여기, 선물이 미토 콘 드리 아 호흡 및 Candida Albicans 에 glycolytic 기능 조사 stepwise 프로토콜 추가 유출 분석기를 사용 하 여.
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방법 논문
칸디 다 albicans 를 사용 하 여 실시간 세포 외 유출 분석의 바이오에 너 지론 조사
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
미토 콘 드리 아 세포 물질 대사 및 생존을 위한 필수적인 세포입니다. 미토 콘 드리 아, 세포 호흡, 산화 물질 대사, 신호 변환, apoptosis 등 다양 한 주요 행사 개최. 따라서, 미토 콘 드 리아 기능 장애는 항진균 약물 내성 및 병원 성 곰 팡이의 독성에 중요 한 역할을 보고 됩니다. 최근 데이터는 또한 곰 팡이 병의 중요 한 기여자는 미토 콘 드리 아의 중요성의 인식을 이끌어 냈다. 곰 팡이 생물학에서 미토 콘 드리 아의 중요성에도 불구 하 고 표준화 된 방법의 기능을 이해 하는 가난 하 게 개발 되었다. 여기, 기저 산소 소비 속도 (OCR), 미토 콘 드리 아 호흡의 측정 및 extracellular 산성화 요금 (ECAR), C. albicans 긴장 glycolytic 기능 측정 연구 절차 선물이. 여기 설명 하는 방법은 그대로 곰 팡이 세포에서 미토 콘 드리 아를 정화 하는 필요 없이 긴장 Candidaspp. 어떤에 적용할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜 또한 사용자 정의할 수 있습니다 C. albicans 긴장에 미토 콘 드리 아 기능 억제제에 대 한 화면으로.
서론
침입 균 감염 전세계 1 년 이상의 1.5 백만 명 죽 일. 이 번호는 손상 된 면역, 암 환자1, 이식 받는 사람, 노인, 조기 유아를 포함 하 여 생활 하는 사람들의 숫자에 증가 때문에. C. albicans 는 기회주의적 인간의 곰 팡이 병원 체 인간 microflora의 일부입니다. 그것은 또한 공생 생물으로 점 막 표면 및 위장에 서식. C. albicans 심각한 조직 질병 면역 결핍증, 누가 수술을 받은 또는 누가 항생제의 긴 과정을 함께 취급 하 고 있는 사람들을 생성 합니다. 병원내 감염 증 (NID) 인간2,3,4,5,,67의 상위 3 ~ 4 원인 중 칸디 다 종 차수입니다. 칸디 다 혈 류 량 감염의 연례 글로벌 수 ~ 400000 경우, 46-751의 연결된 mortalit....
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프로토콜
참고: 분석 결과의 상세한 stepwise 프로토콜은 아래, 설명 하 고 도식 프로토콜 그림 1에 표시 됩니다.
1. C. albicans 긴장 및 성장 조건
- C. albicans 긴장 성장 30 °C에서 인큐베이터 쉐이 커에 액체 효 모 추출-펩-포도 당 (YPD) 매체에서 하룻밤.
참고: 냉동된 주식으로 칸디 다 긴장을 유지 하 고 YPD agar (효 모 추출 물 1%, 2% 펩, 2% 포도 당, 및 2 %agar)에 성장.
2입니다. 시 약의 준비
- 다음과 같이 분석 결과 매체를 준비:
- 미토 콘 드리 아 기능 분석 결과 대 한 해산 1.04 g 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 분말과 포도 당 2 세대 (2%) 90 살 균 물과 따뜻한 37 ° c 미디어 7.4 5 M NaOH를 사용 하 여에 pH를 조정 하 고 메 마른 물 100 mL에는 볼륨을 구성 하.
- Glycolytic 스트레스 분석 결과 대 한 1.04 g RPMI 1640 분말 90 살 균 물 혼자를 분해 하 고 ....
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결과
이 프로토콜의 추가 유출 분석기에 의해 평가 되는 C. albicans 의 bioenergetic 기능을 결정 하는. C. albicans 돌연변이 미토 콘 드리 아 단백질 Mam33 부족의 보완 스트레인, OCR 및 ECAR 미토 콘 드리 아 단백질의 삭제의 효과 공부 mam33Δ/Δ::MAM33 함께 포함 되어 있습니다. MAM33 상 상속 미토 콘 드 리아 산 성 매트릭스 단백질 인코딩하고 칸디 다 에 그것의 기능을 알 수 없는 합니다.
핸드폰 번호 추가 유출 분석 결과 대 한
우리는 1 x 105 C. albicans 야생 타입 셀 당 145 pmol/min를 (그림 .......
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토론
생체 외 유출 분석 결과 산화 인 산화 (OXPHOS)를 측정 하 여 미토 콘 드리 아 기능을 읽을 수 있는 훌륭한 도구 역할-실시간으로 종속 산소 소비. 또한, extracellular 산성화 속도 (extracellular pH 변화)로 측정 한 glycolytic 기능 또한 실시간 분석에 동시에 조사 수 있습니다.
PDL 코팅 접시에 셀의 인큐베이션 허용 시험 접시에 셀 시험 접시에 C. albicans 의 성공적인 도금 분석 결과에 중요 한 단계 중 하나입니다. C. albicans 세포 접착의 시각화는 가벼운 현미경 검사 법에 의해 수행 됩니다. 잘못 된 셀 준수 셀 사이의 복제 일관성 읽기와 분석 결과 영향을 미칠 것입니다 우물에 떠 있는 발생할 수 있습니다. 마찬가지로, 그것은 100-300 pmol/min, 최적의 범위는 사이 OCR를이 분석 결과 첫 번째 단계도 셀 번호 적정을 수행 하는 것이 중요. 또한, 최적의 농도 얻기 위해 .......
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공개 사항
저자 공개할 게 없다
감사의 글
NC 랩에서 연구는 국립 보건원 (NIH) 그랜트 R01AI24499와 뉴저지 건강 재단 (NJHF) 부여, #PC40-18에 의해 지원 됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Mito 스트레스 키트 | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycin | Calbiochem | 495455 | |
| pH meter | Accumet | AR20 | |
| Phenol red | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| 염화나트륨 | Amresco | 241 | |
| 나트륨 하이드록시 펠릿 | J.T Baker | 3722 | |
| 조직 배양 등급 물 | Gibco | 1523-0147 | |
| XF 분석 보정 용액 | Agilent | 100840-000 | |
| 효모 추출물 펩톤 포도당 Fisher | scientific, | BP2469 | |
| 효모 추출물 펩톤 포도당 한천 | 시그마 | A1296 | |
| 효모 추출물 펩톤 글리세롤 | 시그마 | G2025 |
참고문헌
- Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).
- Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis ....
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재인쇄 및 허가
