방법 논문

셀의 Cardiomyogenic 잠재력 향상을 동시 전기 및 기계적 자극

DOI:

10.3791/58934

⸱

2019년 1월 18일

 ,  , 
1Insuficiencia Cardiaca y Regeneración Cardiaca (ICREC) Research Program, Health Science Research Institute Germans Trias i Pujol, 2Amsterdam Universitair Medisch Centrum (UMC), Vrije Universiteit Amsterdam, Pulmonology and Physiology, Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3Electronic and Biomedical Instrumentation Group, Departament d'Enginyeria Electrònica, Universitat Politècnica de Catalunya, 4Cardiology Service, Germans Trias i Pujol University Hospital, 5Department of Medicine, Universitat Autònoma de Barcelona, 6Centro de Investigación Biomédica en Red (CIBER) Cardiovascular, Instituto de Salud Carlos III

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기 선물이 심장 생리학을 모방 하는 전기 및 기계적 자극을 사용 하 여 셀 인구를 교육 하기 위한 프로토콜. 이 전기 자극 치료 세포의 cardiomyogenic 잠재력을 강화 하 고 더 세포 치료, 질병 모델링 및 의약품 심사를 위한 유망한 전략 이다.

초록

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심혈 관 질환 선진국에서 죽음의 주요 원인입니다. 따라서, 효과적인 심장 세포 치료에 대 한 수요는 체 외에서 높은-충실도 인간의 심근 기초 연구 및 임상 응용 프로그램을 개발 하는 줄기 세포와 생명 공학 분야에서 연구 동기는. 그러나, 심장 세포의 미 숙 형 기능 모방 기계 및 전기 신호에 의해 주로 특징은 성인 심근 조직에 제한 사항입니다. 따라서,이 프로토콜의 목적은 준비 하 고 대상 셀 인구 전기 자극을 통해 생리 적 매개 변수 업과 성숙입니다. 심장 조직 공학 더 많은 생물 학적 접근, 방향으로 진화 하 고 전략 기반 생물 자극, 따라서, 기세를 얻고 있다. 이 목적을 위해 개발 된 장치 고유 이며 개별 또는 동시 전기 및 기계적 자극, 신중 하 게 특징 및 확인을 수 있습니다. 또한, 비록 방법론은이 자극 및 특정 세포 인구에 대 한 최적화 되었습니다, 그것은 쉽게 적용할 수 있습니다 다른 장치 및 셀 라인에. 여기 결과 전기 자극 후 셀 인구의 증가 심장 헌신의 증거를 제공합니다. Electromechanically 자극된을 세포 증가 표현의 초기, 구조, 및 칼슘 조절 유전자를 포함 하 여 주요 심장 마커를 표시 합니다. 이 셀 컨디셔닝 추가 재생 세포 치료, 질병 모델링 및 높은 처리량 마약 검사에 대 한 유용할 수 있었다.

서론

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심장 기능 전기 자극 및 기계적 수축의 결합을 기반으로 합니다. 간단히, cardiomyocyte 세포 접합 및 폐 시스템을 통해 체계적으로 거의 동기 수축이 심장의 펌프 혈액 생산 전기 신호 전파를 허용 합니다. 심장 세포, 따라서, 유전자 표현과 휴대 기능을 조절 하는 전기 및 기계적 힘을 받 다. 따라서, 많은 그룹 심장 개발, 기능, 및 성숙에 기계적, 전기적 자극의 역할을 이해 하는 심장 생리 적 환경을 모방 문화 플랫폼을 개발 하려고 했습니다. 생체 외에서 전기 및 기계적 stimulations 개별적으로 적용 된 광범위 하 게 심장 조직 공학 기능 속성 강화, 세포 성숙, 증가 또는 셀 커플링 및 칼슘1 처리 개선 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. 자극 및 프로토콜을 개발 하는 도전 및 필수 최적화22때문에 그럼에도 불구 하 고, 동기 전자 컨디셔닝 unexploited 남아.

예비 작업 해결 전기 자극 및 미디어 관류;의 조합으로 전기 자극 그러나, 흐름 심 실 충전 물23,,2425의 전형적인 스트레인 기반 변형을 포함 되지 않습니다. 나중에, 더 많은 생리 적 접근와 함께 전기 자극 물리적 변형 또는 isovolumetric 수축26,,2728,29,30 모방 하는 스트레칭 ,31. Feng 외. 2005, cardiomyocyte 크기와 수축 속성26향상 된 보고에 전기 자극의 첫 번째 데모 설명. 왕 외. 청소용 5-azacytidine와 중간 엽 줄기 세포와 동시 전기 및 기계적 컨디셔닝, recellularization, 세포 생존 능력, 심장 차별화 및 조직27개장 개선 적용. 그의 간행물부터 더 많은 그룹 셀 monolayers의 전기 자극에 보고 또는 조직 (예를 들어, 검은28, Vunjak Novakovic29,31, 그리고 우리의 그룹30)와 설계는 첫 번째 조건된 셀 테스트 vivo에서30. 간단히, 모건 테스트 전기 및 기계적 자극의 몇 가지 조합을 블랙 보고 stimulations 사이 타이밍 지연된 결합 된 전기 자극 나왔고 좋은 결과28때문에 결정적 이었다. 다음, Godier Furnémont 및 공동 작업자 신생아 쥐 심장 세포에서 설계 된 심장 근육 구조에 대 한 전기 자극 프로토콜을 최적화 하 고 달성, 처음으로, 긍정적인 힘-주파수 관계29. 그 후, 우리의 그룹 보고 electromechanically preconditioned 세포 증가 주요 심장 마커에 생체 외에서 의 표현 및 광범위 한 도움이 효과 vivo에서와 같은 심장 기능을 향상 또는 경색에 배 밀도 증가 국경 지역30. 가장 최근 게시 심장 조직에서 줄기 세포 유래 cardiomyocytes는 성숙 수준 가까이 인간의 성인 심장 구조와 기능31를 도달 하는 전기 기계 컨디셔닝 대상이 시연 했다. 또한, 다른 3 차원 자극 플랫폼 electroactive 건설 기계 전기, 기계, 제공 하는 구성 및 지형 신호에 있는 셀에 연결 된32. 또한, 기계적 변형 (셀 단층 스트레칭 및 압축) 정상적인 생리 적인 조건 뿐만 아니라 극한 상황33를 흉내 낸 stretchable 전극으로 유도 또한 수 있다.

따라서, 근거는 생체 외에서 전기 자극 생리 적 조건에 따라 셀의 cardiomyogenic 잠재력을 향상 시킬 수 있는. 실제로,이 자극 더 임상 시나리오에서 심근으로 세포 치료의 통합 혜택 하거나 마약 검사 응용 프로그램에 대 한 조직 성숙 증가 수 있습니다.

또한, 우리는 고립 되 고 심장의 인간 지방 조직 유래 조상 세포의 인구 특징 원점 (심장 ATDPCs)34. 이 세포는 epicardial 지방에 위치 해 있습니다. 이러한 세포 심근 경색의 치료에 histopathological 및 기능적 효능을 표시 하 고 또한 심장 및 내 피 분화 가능성 유지. 30 , 35. 우리는 이러한 혜택은 생물 자극 후 증가 시킬 것입니다 가설.

따라서, 우리는 장치 및 관심의 세포 인구에 대 한 자극 정권 개발 하 고 효과 조사. 이 전기 프로토콜 살 균 방식으로 스트레칭 현재 셀을 유도 하는 새로운 전략 이며 noninvasively 이전 간행물36, 함께 전기 분야 자극에 비해. 여기 보고 기술 장치 및 셀의 전기, 기계, 및 전기 자극을 위해 사용 되는 방법을 자세히 설명 합니다.

이 장치는 독립적으로 또는 동시에 전기 및 기계적 자극을 제공할 수 있습니다. 자극은 presterilized 셀 지원, 전극 표준 문화 플레이트, 그리고 기계 및 전기 힘 (그림 1)을 유도 하는 플랫폼 안에 포함 된 비 침범 성 및 무 균 소설 방식으로 수행 됩니다.

6 문화 플레이트와 레이저-컷 poly(methyl methacrylate) 및 인쇄 회로 기판의 샌드위치 구조 이루어져 플랫폼까지 저장할 수 있습니다. monophasic 프로그래밍 가능 컴퓨터 제어 전기 자극 기, 전극, 및 6 10 m m x 10 m m x 5 m m 니켈 도금된 네오디뮴 고정 자석 배치의 강력한 연결에 대 한 인쇄 회로 기판의 조합에 의존 하는 플랫폼 프로토타입 근처 문화 접시의 한쪽. 6 운전 자석 (같은 모델) 문화 판의 다른 쪽 앞 및 선형 전동기와 이동 알루미늄 바가 있다. 모터는 모터 컨트롤러, RS-232 포트를 통해 운영 하는 상용 소프트웨어에 의해 구동 됩니다 ( 테이블의 자료를 참조). 사용자 인터페이스 및 프로그래밍 가능한 자극을 통해 그것은 전기 강도, 펄스 지속 시간 및 주파수, 기계적 자극, 듀티 사이클, 펄스, 펄스 진폭 (자석 여행), 수의 주파수를 프로그래밍할 수 그리고 사면입니다.

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그림 1 : 전기 자극. (A) PDMS 구성 세포 조절에 사용 합니다. (B) 전극 등 자석 PDMS 구조물의 도면. 전기 난방을 수행 하는 데 사용 하는 인쇄 회로 기판 (플랫폼)의 (C) 세부 사항. 이 패널은 Llucià-Valldeperas에서 수정 된 외30. 전기 자극 플랫폼 및 사용자 인터페이스 (컴퓨터)의 (D) 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

자극 및 전기 기계 컨디셔닝 위한 방법 두 국제 특허 WO 2013185818 a 137 , WO 2017125159 a 138완벽 하 게 설명 합니다.

구문에 셀, 전극, 및 자석 구조 지원을 제공 하도록 설계 되었습니다 생체 실리콘 기술 이전10,21. 간단히, 그들은입니다 (PDMS), 성형 하 고 실내 온도에, 생리 적 수준 1.3 MPa의 영의 계수와 함께 치료의 구성 됩니다. 구문이 포함 셀 문화 풀 유연한 영역 (10 x 10 m m x 2 m m)에, 전극, 잡아 두 내부 가로 슬롯 및 2 포함 6 m m x 2 m m x 4 m m 니켈 도금된 네오디뮴 자석. 전극은 0.2는 2 m m x 3 m m x 12 m m 소계 (PTFE)를 엉키지 플래티넘 m m 와이어 전극, 약 23 회전 (21 cm) 바 코어와 유도 위한 전기 분야 생성 유연한 영역의 반대편에 내장 전기 자극입니다. 기계 기지개는 지원에 포함 된 자석 및 문화 접시 옆과 이동 알루미늄 팔에 외부 자석 사이의 자기 매력을 통해 이루어집니다. 이 방법에서는, 셀 지원 살 균 방 벽을 위반 하지 않고도 확장할 수 있다. 이 이렇게 셀 단층에 적합 하지만 3 차원 구조에 맞게 수 있습니다.

또한, 일반 패턴 수 있는 세포는 시드, 인쇄 통치 회절 격자 (1250 홈/mm)를 사용 하 여 있습니다. 명시 및 형광 현미경에서 PDMS 구조물에 배양 세포의 직접적인 시각화의 투명성과 0.5 m m 두께 때문에 가능 하다. 현재 경우 PDMS 문화 수영장에 수직 표면 패턴, 정렬 셀에서 전기 분야 기온 변화도 최소화 하는 전기 분야에 수직 셀 기지개 힘에 수직 합니다.

그림 1 구성 및 자극에 대 한 사용 되는 장치에 대 한 자세한 설명이 나와 있습니다. PDMS 구성 하 고 특성 (그림 1A, B)를 기지개 하는 셀에 대 한 최적화. 자극 기 개발 이며 PDMS 구조물에 연결 된 셀에 원하는 전기 및 기계적 자극의 효과적인 응용 프로그램에 대 한 검증. 이 프로세스는 소프트웨어 인터페이스 (그림 1 c, D)를 통해 좋은 연결 및 사용자 운용성 보장을 포함 됩니다.

이 주문 품 장치를 사용 하 여 세포 자극에 대 한 절차는 프로토콜 섹션에 설명 되어 있습니다.

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프로토콜

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이 연구는 환자 샘플에서 인간의 심장 ATDPCs를 사용합니다. 지역 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다 그들의 사용 그리고 모든 환자 동의 했다. 연구 프로토콜 헬싱키의 선언에 명시 된 원칙을 준수 합니다.

1입니다. 준비

  1. 압력솥 2 핀셋, 전기 자극에 대 한 12 플래티넘 PTFE 전극 및 일부 종이 수건 20 분 동안 121 ° C에서.
  2. 소독 12 PDMS 주문 품 구조 (그림 1A).
    1. 15 분 동안 실내 온도에 자석 동요와 살 균, 소 주 물 5 mL와 함께 각 구조를 씻어.
    2. 마그네틱 동요와 70% 에탄올 5 mL 1 x 5 분 동안 실내 온도에 씻는 다.
    3. 알코올 잔류물을 제거 하, 세척 당 10 분 동안 실내 온도에 자석 동요와 살 균, 소 주 물 5 mL와 5 배를 씻어.
    4. 구문을 흐름 캐비닛 하룻밤 안에 메 마른 종이 수건에 건조.
    5. 사용까지 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 그들을 저장 합니다.

2. 셀 시드 (주-1)

  1. 셀 시드, 전에 살 균 판 청소 PDMS 구조를 전송 하 고 완전 한 살 균을 위해 5 분 동안 자외선에 노출.
  2. 35 mm 셀 문화 접시, 또는 즉시 셀 시드에 6 잘 플레이트 각 구조를 전송 합니다.
  3. 심장 ATDPCs의 confluent T75 플라스 크 trypsinize
    1. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 5 mL와 T75 플라스 크를 씻으십시오.
    2. 0.05% 트립 신-EDTA의 1 mL을 추가 하 고 셀을 분리 하려면 5 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    3. 트립 신-EDTA 비활성화를 완전 한 매체의 5 mL를 추가 합니다.
    4. 수집 모든 15 mL 튜브 세척 플라스 크에 세포 나머지 셀을 수집 하는 PBS의 5 mL로 2 배.
    5. 22 ° C에서 5 분 동안 230 x g 에서 centrifuge, 상쾌한, 제거 하 고 resuspend hemocytometer 상공 회의소와 함께 그들을 계산 하는 완전 한 매체의 2 mL에 셀.
  4. 씨앗 심장 ATDPCs (2.5 x 105 셀/mL)의 200 µ L 12 PDMS 구조 (그림 1A, B)을가지고 시드 표면 보호의 ~ 80%의 셀 풀으로 세포에 의해, 다음날 고 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.
    참고: 2-4 h 후 셀을 연결 한다. 셀 inoculum 셀 크기와 성장 준비가 되어 있습니다. 작은 셀에 대 한 시드 밀도 증가 한다.
  5. 부드럽게 접시 당 prewarmed 완전 한 매체 (α-MEM 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1 %L-글루타민, 및 1% 페니실린-스 보충)의 2 개 mL를 추가 합니다.
  6. 밤새 문화 조건 (보통 37 ° C, 5% CO2)에서 구조를 품 어.

3. 전기 기계 자극 설치 프로그램 (0 일)

  1. 절차를 시작 하기 전에 전기 자극에 대 한 6 개의 구조와 6 nonstimulated 컨트롤을 가져가 라. 자극 당 미만 6 접시, 적절 한 전기 분야 자극 되도록 같은 중간 볼륨으로 빈 구조를 사용 합니다.
  2. 70% 에탄올과 자극 단위를 청소 하 고 장의 흐름에 배치.
  3. 살 균 전극과 흐름 캐비닛 내부 핀셋가지고.
  4. 쉽게 전극 구조를 조작 하는 문화 접시에서 미디어의 90%를 제거 합니다. 첫째, 고정 및 모바일 자석 사이의 자기 매력 (자석으로 문화 배지 내의 PDMS 변위)를 보장 하기 위해 올바른 위치에 PDMS 구조를 놓습니다. 다음, 전극 커넥터 및 PDMS 구문에서의 지정 된 공간에 PTFE 부분 백 금 철사를 연결 합니다.
  5. 각 구문에 신선한 prewarmed 완전 한 매체의 2.5 mL를 추가 합니다.
    참고: 절차를 통해 불 임을 유지 하 고 한 번에 하나의 구문에서 작동. 사용까지 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 구성의 나머지를 유지.
  6. 일단 모든 PDMS 구조 배치 플랫폼에 전기적으로 연결, 37 ° C, 5% CO2배양 기에 플랫폼 다시 가져.
  7. 전기 및 기계 소스를 연결 합니다.
  8. 자극 프로그램을 구성 합니다. 전기 및 기계적 자극 정권 전기 자극, 기계적 자극을 제어 하는 응용 프로그램의 사용자 인터페이스를 통해 지정 합니다. 오차를 다음과 같이 설정 합니다.
    1. 전기 자극 기에 스위치. 디스플레이에 표시 주요 메뉴에 대 한 기다립니다.
      1. 그런 다음 선택 옵션 2: 편집 시퀀스 + Enter.
      2. 메뉴 순서를 다음과 같이 편집 합니다.
        1. 모드 탭을 사용 하 여 전압 또는 전류를 선택 하. 현재 + 를 클릭 하 여 선택 하 고 Enter키를 누릅니다.
        2. 진폭 탭에 대 한과 + 1 (mA)을 선택 하 고 Enter키를 누릅니다.
        3. 기간 (T), 1000 (ms) + 를 선택 하 고 Enter키를 누릅니다.
        4. 2 (ms) + 와 펄스 지속 시간 (Tw)를 설정 하 고 Enter키를 누릅니다.
        5. 트리거 모드 탭에 대 한 외부 소프트웨어에 의해 선택 하 고 Enter키를 누릅니다.
        6. 주 메뉴에서 다시 선택 옵션 4: 시퀀스를 생성 Enter키를 누릅니다.
          참고: 직렬 포트를 통해 기계적 자극 응용 프로그램에서 트리거 명령의 받을 때까지 전기 자극 기는 대기에 달려있다.
    2. 제어판 응용 프로그램 (그림 2C)의 기계적 자극 섹션에서 다음 단계를 수행 합니다.
      1. 펄스 기간 텍스트 컨트롤에 1000 (ms)를 작성 합니다.
      2. 기계적인 펄스 기간을 설정 하려면 ON 시간 (Tw) 텍스트 컨트롤에 500 (ms)를 작성 합니다.
      3. 쓰기 2000 (AU) 여행 텍스트 컨트롤에 10% 구조 신장 제공 하. 이 선형 제어 모터에는 단계 수입니다.
        참고: 여기에 적용 하는 자극 프로토콜 1 Hz에서 7 일에 대 한 스트레칭 10 %50 mV/cm의 교류 2 ms monophasic 구형 파 펄스 이루어져 있다. 기계적인 펄스의 상승 및 하강 시간 대략 난로 압력 펄스의 모양을 모방 100 ms에서 설정 됩니다. 또한, 반복 모드 연속 을 설정 되 고 펄스의 수를 표시 하는 카운터입니다.
  9. 1 주일 (월요일, 목요일 오후) x 2 미디어를 변경 합니다. 먼저, 제거 오래 된 미디어; 다음, 셀 풀에 절대 직접 PDMS 지원의 측면에서 따뜻한 미디어를 추가 합니다.
    참고: 만약 셀 높은 성장률, 미디어 변경된 3 (예: 월요일, 수요일, 그리고 금요일) 주 배 이어야 한다. 그것은 분리 하 고 모든 케이블을 다시 연결 하는 데 필요한 이지만 그들의 장소에서 문화 접시와 전극을 제거할 필요가 없습니다.
  10. 실험을 수행한 후 샘플을 수집 합니다.

4. 샘플 컬렉션 실험 (7 일)의 끝에

  1. RNA 분석에 대 한
    1. 구문이 세척 2 x 1 x PBS 실 온에서 5 분의 3 mL와 함께.
    2. (전체 구조를 커버 하기에 충분) 각 접시에 0.05% 트립 신-EDTA의 3 개 mL를 추가 37 ° c.에서 5 분을 기다립니다
    3. 셀을 분리 하는 트립 신-EDTA 비활성화를 완전 한 중간의 2 개 mL를 추가 합니다.
    4. 수집 15 mL에 모든 셀 튜브와 구조를 씻어 3 mL의 나머지 셀을 수집 하는 PBS로 2 배.
    5. 22 ° c.에 5 분 동안 230 x g 에서 원심 분리기
    6. 제거는 상쾌한 고 1 mL의 PBS에 펠 릿을 resuspend.
    7. 1.5 mL 튜브를 5 분 동안 230 x g 에서 원심 분리기 셀 솔루션을 전송 합니다.
    8. 제거는 상쾌한 고 RNA 격리 추가 대 한 세포 시 약의 700 µ L에서-80 ° C에서 펠 릿을 저장 합니다.
    9. 제조업체의 지침에 따라 상업 키트를 사용 하 여 RNA를 분리.
    10. 리버스-키트 제조 업체의 프로토콜에 따라 무작위 hexamers를 사용 하 여 격리 된 RNA 녹음.
    11. 작은 RNA 농도 대 한 preamplify 하 고 후속 실시간 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR)를 수행 하기 전에 다음, RNase 무료 물과 1: 5을 희석. 실시간 RT-PCR를 위한 표준 프로토콜을 계속 하 고 주요 심장 마커 검사.
      참고: 심장 녹음 방송 요인 등 다양 한 범주에서 초기 및 런타임에 마커를 구성 하는 전형적인 심장 마커 (myocyte 관련 증강 인자 2A [MEF2A], 가타-바인딩 단백질 4 [가타-4]) 및 구조 (심장 분 나 [cTnI], 심장 분 T [cTnT], α-actinin) 및 칼슘 규정 (Connexin43 [Cx43], sarco-/ 바인딩과 그물 Ca2 +-ATPase [SERCA2])30. 단백질 격리는 또한 필요한 경우에 수행할 수 있습니다. 동시 RNA 및 단백질 격리 같은 샘플, 샘플 수량이 적을 경우 상용 시 약 및 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
  2. Immunostainings에 대 한
    참고: 이 PDMS 구조물의 셀 풀에 연결 된 셀에 직접 수행 됩니다. 따라서, 좋습니다, 배치 때마다, 1 cm x 1 cm 셀 풀 플레이트를 제외 하 고 위에 파라핀 영화의 뚜껑, 부 화 솔루션의 증발을 최소화 하기 위해.
    1. 구조를 씻어 실 온에서 5 분에 대 한 PBS의 3 mL 2 x.
    2. 실 온에서 15 분 동안 10% 포 르 말린의 2 mL와 함께 구조에 연결 된 셀을 수정 합니다.
    3. 3 세포를 씻어 실 온에서 5 분에 대 한 PBS의 3 mL x. 장기 보관을 위해 두고 샘플 PBS에 4 ° c.에 0.1% 나트륨 아 지 드
    4. 3 mL PBS + 0.5% 세제와 함께 세포를 permeabilize (3 배, 각 시간 실 온에서 5-10 분).
    5. 특이 항 체 바인딩을 차단 PBS + 10% 말 혈 청 + 0.2% 세제 + 1% 소 혈 청 알 부 민 1 시간 실 온에서 100 µ L로 세포를 품 어.
    6. 100 µ L의 PBS + 10% 말 혈 청 + 0.2% 세제 + 1% 소 혈 청 알 부 민, 1 시간에 대 한 실 온에서 1 차적인 항 체와 세포를 품 어. Cx43에 대 한 예를 들어 1 차 항 체 (1: 100), sarcomeric α-actinin (1: 100), 가타-4 (1:50), MEF2 (1:25), 그리고 SERCA2 (1:50).
    7. 3 x 5 분 동안 실 온에서 PBS의 3 mL 씻으십시오.
    8. 100 µ L의 PBS + 1 시간을 위해 어둠 속에서 실 온에서 이차 항 체와 세포를 품 어.
      참고: 2 차 항 체와 다른 fluorophores 활용 그리고 counterstaining 에이전트 사용 되었다.
    9. 그들을 씻어 5 분 동안 어둠 속에서 실 온에서 3 mL의 PBS로 3 배.
    10. 15 분 동안 어둠 속에서 실 온에서 PBS에 핵 (0.1 µ g/mL) 얼룩의 100 µ L로 세포를 품 어.
    11. 그들을 씻어 5 분 동안 어둠 속에서 실 온에서 3 mL의 PBS로 3 배.
    12. 3 mL PBS의 4 ° C에서 0.1% 나트륨 아 지 드와 함께 인수까지 샘플을 저장 합니다.
      참고: 현미경 인수 구문 두께 약 0.5 m m 때문에 거꾸로 형광 고 confocal 현미경 긴 작업 거리 목표에 가능 하다.

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결과

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그림 2 는 세포 자극에 대 한 다음 일반적인 스키마를 나타냅니다. 간단히, 세포는 PDMS 구조물에 시드 했다 일주일에 두 번 수행 하는 미디어 변경 전기 자극에 복종 하 고. Nonstimulated 세포는 전기 시설에 대 한 제어로 사용 되었다. 또한, 우리는 실험을 추가 컨트롤을 추가 및 피하 ATDPCs 심장 ATDPCs에 대 한 제어로 사용 되었다. 피하 ATDPCs 심장 ATDPCs33에 관해서는 동일한 격리와 문화 절차에 따라 피하 지방 조직에서 가져옵니다. PDMS 구조물에 연결 된 셀 전과 자극 후 일반적인 방 추상 표현 형을 입증. 또한, 셀이 경우 수직 패턴에 따라 패턴화 된 표면에 따라 정렬.

전기 및 기계 stimulations 먼저 개별적으로...

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토론

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전기 자극 적대적인 심장 환경에 대 한 셀을 준비 하 고 그들의 심장 헌신을 강화에 대 한 안전한 대안을 것 같다. 여기, 심장 조상 세포 주 심장 감 적의 식을 증가 하 고 되었다 설명 프로토콜 infarcted murine 심근30에 그들의 다음 주입에 도움이 될 보고. 일반적으로, electromechanically 자극된 심장 ATDPCs 유전자와 관련 된 초기, 구조, 및 결코 달성 된 이전 전기 또는 기계적 stimulations와 개별적으로 칼슘 규정의 표현을 증가. 사실, electromechanically 자극된 심장 ATDPCs 더 완전 한 단면도 표시 하 고 이전 보고 보다 더 심장 계보를 위해 최선을 다하고 있을 것 같았다.

심장 유전자 발현은 특히 피하 ATDPCs에 비해 심장 ATDPCs의 주목할 만한 확대 후 전기 자극 후 두 셀 형식에 변조 했다. 이 결과 세포 격리, 즉, epicardial 또는 피하 지방...

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공개 사항

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저자 없다 공개, 제외 하 고는 자극 장치 및 프로토콜 (WO 2013185818 a 1, WO 2017125159 a 1) 특허 이전 했다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 ICREC 연구 프로그램 (IGTP, 바 달로 나)는 전자 및 생물 의학 계측 (오순절, 바르셀로나), 특히 교수 J. Rosell-페 러의 회원을 감사 드립니다. 또한, 저자 줄기 세포 변환 의학 저널 및 이전 게시 된 수치 (Llucià-Valldeperas, 그 외 여러분 의 적응을 허용 AlphaMed 프레스 인정 30).이 프로토 타입의 개발 및 프로토콜의 디자인 정부의 데 모두 y 많은 (SAF 2008-05144), 정부의 드 Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), 유럽 위원회에 의해 지원 되었다 7 프레임 워크 프로그램 ( RECATABI, NMP3-SL-2009-229239) Fundació 라 Marató 드 TV3 (080330, 201516, 201502)와 Fundación 파라 라 Innovación y 라 Prospectiva en 건배 엉 에스파냐 (FIPSE; 06-00001396-15).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Stimulator
nickel 도금 네오디뮴 자석SupermagneteQ-10-10-05-N
니켈 도금 네오디뮴 자석SupermagneteQ-06-04-02-HN
폴리디메틸실록산(PDMS) SYLGAR 184 실리콘 엘라스토머 키트Dow CorningCorp 184
ruled diffraction grating(1250 grooves/mm)Newport05RG150-1250-2
모터 컨트롤러FaulhaberMCLM-3006-S
LabviewNational Instruments
Cell culture
phosphate-buffered saline (PBS)Gibco70013-065
0.05% trypsin-EDTAGibco25300-120
35 mm 세포 배양 접시BD Falcon45353001
소 태아 혈청 (FBS)Gibco10270-106
L-글루타민 200 mM, 100xGibco25030-024
Penicilina/Streptomicine, 10.000 U/mLGibco15140-122
최소 필수 매체 독수리(alfa-MEM)SigmaM4526-24x500ML
<스트롱>단백질 & RNA 분석
프로테아제 억제제 칵테일SigmaP8340
QIAzol 용해 시약Qiagen79306
AllPrep RNA/단백질 키트Qiagen50980404
Rneasy 미니 키트Qiagen74104
iTaq 범용 프로브 원스텝 키트Bio-Rad Laboratories172-5140
랜덤 헥사머Qiagen79236
TaqMan PreAmp MasterMix 2xApplied Biosystems4391128
TaqMan Universal PCR MasterMixApplied Biosystems4324018
Immunostaining
10% 포르말린SigmaHT-501128-4L
호스 세럼시그마H1138
트리톤 X-100시그마X100-500ML
소 세럼 알부미나 (BSA)시그마A7906-100G
파라필름시그마P6543
4',6-디아미디노-2-페닐린돌 (DAPI)시그마D9542
팔로이딘 알렉사 568인비트로젠A12380
아지드화나트륨SigmaS8032-100g
Hoechst 33342Sigma14533
Connexin-43 토끼 1차 항체SigmaC6219 lot#061M4823
sarcomeric α-actinin 마우스 1차 항체SigmaA7811 lot#080M4864
GATA-4 염소 1차 항체R& DAF2606 VAZ0515101
MEF2 토끼 1차 항체Santa Cruzsc-313 lot#E0611
SERCA2 염소 1차 항체Santa Cruzsc-8095 lot#D2709
Cy3 2차 항체Jackson ImmunoResearch711-165-152
Cy3 2차 항체Jackson ImmunoResearch715-165-151
Cy3 2차 항체 항체Jackson ImmunoResearch712-165-150
Cy2 2차 항체Jackson ImmunoResearch715-225-150
Cy2 2차 항체Jackson ImmunoResearch711-225-152
Cy2 2차 항체Jackson ImmunoResearch705-225-147

참고문헌

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