레이저에서 고품질 RNA 격리 스테인리스 프로토콜 캡처 Microdissected Purkinje 세포 인간의 사후 소 뇌에

요약

이 프로토콜 얼룩 없는 접근을 사용 하 여 시각화 하 고 레이저 캡처 서 통해 인간의 사후 뇌에서 신선한-냉동 조직에서 Purkinje 세포를 분리. 이 프로토콜의 목적은 RNA 시퀀싱에 대 한 높은-품질 RNA의 충분 한 양을 생성 하는 것입니다.

초록

레이저 캡처 기정 (LCM) cytologically 또는 phenotypically 관련 셀 또는 이기종 조직에서 영역에 대 한 수 있는 유리한 도구입니다. 캡처된 사용할 수 있습니다 다양 한 단백질, 분자 방법에에서 DNA 또는 RNA 격리. 그러나, 인간의 사후 뇌 조직에서 RNA의 보존은 특히 도전적 이다. LCM에 대 한 표준 시각화 기술을 더 또는 추가 수 immunohistochemical 얼룩 절차 RNA 저하 됩니다. 따라서, 우리는 사후 뇌 조직에서 RNA 무결성을 보존 하기의 용도와 LCM에 시각화를 위한 스테인리스 프로토콜 설계 되었습니다. 소 뇌의 Purkinje 세포 크기 및 특성 위치 스테인리스 시각화에 대 한 좋은 후보입니다. 소 뇌 피 질의 세포 밀도, 그들 고배율 현미경에서 식별 하는 좋은 상을 만드는 다른 독특한 레이어 있다. Purkinje 세포는 큰 신경 작은 신경의 밀도가 셀룰러 네트워크는과 립 세포 레이어 및 셀 시체에 스파스는 분자 층 사이 위치. 이 건축 때문에 스테인레스 시각화의 사용은 가능 합니다. 이 표현 형을 모방 하는 다른 기관 또는 셀 시스템도 적합 한 것입니다. 에탄올과 신선한 냉동 조직 수정 하 고 높은 확대 가벼운 현미경 검사 법에서 향상 된 형태학 시각화를 위한 크 실 렌과 지질 제거 스테인리스 프로토콜 설계 되었습니다. 이 프로토콜 다른 고정 방법을 고려 하지 않습니다 하 고 자외선 (UV)를 사용 하 여 캡처한 신선한 냉동 조직 샘플에 대 한 특별히 설계 된-LCM 시스템. 여기, 선물이 단면화 및 후속 RNA 시퀀싱에 대 한 RNA 품질을 유지 하면서 UV LCM에 의해 분리 하는 Purkinje 세포에서 신선한 냉동된 사후 인간 소 뇌 조직 및 RNA의 정화를 해결에 대 한 전체 프로토콜. 우리의 손에이 프로토콜 착 색 시 약을 위한 필요 없이 세포 시각화의 뛰어난 수준을 생산 하 고 transcriptional 프로 파일링 실험에 대 한 필요에 따라 높은 RNA 무결성 번호 (≥8)와 RNA를 생성 합니다.

서론

레이저 캡처 기정 (LCM)는 후속 분자로 제어 평가 대 한 병 적 관련 세포의 분리 수 있습니다 귀중 한 연구 도구입니다. 이러한 다른 유형의 조직 표본 및 병리학 및 임상 데이터와 상관 관계에 분자 분석의 사용 생물 학적 연구¹의 변환의 평가에 필요한 단계입니다. RNA 유전자 표현 데이터를 분석할 때 언된 조직 단면도의 사용이 좋습니다 RNA의 우수한 품질에 대 한 수 뿐 아니라 수량²최대화. 그것은 잘 설립 되었습니다 높은 품질과 수량 RNA의 RNA 시퀀싱³에서 의미 있는 데이터에 대 한 필수적입니다. 그러나, LCM에 대 한 신선한 냉동된 사후 조직에서 RNA를 사용 하 여 때 RNA 강 직은 주요 도전, 죽음에 즉시 발생 하 고 그 범위는 조직의 컬렉션 방법^{4,5와 관련 된 다양 한 요인에 의해 중재} . 또한, RNA 저하 얼룩 기법 인식 더 세부 사항 및 셀 식별 하는 데 필요한 때 악화 됩니다. 전문 기술 되며 & 오신, Nissl 얼룩, 얼룩 면역 형광 및 immunohistochemistry 주변 기질에서 세포를 차별화 하는 데 도움이 하지만....

프로토콜

이 프로토콜에서 사용 하는 모든 인간의 샘플 동의를 얻은 고 컬럼비아 대학과 예일 대학에서 내부 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었습니다.

참고: 이 프로토콜의 전체 처리 지침, 엄격한 RNA를 따라야 한다 그것에 의하여 gloved 손을 항상 사용, 모든 서피스는 RNase decontaminator로 청소는 모든 작동 물질이 RNA/DNA/Nuclease 무료.

1. 시작 LCM 이전 조직의 RNA 무결성 테스트

참고: RNA 품질을 테스트 하는 것은 많은 방법으로 할 수 있습니다. 전체 섹션에서 RNA에 대 한 대표적인 RNA 무결성 번호 (린)을 제공 하는 샘플에 대 한 테스트를 확인 합니다.

1. 신중 하 게 조직 샘플 실험 디자인의 매개 변수 내에 적합 포함을 선택 합니다. cryostat에서 절단, 1.2 단계도 이동 합니다. 그렇지 않으면, 조직을 적절 하 게 처리 하 고 단계 1.11로 이동.
2. 드라이 아이스의 두 개의 컨테이너를 얻을. 크기는 샘플의 수에 따라 달라 집니다.
   1. 드라이 아....

결과

이 프로토콜 UV LCM에 대 한 신선한 냉동된 사후 뇌 조직 준비 하는 단계를 자세히 설명 합니다. 철저 한 사양 및 주석 받는다 cryostat 절단, 정밀도의 고차를 가진 신선한 냉동된 뇌 조직을 절단 하는 것이 어려울 수 있습니다 대로. 고려해 야 할 가장 중요 한 포인트가입니다 신선한 냉동된 조직 매우 추운 이며 상당한은 cryostat의 따뜻한 온도에 적응 하는 시간이 필요 합니다. 이 단계를 급하게 수 없습니다, 그리고 어떻게 중앙이 단계는이 프로토콜의 실패 또는 성공에 그것 overstated 수 없습니다. 조직에는 cryostat 제대로 준비 하지 않습니다, 경우 셀 또는 관심 영역 식별에 모든 후속 시도 매우 어려운, 불가능 한 것입니다.

Cryostat 단면화 및 할당 된 건조 시간, 조직 LCM에 대 한 준비입니다. 현미경 조직 시각화 때 소.......

토론

여기에 제시 된 프로토콜 특히 UV LCM에 대 한 시각화 하는 형태학 상으로 다른 조직에 스테인리스 접근 하도록 수정 됩니다. 이 메서드는 후속 직접 RNA 시퀀싱, 조직 시각화의 향상 된 수준을 유지 하면서 RNA 무결성을 최대화 하기 위해 설계 되었습니다. 가능한, 셀의 순수한 인구를 만드는 캡처, 다른 세포 유형 구별 하는 기능 이해 하는 인간의 조직¹⁵다른 분자 프로 파일에 대 한 필수적입니다. 이 프로토콜의 컨텍스트 내에서 조직 선택은 중요 하 고, 항 원의 사용으로 또는 염료 특정 시 약 활용 되지 및 따라서 이러한 차별화를 요구 하는 연구에 적합 하지 않습니다. 이이 프로토콜의 한계, 결과 조직 시각화 및 RNA 무결성 꽤 우수한 있으며 다른 실험적인 디자인에 관련성을 유지. 다른 많은 프로토콜 대체 얼룩 방법을 구체적으로 대 한 UV-및 IR-LCM 보존 RNA는 의도로 사용 하는 존재. 그러나, 대부분의 다른 메서드와 적어도 하나의 얼룩 또는 항 원 특정 시 약

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	조직용 멤브레인 슬라이드. 유리 슬라이드는 사용하지 않는 것이 좋습니다.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	불투명 캡은 반전된 스코프의 시각화를 향상시키는 데 사용되며,
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	기타 RNase 오염 제거 제품만 적합합니다. 작업하기 전에 모든 표면을 청소하는 데 사용하십시오.
200 프루프 에탄올	Decon Laboratories	2701	대체 에탄올을 사용하는 경우 고품질을 보장하십시오. 조직 고정에 필수적입니다.
크실렌(ACS 인증)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	대체 크실렌을 사용하는 경우 고품질을 보장하십시오. 조직 시각화에 필수적입니다.
UltraPure 증류수	Invitrogen	10977-015	다른 RNA/DNA/뉴클레아제 자유 물도 적합합니다. 에탄올 희석에만 사용됩니다.
슬라이드 수정 슬라이드 항아리	상록	240-5440-G8K	모든 슬라이드 홀더/항아리도 적합합니다. 사용하기 전에 청소해야 합니다. 단면 다음 고정에 사용됩니다.
안티 롤 플레이트, Assy. 70 mm 100 μ m	Leica Biosystems	14041933980	안티롤 플레이트 유형은 저온 유지 장치의 유형과 스테이지의 부착 위치에 따라 결정됩니다. 모든 저온 유지 장치에는 서로 다른 요구 사항이 있습니다.
모든	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC가 수행할 수 있습니다. 수처리 지침을 따르십시오.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes는 모든 공급업체에서 주문할 수 있으며 모든 크기에서 사용할 수 있습니다. Kimwipes는 현미경과 저온 유지 장치를 청소하는 데 사용됩니다.
Tissue-Plus O.C.T. 컴파운드	Fisher Scientific	23-730-571	모든 브랜드의 OCT를 사용할 수 있습니다. OCT에는 어떤 조직도 삽입되지 않으며, '척'에 조직을 부착하는 것은 매우 어렵습니다.
Edge-Rite 로우 프로파일 마이크로톰 블레이드	Thermo Scientific	4280L	블레이드 유형은 저온 유지 장치의 유형에 따라 결정됩니다. 모든 저온 유지 장치에는 서로 다른 요구 사항이 있습니다.
Leica Microsystems 3P  25 + 30MM 저온 유지 장치 척	Fisher Scientific	NC0558768	척 유형은 저온 유지 장치 유형에 따라 결정됩니다. 모든 저온 유지 장치에는 서로 다른 요구 사항이 있습니다. 어느 사이즈라도 적당합니다.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	LCM 후 RNA 추출에 필요합니다. RLT 용해 버퍼는 불투명한 캡에서 포획된 세포를 수집하는 데 필수적입니다.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	시작 조직의 RNA 무결성을 테스트하기 위해 LCM 전에 수행되는 절편 준비의 RNA 추출에 필요합니다.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase는 순수한 RNA 집단을 허용하기 위해 모든 DNA를 제거합니다. Dnase가 신선하게 만들어졌는지 확인하십시오.
2-메르캅토에탄올	Sigma Aldrich	M6250-100ML	사용자 재량에 따라 구매한 볼륨. 세포 용해를 위해 RLT 완충액에 추가하는 데 필요합니다. RNase 활성을 방지합니다.
글로브 사이언티픽  Lot 인증 졸업 마이크로 원심분리기 튜브 (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	RNase 무료, DNase 무료, 인간 DNA 무료, 그리고 Pyrogen 무료 2 mL 튜브라면 무엇이든 가능합니다.