인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

요약

이 프로토콜은 18일 만에 인간 만능 줄기 세포(hPSCs)로부터 간세포 유사 세포를 효율적으로 생성하는 단층, 무혈청 방법을 상세히 기술한다. 이것은 hPSCs가 간세포 같이 세포를 형성하기 전에 원시적인 선미, 결정적인 내배엽, 후방 포인및 간 싹 선조와 같은 중간 세포 모형으로 순차적으로 분화하는 것과 같이 6단계를 수반합니다.

초록

간은 유해 물질을 해독하고, 중요한 단백질을 분비하며, 주요 대사 활동을 실행하여 생명을 유지합니다. 따라서 만성 알코올 섭취, 간염, 급성 중독 또는 기타 모욕으로 인해 발생할 수 있는 간 부전은 출혈, 황달, 혼수 상태 및 결국 사망에 이르는 심각한 상태입니다. 그러나, 간 기능 및 질병의 연구 뿐만 아니라 간 부전을 치료 하는 접근, 인간의 간 세포의 풍부한 공급의 부족에 의해 부분적으로 stymied 되었습니다. 이를 위해 이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포(hPSCs)를 간세포와 같은 세포로 효율적으로 분화하는 것을 상세히 설명하며, 6개의 연속적인 분화 단계에 걸쳐 간 운명이 어떻게 지정되는지를 설명하는 개발 로드맵에 의해 안내된다. 간 분화를 촉진하고 원치 않는 세포 운명의 형성을 명시적으로 억제하기 위해 발달 신호 경로를 조작함으로써,이 방법은 효율적으로 일 6에 의해 인간의 간 꽃 봉오리 선조와 간세포 같은 세포의 인구를 생성 PSC 차별화의 18. 이것은 혈청이 없는 배양 매체에 있는 작은 분자 그리고 성장 인자에 의해 발휘된 발달 신호 통로의 시간적으로 정확한 통제를 통해 달성됩니다. 이 시스템의 분화는 단층에서 발생하고 특징적인 간세포 효소를 발현하고 만성 간 기능 부전의 마우스 모델을 생착시키는 능력을 가진 간세포와 같은 세포를 산출합니다. 효율적으로 생체 외에서 인간의 간 세포의 큰 숫자를 생성 하는 능력은 간 부전의 치료에 대 한 파급 효과, 약물 검사에 대 한, 그리고 간 질환의 기계론 연구에 대 한.

서론

이 프로토콜의 목적은 인간 다능성 줄기 세포(hPSCs)를 간 싹 선조 및 간세포 유사 세포의 농축된 집단으로 효율적으로 분화하는 것입니다 2. 인간의 간 전구체와 간세포 같은 세포의 준비 공급에 대한 액세스는 간 기능 과 질병을 조사하기위한 노력을 가속화하고 간부전을위한 새로운 세포 이식 치료를 가능하게 할 수 3,^{4, 5}. 이것은 hPSCs (배아 및 유도 만능 줄기 세포를 포함하는)가 인체의 모든 세포 유형으로 분화 할 수 있기 때문에 과거에 도전적인 것으로 입증되었습니다. 결과적으로, 간세포^6과같은 단일 세포형의 순수한 집단으로 이들을 독점적으로 분화하는 것이 어려웠다.

hPSCs를 간 세포로 정확하게 분화하려면 먼저 간 세포가 지정되는 방법뿐만 아니라 비 간 세포 유형이 어떻게 발달하는지 이해하는 것이 중요합니다. 비간 세포가 어떻게 발달하는지에 대한 지식은 분화 동안 비 간 혈통의 형성을 논리적으로 억제하는 것이중요하며, 따라서 독점적으로....

프로토콜

1. 차별화 매체 준비

참고: 사용되는 재료 및 시약에 대한 제조업체 정보는 재료 표를 참조하십시오.

1. 염기 화학적으로 정의된 매체(CDM)의 준비
   참고: CDM2, CDM3, CDM4 및 CDM5는 다양한 단계에서 hPSCs를 간 세포로 분화하기 위한 기본 매체로 사용되는 화학적으로 정의된 매체입니다. 이러한 매체의 구성은 표 1에서찾을 수 있습니다.
   1. CDM2 또는 CDM3를 만들려면 폴리 비닐 알코올(PVA)이 포함된 스톡 용액을 준비합니다. 이스코브의 변형 된 덜베코 의 매체 (IMDM)의 50 mL에 PVA 분말 0.5 g을 용해하여 10 mg / mL PVA 스톡을 생성합니다.
      참고: PVA가 쉽게 용해되지 않기 때문에, 가열 패드에 ~ 50 °C에서 연속 교반원 플라스크에 PVA / IMDM 혼합물을 준비; 교반은 자기 교반기로 쉽게 달성 될 수있다.
   2. PVA가 IMDM에 균일하게 용해된 후, 가열 패드에서 PVA 용액을 제거하고 실온으로 식힙니다.
   3. 멸균 0.2 μm 필터를 사용하여 PVA 용액을 필터링....

결과

APS 분화의 24 시간 후에, 식민지는 일반적으로 hPSC 식민지를 할례하는 밝은 경계의 손실과 수반되는 미분화 콜로니와는 다른 형태를 채택할 것입니다. 형태학적으로, 원시 줄무늬 세포는 일반적으로 비정형 테두리를 가지고 있으며 hPSCs보다 더 많이 퍼지고 덜 컴팩트합니다 -이것은 다능성 epiblast 세포가 원형으로 분화하고 침투함에 따라 상피 - 중간엽 전이를 연상시킵니다. 생체 내에서 줄무늬. 분화 전에 hPSCs의 콜로니 크기가 너무 크면, 미분화 세포를 포함하는 과도하게 제기된 중심이 있을 것이다. 이러한 큰 덩어리를 포함하는 배양은 버려야 하며, 이 미분화된 식민지 중심은 후속의 분화를 혼동할 것이다. 정확한 크기 및 밀도의 덩어리가 도금된 경우, APS 분화는 매우 재현성이 높고 균일하며, 99.3±0.1% MIXL1-Gfp+ 원시 줄무늬 집단(MIXL1은 원시 줄무늬 마커)을 생성한다. 일부 .......

토론

이 방법은 hPSCs에서 간 꽃 봉오리 선조, 그리고 이후에 간세포 와 같은 세포의 농축 된 집단의 생성을 가능하게합니다. 인간 간 세포의 풍부한 인구를 생성 하는 능력은 이러한 세포의 실제적인 활용에 대 한 중요 하다. hPSCs로부터 간세포를 생성하는 이전 방법은 설치류로 이식시, 간 조직¹⁵이외에 뼈와 연골을 산출하는 간 및 비간 세포를 모두 포함하는 불순한 세포 집단을 산출하였다. 따라서 비 간 분화의 명시적 억제는 다양한 응용 프로그램에 적합 할 수있는 풍부한 간 인구를 생성하는 것이 중요합니다.

특히, 첫 번째 단계에서 hPSCs의 제어된 도금은 효율적인 다운스트림 분화를 위해 필수적입니다. 분화를 위해 특정 밀도로 hPSC를 정확하게 플레이트하고 도금 공정 중에 이러한 hPSCs를 웰 또는 플레이트에 고르게 분배하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 12웰 플레이트의 각 웰에 대해, 웰당 160,000~ 250,000 hPSCs.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Geltrex	Thermofisher Scientific	A1569601
1:1 DMEM/F12	Gibco	11320033
0.2  &뮤; m pore membrane filter	Millipore	GTTP02500
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850
Thiazovivin	Tocris Bioscience	3845
Accutase	Gibco 또는 Millipore	Gibco A11105, 밀리포어  SCR005
IMDM, 글루타맥스&트레이드; Thermofisher	Scientific	31980030
Ham's F-12 영양 혼합물, GlutaMAX™ 보충제	Thermofisher Scientific	31765035
KOSR, 녹아웃 세럼 대체품	Thermofisher Scientific	10828028
Poly(비닐 알코올)	Sigma-Aldrich	P8136
트랜스퍼린	시그마-알드리치
10652202001 화학적으로 정의된 지질 농축액	Thermofisher Scientific	11905031
Human Activin	R& D	338-AC
CHIR99201	토크리스	4423
PI103	토크리스	2930/1
인간 FGF2	R& D	233-FB
DM3189	토크리스	6053/10
A83-01	토크리스	2939/10
인간 BMP4	R& D	314-BP
C59	토크리스	5148
TTNPB	토크리스	0761/10
포스콜린	토크리스	1099/10
온코스타틴 M	R& D	295-OM
덱사메타손	토크리스	1126
Ro4929097	Selleck Chem	S1575
AA2P	케이맨 화학물질	16457
인간 재조합 인슐린	Sigma-Aldrich	11061-68-0