여기, 형광 펩 티 드 대신 네이티브 단백질 분해성 기판으로 사용 되는 수정 된 zymographic 기법에 대 한 자세한 프로토콜 선물이. 전기 이동 법 형광 펩 티 드 zymograms에 생물 학적 샘플의 이전 zymographic 기법 보다는 프로 테아의 광범위의 검색 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 방법의 목적은 복잡 한 생물 학적 샘플의 분해 활동을 측정 하는 것입니다. 샘플 분자량 분해성 기판 임베디드 해결 젤 통해 전기 이동 법을 사용 하 여 구분 됩니다. 이 방법은 다릅니다 전통적인 젤 zymography에서 담금질된 fluorogenic 펩 티 드 covalently 전체 길이 단백질, 젤라틴 또는 카 세 인 등 대신 해결 젤에 통합 됩니다. Fluorogenic 펩 티 드의 사용에는 추가 착 단계 없이 분해 활동의 직접 감지 수 있습니다. 생물 학적 샘플 내에서 효소 쪼개 침묵과 fluorogenic 펩 티 드, 형광에 있는 증가 결과로. 젤에 형광 신호 다음 표준 형광 젤 스캐너로 몇 군데 이며 densitometry를 사용 하 여 계량 합니다. 분해성 기판으로 펩 티 드를 사용 하 여 크게 zymographic 기술로 감지 가능한 프로 테아 제를 확장합니다.
서론
젤 zymography은 생물 학적 샘플, 체액 세포 배양1,2,3등 분해 활동을 측정 하는 생물학 기술입니다. 샘플 그들의 분자 무게 분해성 기판 임베디드 polyacrylamide 젤을 통해 전기 이동 법으로 구분 됩니다. 젤라틴, 카 세 인, 콜라겐과 엘라 스 틴, 매트릭스 metalloproteinases (MMPs)-1,-2,-3,-7,-8,-9, 및-11, cathepsins1,2 의 다양 한 뿐만 아니라의 활동을 측정 하기 위해 사용 된 일반적인 분해성 기판 포함 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. 후 전기 이동 법, 효소 renatured와 젤 내 단백질을 저하 될 수. 전통적인 젤 zymograph....
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프로토콜
1입니다. 해결 젤 층의 준비
- 10 %polyacrylamide 젤 솔루션 표 1에 의하여 해결을 준비 합니다. 즉시 그들의 추가 시작 중 합 반응으로 젤을 따르기 이전 Tetramethylethylenediamine (TEMED)와 암모늄 Persulfate (AP)를 추가 합니다.
- 10% 해결 젤 솔루션 빈 1.5 m m 미니 젤 카세트 절반 방법 (5 mL)을 작성.
- 레벨 젤 생산 및 거품 방지 polyacrylamide 젤의 맨 소 프로 파 놀 (~ 500 µ L)의 얇은 레이어를 추가 합니다. 남은 polyacrylamide 솔루션을 사용 하 여 중 합 반응의 진행 상황을 추적할. 때 튜브에 polyacrylamide가 완전히 경화, 반응은 완료 (40 분)입니다.
2. Azido-PEG3-maleimide 링커 분자의 준비
- 첫 번째 해결 젤 레이어 polymerizing 동안-20 ° C 저장에서 azido-PEG3-maleimide 키트를 검색 하 고 실내 온도 도달 하는 구성 요소를 허용. 각 키트에는 두 개의 구성 요소가 있습니다. 유리병 1 maleimide-NHS 에스테 르를, 회색 단색 미색에 포함 되어 있습니....
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결과
여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 두 개의 형광 효소 분해 펩 티 드 polyacrylamide 젤에 통합 했다: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (텍스트와 그림을 통해 QGIW로 약식)와 GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (텍스트와 그림을 통해 LACW로 약식). ↓ 분열의 위치를 나타냅니다. QGIW는 콜라겐은-난 파생 시퀀스 세포 collagenases14을 탐지 하도록 설계 되었습니다. LACW는 MMP 14 MMP 1115의 검출에 대 한 최적화 된 시퀀스입니다. 펩 티 드 dabcyl (끄는) 및 fluorescein (fluorophore) N-hydroxysuccinimide (NHS)-에스테 르를 사용 하 여 표시 됩니다 아민 화학11
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토론
현재 zymographic 기법으로 polyacrylamide 젤 베이스의 검출에 대 한 기본 기판의 설립에 의존합니다. 이러한 기술을 광범위 하 게 사용을 얻고 있다, 하는 동안 그들은 여전히 프로 테아 제 감지할 수의 숫자에 제한 됩니다. 여기, 프로토콜은 형광, 효소 분해 펩 티 드에 polyacrylamide 젤 해결에 통합 하는 설명 했다. 사용 하 여 연결 공유는 azido-PEG3-maleimide 링커 분자 수 있습니다 분리 및 다양 한 프로 테아의 검출 보다 현재 네이티브 기판으로 달성. 형광 펩 티 드의 높게 가변 자연 연구원 그들의 프로 테아 제 관심의 대상 기판 설계 하는 능력을 준다. 수많은 펩 티 드 기질 다양 한 프로 테아 제 펩 티 드 라이브러리를 사용 하 여에 대 한 확인 되었습니다 그리고 상용 소스 사용자 지정 펩 티 드 제조의 성장 수가 있다. 적절 한 형광 냉각 및 표준 버퍼에 용 해는 새로운 fluorogenic 펩 티 드를 개발 하는 것이 어려울 수 있습니다. 따라서 상업적으로에서 펩 티 .......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
자금에 오하이오 주립 대학 대학의 공학, 생명 공학 부, 그리고 종합 암 센터-아서 G. 제임스 암 병원과 리처드 J. Solove 연구소에 의해 제공.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5mm 빈 젤 카세트 | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5mm, 10웰 빈 젤 카세트 빗 | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x 인산염 완충 식염수 | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS 솔루션 | Ambion | AM9820 | |
| 3x 자이모그래피 샘플 버퍼 | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) 아크릴아미드/비스 (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| 6웰 조직 배양 플레이트 | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 원심 필터 장치(10kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| 과황산 암무늄 | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry 도구 | AZ107 | |
| 염화칼슘 | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| 디메틸 | Fisher Scientific | BP231 | |
| 이소프로판올 | Fisher Scientific | A416P | |
| 마이크로 BCA 단백질 분석 키트 | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N N' N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac 기본 전원 공급 장치 | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus 단백질 이중 색상 표준 | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide 피하 주사 바늘 | Fisher Scientific | 14-826 | |
| 둥근 바닥 플라스크 (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| 격막 고무 마개 | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| 멸균 슬립 팁 주사기(1mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| 염화아연 | Sigma-Aldrich |
참고문헌
- Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
- Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods ....
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재인쇄 및 허가
