5-10 분 동안 37 ° C에서 트립 신-EDTA의 1 mL와 함께 그들을 떼어 놓다.
  2. 5 분 동안 1000 x g에서 문화 매체와 원심 분리기의 9 mL를 추가 합니다.
  3. 상쾌한 발음 하 고 그것을 폐기.
  4. PBS의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 고 1000 x g에서 원심 분리기는 5 분에 대 한 두 번이 세척 단계를 반복 합니다.
  5. ~ 1 × 106 셀/mL에서 교류 cytometry (FCM) 버퍼 (PBS 2 mM EDTA 및 10% 차단 시 약 포함)에 포함 된 셀을 resuspend.
  6. 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액의 50-100 µ L를 전송 phycoerythrin (PE) 추가-CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, 또는 HLA-DR;에 대 한 항 체를 활용 그리고 45 분 동안 얼음에 품 어.
  7. FCM과 워시 셀 두 번 버퍼링 하 고 0.2% 생존 염료 솔루션의 50-100 µ L를 추가 ( 재료의 표참조).
  8. 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 15 분, FCM 버퍼 두 번 세척 세포 및 필터 셀에 대 한 RT에서 품 어.
  9. FCM을 통해 셀을 실행 하 고 제조업체의 지침에 따라 FCM 소프트웨어를 사용 하 여 얻은 결과 분석.

3. Trilineage UC MSCs의 차별화

  1. 지질을 수행 합니다.
    1. 5 × 103 셀/mL의 농도에서 배양에서 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
    2. 12-잘 접시에 셀 서 스 펜 션의 1 mL 접시 하 고 37 ° c ~ 24 h에 대 한 5% CO2 배양 기에서 품 어.
    3. Adipogenic 차별 매체와 문화 매체를 대체 ( 재료의 표참조)와 2-3 주 동안 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어. 일주일에 두 번 adipogenic 차별화 매체를 변경 합니다.
    4. PBS와 셀 세 번 씻어.
    5. 실시간에서 30 분 동안 4% 포름알데히드 용액에 세포를 품 어
    6. 셀 60% 소 프로 파 놀과 PBS 세 번 세 번 씻어.
    7. 0.5% 기름 빨간 O 솔루션 준비 석유의 84 mg를 용 해 하 여 빨간 O 100% 소 프로 파 놀과 추가의 6.7 mL 10 mL에서 증류수. 20 분에 대 한 실시간에 0.5% 기름 빨간 O 솔루션의 1 mL로 세포 얼룩.
    8. 60% 소 프로 파 놀과 셀 세 번 세척 하 고 현미경 시각화.
  2. 골을 수행 합니다.
    1. 1 × 104 셀/mL의 농도에서 배양에서 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
    2. 12-잘 접시에 셀 서 스 펜 션의 1 mL 접시 하 고 37 ° c ~ 24 h에 대 한 5% CO2 배양 기에서 품 어.
    3. Osteogeneic 차별 매체와 문화 매체를 대체 ( 재료의 표참조) 고 1-2 주 동안 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어. 일주일에 두 번 osteogenic 차별화 매체를 변경 합니다.
    4. PBS와 셀 세 번 씻어.
    5. 실시간에서 30 분 동안 4% 포름알데히드 용액에 세포를 품 어
    6. PBS와 셀 세 번 씻어.
    7. 알리자린의 200 mg를 용 해 하 여 2% 붉은 알리자린 S 용액 준비 빨간색 S 증류수 10 mL로. 2% 붉은 알리자린 S 솔루션 RT에서 3 분의 1 mL로 세포 얼룩.
    8. PBS와 웰 스 세 번 세척 하 고 현미경 시각화.
  3. Chondrogenesis을 수행 합니다.
    1. 1.6 × 107 셀/mL의 농도에서 배양에서 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
    2. 12-잘 접시 (micromass 문화)의 중심에 세포 현 탁 액의 5 µ L 방울을 배치 하 고 2-3 h 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어.
    3. 부드럽게 chondrogenic 차별화 매체의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 및 4-7 일 동안 37 ° c 5% CO2 배양 기에서 품 어. 일주일에 두 번 chondrogenic 차별화 매체를 변경 합니다.
    4. PBS와 셀 세 번 씻어.
    5. 실시간에서 30 분 동안 4% 포름알데히드 용액에 세포를 품 어
    6. PBS와 셀 세 번 씻어.
    7. Ph 4.1 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼의 500 mL와 함께 블루 톨루이의 250 mg를 용 해 하 여 0.05% 톨루이 블루 솔루션을 준비 합니다. 30 분에 대 한 실시간에 0.05% 톨루이 블루 솔루션의 1 mL로 세포 얼룩.
    8. PBS와 셀 세 번 세척 하 고 현미경 시각화.

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결과

MSC 문화 UC 컬렉션에서 절차는 그림 1에서 요약 된다. 길이 약 5-10 cm의 UC 제왕 절 개에 의해 전달 하는 모든 신생아에서 수집할 수 있습니다. UC는 임신의 4-8 주에 개발을 시작 하 고 그림 2와 같이 길이, 50-60 cm까지 성장 하 고. 그림 3 과 그림 4에서 같이 두 동맥 (A), 한 맥 (V), 코드 (CL), 안 감과 튼의 젤리 (WJ) UC에 있습니다. UC-MSCs 모든 코드 영역 또는 전체 코드13에서 격리 될 수 있습니다. 초기 임신 연령대와 유아에서 UC는 취약 하며 단일 코드 영역으로 해 부에 대 한 어려운, 때문에 UC MSCs 전체 코드11...

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토론

MSCs는 다양 한 조직에서에서 고립 될 수 있다 고 할 모든 익스프레스 같은 phenotypic 표식 셀의 이종 인구. 여기, 우리는 preterm와 기간 유아에서 수집 및 UC의 해 부 가이드 및 절연 UC MSCs의 문화를 가능 하 게 하는 프로토콜을 설명 했다. 이 프로토콜에 따라 우리는 성공적으로 고립 된 UC-MSCs ISCT 기준19 태아/유아 임신 19-40 주에 전달 하 고 다루기 힘든 질병 이상의 일부 측면을 나타내는 시연에서 충족 동안 태아 개발11,12.

BM 파생 MSCs (BM-MSCs), 젊은 기증자 파생 BM MSCs 일반적으로 이전 보다 더 큰 증식 및 differentiative 잠재력을 표시 하 고 셀 치료20,

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 Scientific Research (C)에 대 한 보조금에 의해 지원 되었다 (번호 부여: 25461644)와 젊은 과학자 (B) (번호 부여: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) JSP KAKENHI의.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
50 mL 플라스틱 튜브AS One Coporation, 오사카, 일본Violamo 1-3500-22
12-웰 플레이트AGC Techno Glass, Tokyo, JapanIwaki 3815-012
60 mm dishAGC Techno Glass, Tokyo, JapanIwaki 3010-060
Cell strainer (100 μ m)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Falcon 35-2360
세포 여과기 (70 μ m)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Falcon 35-2350
Alpha MEMWako Pure Chemical, Osaka, Japan135-15175
Fetal bovine serumSigma Aldrich, St. Louis, MO172012
Reduced serum mediumThermo Fisher Scientific, waltham, MAOPTI-MEM Gibco 31985-070
항생제-항진균제Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Gibco 15240-062
Trypsin-EDTAWako Pure Chemical, Osaka, Japan209-16941
PBSTakara BIO, Shiga, JapanT900
정제 효소 혼합물Roche, Mannheim, GermanyLiberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ347497Lot: 3220644, RRID:
CD19 BD Bioscience에 대한 AB_400312 PE 결합 마우스 1차 항체, Franklin Lakes, NJ340364Lot: 3198741, RRID:
CD34 BD Bioscience에 대한 AB_400018 PE 결합 마우스 1차 항체, Franklin Lakes, NJ555822Lot: 3079912, RRID:
CD45 BD Bioscience에 대한 AB_396151 PE 결합 마우스 1차 항체, Franklin Lakes, NJ555483Lot: 2300520, RRID:
CD73 BD Bioscience에 대한 AB_395875 PE 결합 마우스 1차 항체, Franklin Lakes, NJ550257 Lot: 3057778, RRID: CD90
에 대한 AB_393561 PE 결합 마우스 1차 항체, Franklin Lakes, NJ555596Lot: 3128616, RRID:
CD105 BD Bioscience에 대한 AB_395970 PE 결합 마우스 1차 항체, Franklin Lakes, NJ560839Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE 복합 마우스 1차 항체 HLA-DRBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE 복합 마우스 IgG1 k isotypeBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555749Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE 결합 마우스 IgG2a k isotypeBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555574Lot: 3035934, RRID: AB_ 395953
PE 결합 마우스 IgG2b k isotypeBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555743Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dyeBD Bioscience, Franklin Lakes, NJFixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagentDainippon Pharmaceutical, Osaka, JapanBlock Ace UKB80
FCMBD Bioscience, Franklin Lakes, NJBD FACS아리아  III 세포 분류기
FCM 소프트웨어BD Bioscience, Franklin Lakes, NJBD FACSDiva
지방 생성 분화 배지Invitrogen, Carlsbad, CAStemPro 지방 형성 분화 키트 A10070-01
골 형성 분화 배지Invitrogen, Carlsbad, CAStemPro 골 형성 분화 키트 A10072-01
연골 생성 분화 중간 Invitrogen, Carlsbad, CAStemPro 연골 형성 분화 키트 A10071-01
포름알데히드Polyscience, Warrigton, PA16% 초순수 포름알데히드 EM 등급 #18814
오일 레드 O시그마 Aldrich, St. Louis, MOO0625
Arizarin Red SSigma Aldrich, St. Louis, MOA5533
Toluidine BlueSigma Aldrich, St. Louis, MO
현미경Keyence, 일본 오사카BZ-X700
BD Bioscience198161

참고문헌

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