이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

새로운 휴대용 체 외에 노출 카세트 졸 샘플링에 대 한

6.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58916

⸱

2019년 2월 22일

 ,  , 
1Department of Chemical and Life Science Engineering, Virginia Commonwealth University

이 논문에서

요약

여기, 선물이 휴대용 셀룰러 졸 노출을 수행 하 고 세포질 응답을 측정 하는 프로토콜. 메서드 사용 셀, vivo에서 생리학을 흉내 낸 공기 액체 인터페이스에서 성장 합니다. 구리 나노 입자에 어로 졸에 세포질 응답 반응성 산소 종 생성 및 세포 독성 젖 산 효소 방출으로를 통해 산화 긴장으로 관찰 되었다.

초록

이 프로토콜 소개는 새로운 체 외에 노출 시스템, 착용 되 고, 그것의 특성 및 성능을 포함 합니다. 공기 액체 인터페이스 (알리) 체 외에 노출 시스템은 종종 크고 부피, 어렵게 전송 필드 및 방출의 또는 호흡 영역 내 소스에서 운영. 이러한 시스템의 소형화를 통해 실험실 셀 문의 이전에 어로 졸을 변경 하지 않는 더 적절 한 노출 메서드를 제공 하 고 처리 시간을 신속 하 게 필드에 주어질 수 있다. 휴대용 노출 카세트 (PIVEC) 시험관에서 체 외에서 독성 전통적인 실험실 설정 이외의 테스트에 대 한 있도록 37mm 필터 카세트 적응. PIVEC 중량 측정에 따라 증 착 효율을 구리 나노 입자의 3 가지 크기를 사용 하 여 특징 이었다 및 입자 수 농도 분석. 초기 세포 독성 실험 노출된 폐 세포 세포 생존 능력을 유지 하면서 입자를 예금 하는 시스템의 능력을 결정 하기 위해 수행 되었다. PIVEC 사용 가능한 수직 흐름 체 외에 노출 장치에 비교할 때 비슷하거나 증가 증 착 효율을 제공 한다. 낮은 샘플 처리량에도 불구 하 고 작은 크기에 게 몇 가지 이점을는 현재 체 외에 알리 노출 시스템. 개인 모니터링에 대 한 착용 해야 포함 됩니다, 그리고 방출의 소스를 설정 하는 옵션은 실험실에서 이동성 낮은 사용자를 유지 하면서 공간 해상도 대 한 여러 시스템 비용. PIVEC 분야에서와 영역 내에서 호흡 한 공기 인터페이스, 생체 외에서 모델에 어로 졸을 수집 하는 시스템 이다.

서론

개인 샘플링 기술을 생체 외에서 사용 하는 직장에 어로 졸의 생물학적 효과 관한 포괄적인 정보를 제공할 수 있습니다. 1 공기 오염 물질에 노출 포함 어디 가스 도입 세포 현 탁 액을 간헐적으로 노출 로커, 또는 직접 장치를 사용 하 여 잠긴된 조건 하에서 수집 된 공기 샘플에 화학 물질 자체에 노출 공기 액체 인터페이스 (알리)에 노출 2 이러한 기술의 많은 세포 성장 정지 또는 각각 독물학 연구는에 어로 졸에 잠재적인 변경 영향을 미칠 수 노출 이전 샘플의 컬렉션에서 수행 됩니다. 3 이러한 변화를 피하기 위해, 실험실 주어질 수 있다 여러 생체 외에서 사용 하 여 필드에 문학,4,,56,7에서 사용 되는 알리 문화 노출 시스템 그러나 8,,910,11,,1213 , 몇 가지 상업적으로 사용할 수 있습니다. 8 , 9 , 12 이러한 시스템 들은 부피, 온도 습도 셀룰러 환경 샘플에 어로 졸의 유량을 조절 하는 계기를 포함 하는 경우에 특히 합니다. PIVEC를 사용 하 여 연 무질 노출 수행할 수 있습니다 전통적인 실험실 설정 또는 영역 내에서 호흡 흡입 조건을 흉내 낸 동안.

졸 증 착에서 체 외에서 의 결정 때문에 흡입에 건강 효과의 조사에 중요 하다. 호흡 영역 입과 코,14 에서 30 ㎝ 이내 지역 나노 입자에 노출 이해 및 폐의 생물학적 효과에 연결에 대 한 결정적 이다. 2 종종, 셀에 증 착으로 정의 된다 증 착 효율 입자에 입금 관리 시스템6,15 또는 동일한 금액의 대량 기초에 입자에 의해 분할 하는 세포에 의해 채택. 4 , 16 호흡 영역에 어로 졸 측정에 대 한 현재 메서드는 필터를 기반으로, 주어진된 샘플링 기간 동안 입자를 캡처 및 필터를 사용 하 여 추가 테스트를 수행 합니다. 17 개인 모니터링 적은 샘플의 거래와 함께 제공 되는 작은 시스템을 요구 한다.

연 무질에 노출에서의 건강 효과 결정에 많은 접근이 있다. 알리 모델 진짜 노출 시나리오에서 공기를 통해 셀에 직접 관리를 어로 졸에 대 한 수 있습니다 아직 더 비용 효율적 이며 같은 눈, 공기-액체 방 벽을 흉내 낸 동안 시간 비보에 보다 집중 연구 피부, 그리고 폐입니다. 폐 세포는 알리에서 성장 있다 편광된 방 벽 층,18,19 vivo에서 폐 상피, 점액 및 계면 활성 제 생산을 포함 하 여 특정에서 유사한 생리 적인 특성을 생성 하는 기능 기관지 또는 폐 포 셀 라인, 속눈썹 구타,19 꽉 접합,19,20 및 셀 분극. 18 같은이 독성 연구에서 측정 하는 세포질 응답에 영향을 미칠 수 변경 합니다. 21 또한, 알리 체 외 모델 결과 셀 보다 종종 더 민감한 서 스 펜 션 모델22 를 통해 노출 수와 흡입 독성 급성 vivo에서 모델. 23 , 24 그러므로 호흡 영역 내에서 측정을 수행할 수는 알리 노출 시스템은 자연적인 다음 단계입니다.

에 어로 졸 방출의 소스에서 직접 셀을 노출 하 여 모든 가스, 준 휘발성 화합물 및 혼합물에 관련 된 입자의 효과 발생 합니다. 필터에 혼합물을 수집 하는 때 가스와 휘발성 화합물 캡처되지 않습니다 그리고 전체 혼합물 조사 될 수 없습니다. 또한, 분말 또는 액체 현 탁 액으로 입자의 재구성 집계 또는 액체에 해산 등 입자-액체 상호 작용 될 수 있습니다. 25 , 26 연 무질 입자는 액체에 추가 되은 덩어리,25,27 형성 단백질 코로나,28 또는 증 착에 영향을 미칠 수 있습니다 액체에서 화합물과 상호 작용에 대 한 높은 잠재력과 생물학 응답에 영향을. 29 , 30

노출은 알리에 세 가지 주요에 어로 졸, 구름 안정화, 병렬 흐름, 프로필과 수직 흐름을 기반으로 합니다. 정착, 공기-액체 인터페이스 셀 노출 (앨리스)를 사용 하는 구름,4 일괄 처리 시스템 입자 중력 및 diffusional는 어로 졸은 하나의 단위로 취급 정착을 통해 입금. 노출 시스템 (처마)5 체 외에 정전기에 어로 졸 및 회관 노출 챔버 (MEC) II에서 사용 하는 병렬 흐름6 유량 프로 파일을 통해 브라운 모션의 추가 통해 증 착 할 수 있습니다. Microsprayer,7 체 외에서 독성 (NACIVT),11 및 상업 알리 시스템8,,910,12, 나노 졸 상공에서 사용 하는 수직 흐름의 impaction 추가 지역 내에서 증 착 입자입니다. 이러한 노출 시스템의 대부분은 크고 부피가 큰, 사전 조건 설정, 흐름, 펌프 또는 심지어 난방 셀의 보육에 대 한 챔버에 어로 졸에 대 한 초과 시스템 요구. 이 큰 크기는 시스템의 이동성을 감소합니다. 방출의 소스에서 직접 샘플링, 대신 이러한 시스템은 종종 샘플 분석을 위해 생성 하는 랩 또는 모델 연 무질에 있다. 방출 된에 어로 졸의 복잡성 실험실 분야에서 번역에 손실 될 수 있습니다. PIVEC 현재 시스템, 약 460 c m2 의 외부 표면적 보다 작은 이며, 매우 휴대용 장치에 대 한 수 있도록 시스템에 통합 열 및 습도 제어만 60 그램의 무게. 감소 크기와 무게를 착용 하거나 노출, 허용 하는 직접 샘플링의 소스에 찍은 시스템 허용.

현재 노출 시스템의 큰 크기 또한 농도에서 공간 그라디언트를 조사 하는 샘플링을 수행 하는 능력을 감소 시킵니다. 이 해상도 키 많은 잠재적인 환경 및 직업적 위험 차량 배기 미 립 자 물질 또는 직장 활동 등의 독성 효과 결정할 때 aerosolization 발생 합니다. 즉시 포스트 방출, 거기 입자 농도에 공간 분산이 된다. 이것으로 자 랍니다 시간 분위기를 통해 입자 분산 하 고 이러한 효과 변경할 수 있습니다 온도, 압력, 바람, 및 태양 등 주변 조건에 따라. 입자 나이 한 번 방출된31,32 산화를 시작할 수 있습니다 및 분산 요금; 지형에 의해 영향을 받습니다. 높은 농도 협곡 및 터널, 분산 효과 둔화, 그리고 낮은 농도 찾을 수 있습니다에서 찾을 수 것입니다 분산 큰 지역입니다. 33 분산 비율에 있는이 변화 인간의 건강에 중요 한 영향을 가질 수 있으며 천식 성인 시골 설정에서 대 도시에 살고 수를 비교할 때 볼 수 있습니다. 34 많은 노출 시스템은 한 번에 여러 샘플을 제공 하 고, 여러 시스템 공간 확인을 수행 하는 대형 장비에의 한 풍부한 필요 하다.

필드에 실험실을 가져와서 센서로 전체 셀을 사용 하 여 분석 시간을 감소 수 있습니다. 알려진된 생물 학적 메커니즘 및 끝점 졸 구성 및 크기의 결정에 도움이 됩니다. Mucociliary 안보와 먹어서, 전 좌를 포함 하 여 느린 정리 방법 때문이 입자는 종종 상호 작용 세포와 약 일 주3 생성 하는 산화 스트레스와 염증, 심지어 세포의 죽음에 대 한. 이러한 생물 학적 끝점 심혈 관 질환 또는 만성 폐쇄성 폐 질환에 대 한 불리 한 결과 경로 대 한 시작 지점이 될 수 있습니다. 또한, Wiemenn 그 외 다양 한 흡입 독성 vivo에서 짧은 기간에 대 한 문학의 가치와 비교 분석 실험 체 외에 수행. 35 Vivo에서 응답 두 젖 산 효소 자료, 티 감소와 과산화 수소 형성 및 릴리스 및 염증에서 잠재적인에서 산화 스트레스를 통해 세포 독성 테스트에서 4 개의 긍정적인 결과 예측 했다 종양 괴 사 인자 알파 유전자입니다. 10 nanosized 금속 산화물 테스트에서 6으로 테스트 활성 (산화 티 탄, 산화 아연, 및 4 개의 다른 세 륨 산화물) vivo에서확인 된 노출 시험관 을 사용 하 여. 

산업 설정에서에 어로 졸의 효과 공부 하기 위하여 우리의 실험실 PIVEC 필드에 노출에 대 한 개발. 또한,는 PIVEC 모니터링 하 고 37mm 필터 카세트36 같은 흡입 노출 조사 개인 샘플링에 대 한 착용 수 있습니다 또는 특정된 영역 내에서 공간적 해상도 달성 하기 위해 여러 시스템을 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 특성화 고는 PIVEC의 사용 설명 되어 있습니다. 노출, 생물학적 효과 세포 독성 분석 실험을 통해 관찰 된다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

연산자 때 개인 보호 장비 (예: 실험실 외 투, 장갑, 고글)을 착용 해야 합니다 1, 2, 3, 5, 및 6 단계를 수행.

1입니다. 자료의 준비

  1. 반복성을 보장 하기 위해 시스템 어셈블리 및 노출에 대 한 자료를 준비 합니다.
    1. 사용 하 여 새로운 또는 70% 에탄올 청소 ¼"내경 전도성 튜브와 ¼" 외경 커넥터 시스템 어셈블리에 대 한 있는지 확인 합니다.
    2. 저장소 테스트 자료 필터, 등 PIVEC 구성 요소, 핀셋, 입자 분말 온도 및 습도, 실험 하기 전에 적어도 24 시간 잘 제어 된 환경에서.
      참고: 온도 실내 온도, 약 20 ° C, 상대 습도 35% 미만 근처 이어야 한다. 이 실험 사이 반복성을 달성 하기 위해 매우 중요 하다.
    3. 소 프로 파 놀을 사용 하 여 부품을 청소 하 고 스캐닝 이동성 입자 크기 조절기 (SMPS) 및 측정을 위한 광 입자 sizer (작전)를 포함 하 여 제조업체 권장 사항에 따라 시스템 워밍업에 대 한 허용 하는 입자 카운터를 준비 합니다.

2입니다. 건조에 어로 졸의 생성

참고: 연산자 연기 후드에에 어로 졸 생성을 수행 해야 합니다.

  1. 건조에 어로 졸을 생성 하는 시스템을 조립
    참고: 가스 또는 액체에서 입자의 현 탁 액 모델된 응용 프로그램 및 세포 문화에 적합 해야 합니다. 다음 메서드는 액체 기반의 어로 졸을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 임씨 외에서 건조에 어로 졸 시스템의 디자인이입니다. 37 건조 분산 시스템의 회로도 그림 1에 표시 됩니다.
    1. 4"1/8 크기 스레드 파이프의 양끝을 연결 하는 볼 밸브,이 입자 호퍼로 될 것입니다. 1 밸브를 2"1/8 크기 파이프를 연결 합니다.
    2. 구리 나노 입자의 무게,이 연구에서는 각 입자 크기에 대 한 대량 농도 일정 하 게 유지 증 착 효율을 결정 하는 동안. 약 40 nm 구리 나노 입자의 7.5 mg, 100 nm 구리 나노 입자의 7 mg 및 노출 당 800 nm 구리 나노 입자의 13 mg을 사용 합니다. 오픈 엔드를 통해 입자 호퍼로 구리 나노 입자를 놓습니다.
      참고: 무게 구리 나노 입자의 크기는 질량 관리 농도 기반으로 될 것입니다.
    3. 장소 3"½" 외경 (OD) 튜브 2"파이프와 장소는 흐름 방향 볼 밸브를 통해이 짧은 튜브 안에 HEPA 필터의 조각.
    4. 스레딩 사용 하 여 다른 볼 밸브를 진공 발생기를 연결 합니다. 그것이 푸시-투-잠금 연결에는 5/16"OD 튜브를 삽입 하 여 공기 탱크 진공 발생기를 연결 합니다. ¼"OD 튜브를 사용 하 여 진공 발생기의 출구 위에 튜브를 삽입 하 여 실험 설정에 진공 발생기의 콘센트를 연결할.
  2. 건조에 어로 졸을 생성 하기 위해 건조에 어로 졸 시스템의 사용
    1. 메인 밸브를 선회 하 여 공기 탱크를 열고 시스템 공기 흐름을 허용 합니다. 공기 탱크에 밸브에 밸브 열고 되도록 시스템을 통해 흐름은 진공 펌프에 원하는 설정을 설정 합니다.
    2. HEPA 필터에 가장 가까운 볼 밸브를 열고 진공 발생기에 가장 가까운 볼 밸브를 엽니다. 약 3 뜨고이 입자는 공기 흐름으로 끌어올 수 있도록 s.
    3. 진공 발생기 다음 볼 밸브 HEPA 필터에 가장 가까운 가장 가까운 볼 밸브를 닫습니다. 필요에 따라 실험의 기간에 대 한 흐름을 탱크에서 공기를 허용 합니다.
    4. 흐름을 중지 하려면 공기 탱크에 메인 및 레 귤 레이 터 밸브를 닫습니다. 깨끗 한 볼 밸브 그리고 70% 에탄올을 사용 하 여 진공 발생기. 오토 클레이 브 살 균에 대 한 금속 파이프입니다.

3. 증 착 효율 측정 PIVEC를 사용 하 여

참고: 연산자 연 무질 노출 연기 후드에서 수행 해야 합니다.

  1. 2.2 사전 무게 필터에 단계에서 생성 된 구리 나노 입자에 어로 졸을 수집 하 여 증 착을 측정 합니다. 예금 된 복용량, 필터에 수집 된 질량을 사용 하 여 측정 및 증 착 효율을 결정 하기 위해 무게가 구리 입자의 금액을 사용 하 여 측정 관리 복용량을 사용 합니다.
    1. 낮은 습도 조건, 1.1.2, 적어도 24 시간 이전에 사전 노출 측정에 대 한 설명에서 1.00 µ m 기 공 유리 섬유 필터를 유지 합니다. 무게는 사용 하지 않는 필터 세 번 하 고 필터 무게를 기록 합니다. 장소 세포 배양에 사용 하지 않는 필터를 삽입 합니다.
    2. PIVEC 필터 셀 문화 삽입을 지원 하기 위해 적절 한 셀 문화 삽입 어댑터 (6 잘 또는 24 잘)을 선택 합니다. 장소 세포 배양 PIVEC, 어댑터의 기본은 상단 보다 넓은 그런 곳으로 설정의 기본 상단 어댑터 조각을 삽입 합니다.
    3. 필터 로드 셀 문화를 사용 하 여 족집게 어댑터 조각 내 삽입 합니다. 장소는 윗부분의 상단 보다 넓은 장소에 정착 하는 어댑터 조각 위에 상단 부분. 덕트 테이프의 단일 층으로 PIVEC 랩.
    4. 장소에 밀어 PIVEC의 상단과 하단에 37 mm 카세트 조각을 연결 합니다. 카세트 입구와 출구에 ¼"가시 어댑터를 놓습니다.
    5. 전선 기지에서 되도록 저항 히터 PIVEC 주위를 바꿈. 테이프 보안입니다.
    6. 단 열을 위한 알루미늄 호 일의 ~ 8 라운드와 PIVEC 랩. 테이프와 보안.
    7. 연결 2"1/2" 외경 유연한 튜브를 PIVEC 위에 어댑터의 긴 조각. 살 균 물과 PIVEC 위에 튜브 내에서 다공성 튜브를 제거 합니다.
    8. 링 받침대 및 클램프 내 PIVEC를 놓습니다. 진공 펌프, 파티클 카운터, 그리고에 어로 졸 설정 완벽 한 설정 했다.
      참고: 숫자 기반 예금 된 복용량 입자 카운터는 PIVEC 전후 별도 실행에 PIVEC 배치 하는 경우에 확인할 수 있습니다.
    9. 0.5 LPM에 10 분의 노출 시간 사용 되었다이 연구에서 단계 프로토콜 및 원하는 노출 시간과 흐름 속도의 2.2를 사용 하 여 필터를 표시 합니다. 설정에서 PIVEC를 제거 합니다. 셀 문화 삽입을 꺼내와 필터 홀더 측정 하기 전에 적어도 24 h에 대 한 낮은 습도 조건에서 노출된 필터를 놓습니다.
    10. 70% 에탄올 PIVEC 청소. 다음 실험 전에 적어도 30 분 동안 자외선으로 소독.
    11. 세 번 노출된 필터의 무게와 필터 무게 기록. 스토리지에 대 한 레이블된 필터 홀더에 노출된 필터를 배치 합니다.

4. 입금된 복용량 및 증 착 효율의 계산

참고: 증 착의 기술에 어로 졸 관리 및 세포질 응답의 해석에 대 한 중요 하다.

  1. 질량 기반 측정에서 증 착을 계산
    1. 사전 노출 평균 무게와 사후 노출 평균 체중으로 필터에 예금 된 질량을 계산 합니다. 이 값은 실험에 대 한 질량 기반 예금 된 복용량.
    2. 사용 질량, m관리자, 관리 그리고 복용량 질량 기반 증 착 효율, ηm, 실험에 대 한 계산을 4.1.1, mdep에 결정 예금 대량 기반.
      figure-protocol-1
    3. 4.1.1와 4.1.2 증 착을 결정 하기 위해 최소 3 실험 및 입자 크기에 대 한 증 착 효율 PIVEC에 대 한 평균 값입니다.
  2. 숫자 기반 측정에서 증 착을 계산
    1. PIVEC 전에 입자 농도 결정 하 고는 PIVEC 후 입자 카운터로 측정 카운터 수행 되는 확인 합니다. 입자 카운터는 시간이 지남에 입자 농도 통합 다음 총 결정 입자 직경 이상 통합 입자 측정.
    2. 관리 하는 입자와 입자 측정 게시물 PIVEC의 차이로 예금 된 입자 수를 계산 합니다. 이 값은 실험에 대 한 숫자 기반 예금 된 복용량.
    3. 관리 사용 입자, n관리자, 숫자 기반 예금 수 기반 증 착 효율, ηn, 실험에 대 한 계산을 복용량, ndep, 체적 유량, V, 및 시간, t.
      figure-protocol-2
    4. 4.2.2 및 증 착을 결정 하기 위해 최소 3 실험에 대 한 4.2.3 및 입자 크기에 대 한 증 착 효율 PIVEC에 대 한 평균 값입니다.

5. 연 무질 노출 셀의

참고: 셀에 대 한 공기-액체 인터페이스 독자 문화가 불린다 빈 외. 38 연산자 셀 문화 삽입 biosafety 내각 내에서 (단계 5.1.2-5.1.4)를 로드를 수행 해야 합니다. 연산자는 증기 두건에서 연 무질 노출을 수행 해야 합니다.

  1. 공기 액체 인터페이스에 문화 세포
    1. A549 세포 문화 플라스 크에서 트립 신-EDTA, T75 플라스 크 또는 T25 플라스 크 1 mL 3 mL를 추가 하 여 고 37 ° c.에 5 분 동안 품 어 복구 된 셀 수를 최대화 하 T25 플라스 크를 플라스 크 및 린스 플라스 크 벽 셀 서 스 펜 션에 대 한 완전 한 미디어 T75 플라스 크 또는 완전 한 미디어의 4 mL의 7 mL를 추가 합니다. 살 균 15 mL 원뿔 튜브 다음 3 분 800 x g 에서 원심 분리기 세포에 세포 현 탁 액을 전송 합니다.
    2. 표면에 뜨는 포함 트립 신-EDTA를 제거 하 고 완전 한 미디어 10 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 세포 현 탁 액의 10 µ L을 제거 하 고는 hemocytometer를 추가. 농도 세포의 총 수를 결정 하는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
    3. 완전 한 미디어의 0.5 mL 24 잘 배지 내의 각 잘 배치 합니다. 웰 스에서 사용 되지 않는 셀 문화 삽입을 배치 합니다. 종자 세포 배양 1 x 105 셀/cm2 일 당 2 배 가까운 속도로 성장 하는 세포 유형 근처 셀 밀도에 꼭대기 쪽에 삽입 합니다. 씨앗 A549 세포 내에 24가 잘 삽입, 셀 문화 35000 셀을 추가 하 여 1 x 105 셀/c m2 의 조밀도에 씨 셀 삽입 합니다.
      참고: 느린 성장 율을 가진 세포 증가 세포 조밀도에 시드할 수 있습니다.
    4. (24 잘 플레이트 최종 볼륨은 0.25 mL)에 대 한 최종 볼륨을 연결할 셀 문화 삽입의 꼭대기 쪽에 완전 한 미디어를 추가 합니다.
    5. 잠긴된 조건, 대체 미디어 매 1-2 일에서에서 7 일에 대 한 문화. 7 일 후 basolateral 미디어만 교체 알리 조건에서 적어도 1 일 꼭대기 미디어와 문화를 제거 합니다.
  2. PIVEC 조립
    1. 적어도 24 시간 이전에 노출에 대 한 공기-액체 인터페이스 equilibrate를 셀 수 있습니다.
    2. PIVEC 필터 셀 문화 삽입을 지원 하기 위한 적절 한 세포 문화 삽입 어댑터를 선택 합니다. 장소 세포 배양 PIVEC 기본, 어댑터의 기본은 상단 보다 넓은 그런 곳으로 설정 위에 어댑터 조각을 삽입 합니다. PIVEC의 기지의 우물에 세포 배양의 4 mL를 추가 합니다.
    3. 세포 배양 장소 사용 족집게 어댑터 조각 단계 5.2.3에에서 배치 내에서 삽입 합니다. 장소는 윗부분의 상단 보다 넓은 장소에 정착 하는 어댑터 조각 위에 최고 조각. 신중 하 게, 덕트 테이프의 단일 층으로 PIVEC 랩.
    4. 장소에 밀어 PIVEC의 상단과 하단에 37 mm 카세트 조각을 연결 합니다. 카세트 입구와 출구에 ¼"가시 어댑터를 놓습니다.
    5. 전선 기지에서 되도록 저항 히터 PIVEC 주위를 바꿈. 테이프 보안입니다.
    6. 단 열을 위한 알루미늄 호 일의 ~ 8 라운드와 PIVEC 랩. 테이프와 보안.
    7. 1/2"외경 유연한 튜브의 짧은 조각 PIVEC 위에 어댑터를 연결 합니다. 살 균 물과 PIVEC 위에 튜브 내에서 다공성 튜브를 제거 합니다.
    8. 링 받침대 및 클램프 내 PIVEC를 놓습니다. 진공 펌프와에 어로 졸 설치 설치를 완료 합니다.
  3. 에 알리는 PIVEC를 사용 하 여 셀을 노출
    1. 사용 하 여 증 착 효율 2 단계에서에서 결정 될 aerosolized 입자의 질량을 계산. 적절 한 질량의 무게 하 고 연기 후드 내에서 2 단계를 다음 설정에 어로 졸 시스템에 추가 합니다.
    2. 폭로 다음 단계 2.2 세포 생물학 끝점의이 연구에서는 셀 0.5 LPM의 유량과 구리 나노 입자의 약 3.5 m g에 노출 됐다, 10 분 제어 연구 수행의 노출 기간 사용 습도 공기를 결정 혼자 공기의 영향입니다. 설정에서 PIVEC를 제거 합니다. 셀 문화 삽입에 밖으로 가십시오 살 균 잘 접시에 놓고 CO2 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2, 90 %RH)를 반환 합니다.
    3. 미디어 PIVEC에서 발음 추가 실험을 수행 하는 경우 린스 하단 PIVEC의 인산 염 버퍼 솔루션 다음 반복 단계 5.1 및 5.2.
    4. 70% 에탄올 끝나면 PIVEC 청소. 다음 실험 전에 적어도 30 분 동안 자외선으로 소독.
  4. 생물 학적 분석 결과 절차
    참고:이 연구에서 수행 하는 분석 실험 했다 DCFH-다 분석 결과 통해 산화 긴장 생성 및 젖 산 효소 (LDH) 자료를 통해 세포 독성.
    1. 1mm DCFH 다 솔루션 50 mL 메탄올에 DCFH-다의 24.4 mg을 디졸브. 이 솔루션은 최대 4 개월 동안-20 ° C에 저장할 수 있습니다. 9.9 mL 10 µ M의 10 mL를 만들려고 HBSS로 1 mM DCFH-다 솔루션의 0.1 mL를 혼합 하 여 1 mM DCFH-다 솔루션을 희석 DCFH 검사
    2. 세포 배양 및 세척 세포 문화 삽입 약 1 mL의 PBS로 제거 합니다. 교체 삽입 완료 되 면 각 음에 10 µ M DCFH-다 솔루션의 0.5 mL를 추가 합니다. 커버는 염료의 photoactivation를 방지 하 고 37 ° C 배양 기 1 시간에 대 한 반환을 알루미늄 호 일로 접시.
    3. 인큐베이터에서 셀을 제거 하 고 우물에서 DCFH 다 작업 솔루션 발음. 0.5 mL HBSS 우물을 추가 하 고 셀 문화 삽입 교체.
    4. 485/530의 여기/방출 파장을 사용 하 여 플레이트 리더와 측정 기준 형광에 잘 플레이트 로드 nm. 노출에 대 한 플레이트 리더와 부하 삽입 PIVEC에 플레이트를 제거 합니다.
    5. 원하는 노출 기간에 대 한 셀을 노출 합니다. PIVEC에서 삽입을 제거 하 고 잘 플레이트에 반환. 잘 플레이트와 화이트 96 잘 접시에 장소에서 basolateral 액체의 50 µ L을 제거 합니다. DCF 사용 하 여 485/530의 여기/방출 파장의 형광을 측정 nm 마다 30 분 2 시간에 대 한 사후 노출.
    6. 하자 basolateral 액체 LDH 시험 솔루션, 혼합된 다음 제조 업체 프로토콜의 20-30 분 추가 50 µ L에 대 한 실내 온도에 equilibrate, 잘 플레이트에서 basolateral 액체에 잘 정지 솔루션의 추가 25 µ L 10 분에 대 한 반응. 560/590의 여기/방출 파장을 사용 하 여 resorufin 제품의 형광을 읽고 nm.
    7. 추가 basolateral 액체를 제거 하 고 4 시간 및 24 시간 후 노출 5.4.6 단계를 반복.

6 통계적 방법

  1. 생물 학적 분석 결과 데이터의 분석
    1. 초기 측정 기준으로 치료 세포의 형광 강도 증가 보고서 선생님 생산. LDH 활동 치료 세포 치료 셀 기준의 형광 강도 증가 보고.
    2. 단일 요소 데이터 세트 간의 통계적 차이 결정 하는 ANOVA를 수행 합니다. 적절 한, 학생 t-값이 0.05의 중요성에서 테스트를 수행 합니다. 적어도 3 개의 노출 측정의 평균 ± 표준 편차로 데이터를 보고 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

직업 생체 외에서 독성 연 무질 노출 수행 하는 동안 세포 생존 능력을 유지 포함 한다. 그림 2, 온도 및 습도 제어 및 착용된 PIVEC PIVEC 시스템 표시 됩니다. 온도 배터리 전원 저항 히터를 사용 하 여 유지 되었다 그리고에 어로 졸을 사용 하 여 습도 증가 다공성, 유체 튜브를 통해 자연가 습. 실험실 내부 설정 제어 졸는 PIVEC 그림 1에 표시 된 노출에 대 한 일 수 있습니다. 시스템의 세포를 세포 응답에 그 때 상관 될 수 있는 예금 된 복용량의 결정에 대 한 수 있습니다.

증 착 효율 때문에 증 착 세력 등 impaction, 침전, 보급 시스템에 추가 하는 입자의 크기에 따라 달라 집니다. 또한, 증 착 유량, 노출...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

필터 카세트 호흡 영역; 연 무질 수집의 간단 하 고 저렴 한 방법을 제공합니다 그러나, 졸 샘플 필터에서 추출 할 하지 전체 졸 (가스, 휘발성, 및 미 립 자)를 대표 하 고 따라서 제한 관련된 생물 효과의 평가. 37mm 필터 카세트의 초기 디자인을 사용 하는 PIVEC는 이동성을 유지 하 고 흡입에서 입자의 비보에 증 착을 모방 하도록 설계 되었습니다. PIVEC 현재 알리 노출 시스템, 포함 하는 온도 및 습도 제어와 티슈 상자의 대략 크기 보다 훨씬 작습니다. 크기는 또한는 어로 졸에 세포질 응답에 대 한 데이터를 제공 하면서 개인 캐스케이드 impactors 비슷합니다. PIVEC 다른 현재 노출 시스템에 비해 한 샘플에 대 한 공간을 포함, 소형 샘플 크기 증가 모니터링할 공간 배급 따라서, 여러 시스템을 한 번에 사용할 수 허용 합니다.

프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 증 착 효율을 확인 하려면 1 단계에서에서 설명한 대로 제대로 된 필...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

표지 페이지에 표시 된 저자의 소속이입니다. 저자는 버지니아 연방 대학, 일 리치몬드, 버지니아에 완성 되었다에 의해 재정적으로 지원 저자는 쓰기와이 문서의 내용에 대 한 단독 책임이 있다. 저자 아무 경쟁 관심사 다는 것을 선언 합니다.

감사의 글

저자는 보리스 Solomonov 및 버지니아 연방 혁신 기계 공장에 대 한 신속한 프로토 타입 장치 도움말 감사 합니다 싶습니다. 저자 또한 크리스티안 로메로-르윈스키 그룹의 푸 엔 테 스, 닥터 비탈리 Avrutin, 박사 드미트리 Pestov, 버지니아 커먼 웰 스 나노 소재 핵심 특성화 시설 그들의 도움에 대 한 입자 묘사와 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 버지니아 연방 대학에서 공학 대학 박사 르윈스키에 게 제공 하는 시작 자금에 의해 지원 되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
스캐닝 이동성 입자 사이저(SMPS)TSI, Inc.3910나노 SMPS
광학 입자 사이저 (OPS)TSI, Inc.3330
스테인레스 스틸 파이프, 4" 길이McMaster-Carr4830K116표준-벽 304/304L, 양쪽 끝에 나사산, 레버 핸들이 있는 1/8 파이프 크기
황동 볼 밸브McMaster-Carr4112T12소형 고압 등급, 1/8 NPT 여성
강관, 2" 길이McMaster-Carr7753K121표준 벽, 한쪽 끝에 나사산, 1/8 파이프 크기
HEPA 필터GE 헬스케어09-744-12HEPA-Cap 일회용 공기 여과 캡슐
진공 발생기PISCO USAVCH10-018C
PIVECVCU디자인은 저자에게 문의하십시오
저항성 히터
1/4" 철조망 커넥터Zefon International, Inc.
다공성 튜브Scientific Commodities, Inc.BB2062-1814A친수성 10um 기공
배터리 전원 은행
세포 배양 인서트Fisherbrand35309524웰 플레이트 인서트
필터 집게Fisherbrand09-753-50
전사 피펫ThermoScientific13-711-27
유리 섬유 필터SKC225-7바인더 프리 타입 AE 필터 37MM 1.00um 기공
울트라 마이크로 밸런스A& DBM-22환경 챔버에 보관
37mm 필터 카세트SKC225-3250필터 카세트 블랭크, 37mm, 투명 스티렌
가변 유량 진공 펌프SKC220-5000TCAirChek TOUCH, 5 - 5000 mL/min
구리 입자U.S. Research Materials, Inc.US109040nm
구리 입자미국 연구 재료, Inc.US1088100nm
구리 입자미국 연구 재료, Inc.US1117M800 nm
459743

참고문헌

  1. Lewinski, N. A., Secondo, L. E., Ferri, J. K. Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace Enabling Real-Time Hazard Assessment at the Workplace. 14th Global Congress on Process Safety. , 1-9 (2018).
  2. Bakand, S., Winder, C., Khalil, C., Hayes, A. Toxicity assessment of industrial chemicals and airborne contaminants: transition from in vivo to in vitro test methods: a review. Inhalation Toxicology. 17, 775-787 (2005).
  3. Bakand, S., Hayes, A. Troubleshooting methods for toxicity testing of airborne chemicals in vitro. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 76-85 (2010).
  4. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32(2009).
  5. de Bruijne, K., et al. Design and testing of Electrostatic Aerosol in Vitro Exposure System (EAVES): an alternative exposure system for particles. Inhalation Toxicology. 21, 91-101 (2009).
  6. Asimakopoulou, A., Daskalos, E., Lewinski, N., Riediker, M., Papaioannou, E., Konstandopoulos, A. G. Development of a dose-controlled multiculture cell exposure chamber for efficient delivery of airborne and engineered nanoparticles. Journal of Physics: Conference. 429, 1-10 (2013).
  7. Grigg, J., et al. DNA damage of macrophages at an air-tissue interface induced by metal nanoparticles Macrophage. Nanotoxicology. 3 (4), 348-354 (2009).
  8. Aufderheide, M., Knebel, J. W., Ritter, D. An improved in vitro model for testing the pulmonary toxicity of complex mixtures such as cigarette smoke. Experimental and Toxicologic Pathology. 55, 51-57 (2003).
  9. Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive technical approach for the in vitro exposure of airway epithelial cells to the particulate matter at the air-liquid interface. BioMed Research International. 2013 (1), 1-15 (2013).
  10. Tippe, A., Heinzmann, U., Roth, C. Deposition of fine and ultrafine aerosol particles during exposure at the air/cell interface. Journal of Aerosol Science. 33, 207-218 (2002).
  11. Savi, M., et al. A novel exposure system for the efficient and controlled deposition of aerosol particles onto cell cultures. Environmental Science and Technology. 42, 5667-5674 (2008).
  12. Fröhlich, E., et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicology in Vitro. 27, 409-417 (2013).
  13. Frijns, E., et al. A Novel Exposure System Termed NAVETTA for in Vitro Laminar Flow Electrodeposition of Nanoaerosol and Evaluation of Immune Effects in Human Lung Reporter Cells. Environmental Science and Technology. 51 (9), 5259-5269 (2017).
  14. Vincent, J. H. Aerosol Science for Industrial Hygienists. , Elsevier. (1995).
  15. Fujitani, Y., Sugaya, Y., Hashiguchi, M., Furuyama, A., Hirano, S., Takami, A. Particle deposition efficiency at air-liquid interface of a cell exposure chamber. Journal of Aerosol Science. 81, 90-99 (2015).
  16. Elihn, K., Cronholm, P., Karlsson, H. L., Midander, K., Odnevall Wallinder, I., Möller, L. Cellular Dose of Partly Soluble Cu Particle Aerosols at the Air-Liquid Interface Using an. In Vitro Lung Cell Exposure System. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 26 (2), 84-93 (2013).
  17. Aerosols Handbook Measurement, Dosimetry, and Health Effects. , CRC Press. Boca Raton. (2005).
  18. de Souza Carvalho, C., Daum, N., Lehr, C. M. Carrier interactions with the biological barriers of the lung: Advanced in vitro models and challenges for pulmonary drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 75, 129-140 (2014).
  19. Fattal, E., Grabowski, N., Mura, S., Vergnaud, J., Tsapis, N., Hillaireau, H. Lung Toxicity of Biodegradable Nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology. 10 (10), 2852-2864 (2014).
  20. Klein, S. G., Serchi, T., Hoffmann, L., Blömeke, B., Gutleb, A. C. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Particle and Fibre Toxicology. 10, 31(2013).
  21. Oberdörster, G., et al. Principles for characterizing the potential human health effects from exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre Toxicology. 2, 8(2005).
  22. Secondo, L. E., Liu, N. J., Lewinski, N. A. Methodological considerations when conducting in vitro, air-liquid interface exposures to engineered nanoparticle aerosols. Critical Reviews in Toxicology. , 1-32 (2016).
  23. Sayes, C. M., Reed, K. L., Warheit, D. B. Assessing toxicology of fine and nanoparticles: Comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles. Toxicological Sciences. 97 (1), 163-180 (2007).
  24. Maier, K. L., et al. Health effects of ambient particulate matter--biological mechanisms and inflammatory responses to in vitro and in vivo particle exposures. Inhalation Toxicology. 20 (May 2007), 319-337 (2008).
  25. Cohen, J. M., Teeguarden, J. G., Demokritou, P. An integrated approach for the in vitro dosimetry of engineered nanomaterials. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 20(2014).
  26. Deloid, G., et al. Estimating the effective density of engineered nanomaterials for in vitro dosimetry. Nature Communications. 5, 3514(2014).
  27. Pal, A. K., Bello, D., Cohen, J., Demokritou, P. Implications of in vitro dosimetry on toxicological ranking of low aspect ratio engineered nanomaterials. Nanotoxicology. , 1-15 (2015).
  28. Walkey, C., et al. Protein corona fingerprinting predicts the cellular interaction of gold and silver nanoparticles. ACS Nano. 8 (3), 2439-2455 (2014).
  29. Raemy, D. O., et al. Effects of flame made zinc oxide particles in human lung cells - a comparison of aerosol and suspension exposures. Particle and Fibre Toxicology. 9 (1), 33(2012).
  30. Holder, A. L., Lucas, D., Goth-goldstein, R., Koshland, C. P. Cellular response to diesel exhaust particles strongly depends on the exposure method. Toxicological Sciences. 103 (1), 108-115 (2008).
  31. Sanderson, P., et al. Characterisation of iron-rich atmospheric submicrometre particles in the roadside environment. Atmospheric Environment. 140. , 167-175 (2016).
  32. Burtscher, H. Physical characterization of particulate emissions from diesel engines: A review. Journal of Aerosol Science. 36 (7), 896-932 (2005).
  33. Ris, C. U.S. EPA health assessment for diesel engine exhaust: a review. Inhalation Toxicology. 19 (Suppl. 1), 229-239 (2007).
  34. Jie, Y., Isa, Z. M., Jie, X., Ju, Z. L., Ismail, N. H. Urban vs. Rural Factors That Affect Adult Asthma. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology. 226, (2013).
  35. Wiemann, M., Vennemann, A., Sauer, U. G., Wiench, K., Ma-Hock, L., Landsiedel, R. An in vitro alveolar macrophage assay for predicting the short-term inhalation toxicity of nanomaterials. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 16(2016).
  36. Kenny, L. C., et al. A collaborative european study of personal inhalable aerosol sampler performance. Annals of Occupational Hygiene. 41 (2), 135-153 (1997).
  37. Tiwari, A. J., Fields, C. G., Marr, L. C. A Cost-Effective Method of Aerosolizing Dry Powdered Nanoparticles. Aerosol Science and Technology. 47 (11), 1267-1275 (2013).
  38. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An Optimized In Vitro Model of the Respiratory Tract Wall to Study Particle Cell Interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19 (3), 392-405 (2006).
  39. Laboratory, N. C. NCL Method GTA-2 HEP G2 Hepatocarcinoma Cytotoxicity Assay. (November), 1-9 (2015).
  40. Kim, J. S., Peters, T. M., O'Shaughnessy, P. T., Adamcakova-Dodd, A., Thorne, P. S. Validation of an in vitro exposure system for toxicity assessment of air-delivered nanomaterials. Toxicology in Vitro. 27 (1), 164-173 (2013).
  41. Mertes, P., et al. A compact and portable deposition chamber to study nanoparticles in air-exposed tissue. Journal of aerosol medicine and pulmonary drug delivery. 26 (0), 228-235 (2013).
  42. Panas, A., et al. Silica nanoparticles are less toxic to human lung cells when deposited at the air-liquid interface compared to conventional submerged exposure. Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1590-1602 (2014).
  43. Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in air-liquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicology Research. 6, 448-459 (2017).
  44. Jing, X., Park, J. H., Peters, T. M., Thorne, P. S. Toxicity of copper oxide nanoparticles in lung epithelial cells exposed at the air - liquid interface compared with in vivo assessment. TOXICOLOGY IN VITRO. 29 (3), 502-511 (2015).
  45. Bitterle, E., et al. Dose-controlled exposure of A549 epithelial cells at the air-liquid interface to airborne ultrafine carbonaceous particles. Chemosphere. 65, 1784-1790 (2006).
  46. Steinritz, D., et al. Use of the Cultex Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
  47. Cronholm, P., et al. Intracellular uptake and toxicity of Ag and CuO nanoparticles: A comparison between nanoparticles and their corresponding metal ions. Small. 9 (7), 970-982 (2013).
  48. Cronholm, P., Midander, K., Karlsson, H. L., Elihn, K., Wallinder, I. O., Möller, L. Effect of sonication and serum proteins on copper release from copper nanoparticles and the toxicity towards lung epithelial cells. Nanotoxicology. 5 (2), 269-281 (2011).
  49. Midander, K., et al. Surface characteristics, copper release, and toxicity of nano- and micrometer-sized copper and copper(ll) oxide particles: A cross-disciplinary study. Small. 5 (3), 389-399 (2009).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

기액 계면나노입자 증착폐 세포 노출중량 분석입자 수 농도구리 나노입자인 비트로 독성현장 노출 시스템
새로운 휴대용 체 외에 노출 카세트 졸 샘플링에 대 한
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.