복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

Summary

이 프로토콜 자연 유기 물질과 다른 생태계에서 미생물 단백질의 완전 한 쌍 특성에 culminating 보완 분석 및 omics 기술에 대 한 단일 처리량을 설명 합니다. 이 이렇게 강력한 비교 대사 경로 및 변환을 설명 하는 온실 가스 생산 및 환경 변화에 대 한 응답을 예측에 대 한 중요 한 식별 수 있습니다.

Abstract

자연 유기 물질 (NOM) 역사적으로, 특성화 하기 어려운 증명 하는 유기 화합물의 수천의 매우 복잡 한 혼합물으로 구성 된다. 그러나, NOM의 분해에서 발생 하는 온실 가스 (이산화탄소 CO₂와 메탄 [채널₄]) 생산에 열역학 및 운동 제어, 이해 하는 분자 수준의 특성화와 결합 하 여 미생물 프로테옴 분석은 필요 합니다. 또한, 기후 및 환경 변화는 잠재적으로 유기 물 기판의 공급 및 변환을 수행 하는 미생물에 영향을 주는 복잡 한 상호 작용을 열 받은 자연 생태계를 교란 하 예상 된다. 유기 물, 미생물 proteomics, 경로 및 유기 물 분해 되는 변환의 상세한 분자 특성화 방향 및 환경 변화의 효과의 크기를 예측 하는 데 필요한 것입니다. 이 문서에서는 단일 샘플에서 포괄적인 대사 산물 특성화에 대 한 방법론 처리량 푸리에 변환 이온 싸이 클 로트 론 공명 질량 분석 (MS FTICR), 가스 크로마토그래피 질량 분석 (GC-MS)를 직접 주입 하 여 핵 자기 공명 (NMR) 분광학, 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (MS LC), 그리고 proteomics 분석. 이 방법은 유기 물질 분해, 결과 CO₂ 와 채널₄ 생산 속도, 그리고 환경 섭 동에 대 한 그들의 응답의 통로 유추에 대 한 통계 신뢰도 향상 완벽 하 게 결합 하 여 데이터 집합에서 발생 합니다. 여기 우리는 peatlands;에서 수집 된 NOM 샘플에이 메서드를 적용 한 결과 제시 그러나, 프로토콜 (예를 들어, 물, 숲된 토양, 해양 퇴적 물, 등) 어떤 NOM 샘플에 적용 됩니다.

Introduction

세계적으로, 습지 유기 C 토 탄 예금¹매장으로 주로 탄소 (C), 529 페이지 포함 견적 된다. 현재, 이러한 peatlands 북미 혼자¹29 Tg C y^-1 를 격리 그물 C 싱크 역할을 합니다. 그러나, 배수, 화재, 가뭄, 더 온난 한 온도 등 환경 장애 온실 가스를 통해 증가 C 손실의 결과로 유기 물 분해를 증가 시켜이 C 싱크를 상쇄 수 있습니다 (이산화탄소 [CO₂]와 [₄채널] 메탄) 생산^1,2. 기후 변화는 더 온난 한 온도 또는 건조 조건 빠른 C 분해 미생물에 의해 자극 하는 경우 C 감소에 기여할 수 있습니다. 또는, 높은 온도 및 공기 CO₂ 농도 유기 탄소 (OC는)로 더 많은 CO₂ 격리를 기본 생산을 자극 수 있습니다. OC CO₂ 로 분해 다음 어느 정도 하 고 얼마나 빨리와 채널₄ 는 전자 기증자 기판, 전자 수락자의 가용성 및 중재 미생물 사이 복잡 한 상호 작용에 따라 달라 집니다를 변환입니다. 대부분의 경우, ....

Protocol

1. 토양, 앙금, 또는 토 탄에서 유기 물질의 연속 추출

1. 토양, 앙금, 또는 토 탄을 통해 유선 수집 하 고 (예를 들어, 깊이) 테스트 중인 가설에 따르면 코어 분할. 소계에 게 샘플 컨테이너 코팅 및 분석 전에 저장에 대 한-80 ℃에서 동결.
   참고: 약 25 mg C이이 프로토콜에 대 한 필요 합니다. 토 탄 (일반적으로 45 %C), 말린된 토 탄의 50 mg이 필요 합니다. 더 많은 양의 샘플 C에 따라 미네랄 또는 숲이 우거진 고원 지 대 토양 콘텐츠 (최대 5 g) 처럼 낮은 유기 샘플에 대 한 필요할 수 있습니다. 유기 용 매와 추출 됩니다 2.4 단계 이온화에 부정적인 영향을 미칠, 추출 물에 어떤 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)를 당길 것 이다 때문에 샘플을 수집, 저장 하는 동안 어떤 시점에서 플라스틱에 연결할 수 있도록 하는 피하기 위해 중요 하다 또는 추출입니다.
2. 때 준비는 샘플을 분석, 일정 무게, 건조 동결 후 균질 하 고 어떤 집계 헤어 스테인리스 분쇄 볼을 사용 하 여 고속 볼 밀에서 샘플을 갈기.
   참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다이 시점에서 고-80 ° c.에 저장 된 자료
3. 개별 2 mL 유리 튜브에는 에탄올 세척 스테인리스 기구, 말린된 샘플의 각 ali....

Results

우리는 설명된 보완 분석 프로토콜을 수행 하 고 미네소타, 미국에서에서 가문비나무와 Peatlands 응답 아래 변경 환경 (가문비나무) 사이트에서 S1 수렁에 깊이 가진 토 탄을 비교. 이러한 결과 영구 동 토 층 늪지와 펜에서 사이트 대사 산물 및 효소 활동에 다를 수 있습니다 방법을 보여 북부 스웨덴에서 비교 됩니다. 우리는 proteomics 분석에 3,312 효소 발견. 깊이와 효소 활동의 분석 효소의 수 15 cm와 가문비나무 늪지 (그림 1)에서 45 cm 사이 급격히 하락을 보여준다.

Proteomics 결과 표시는 단백질 표현, 하는 동안 대사 데이터는 실제로 발생 하는 어떤 반응을 보여준다. 전반적으로, 우리 모든 FTICR-MS, NMR의 조합에서 토 탄 샘플의 67,040 대사 산물 (를 포함 하 여 지질) 식별 GC-MS와 LC MS 분석. 이들의 분자 공식 15,385 화합물 (

Discussion

단일-처리량, 대사와는 프로테옴을 특성화 하는 데 사용 하는 완전히 결합 분석 스트림 경로 c 사이클에서 발생 하는 복잡 한 생태계에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 토양 및 토 탄은 이기종 행렬, 그리고 따라서,이 방법의 중요 한 단계 중 하나 시작 토 탄 또는 토양 물자는 높게 균질 성 확보에 초기 단계에서 발생 합니다. 그것은 뿐만 집계 추출 효율을 줄일 수 있습니다 샘플을 분쇄 하는 것이 좋습니다. 이것은 낮은 C와 적절 하 게 균질를 스테인리스 볼 분쇄기를 사용 하 여 필요할 수 있습니다 높은 미네랄 내용을 집계 토양과 토양에 대 한 특정 문제. 토양 및 토 탄 실험 사이트 내에서 공간이 높을 수 있습니다, 때문에 생물 복제는 매우 것이 좋습니다.

이 방법을 활용 하 여 3 개의 용 매: 물, 메탄올, 및 클로 프롬, 편견을 추출 수는 화합물의 종류. 원칙적으로,이 연속 추출 방법을 극성 넓은 범위를 커버 하는 화합물을 solubilize 해야. 그러나,이 용 매는 유기-.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
메톡시아민 염산염	Sigma Aldrich	226904	유도체화 에이전트
5mm 삼중 공명 소금 내성 콜드 프로브	Bruker		계측
모세관 GC 컬럼 HP-5MS 컬럼 (30 m × 0.25 mm × 0.25 & m)	Agilent	AG19091S-433	기기
역상 하전 표면 하이브리드 컬럼 (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μ m 입자 크기)	ThermoFisher		instrumentation
2 mL glass vials	VWR International	46610-722	sample vials
autosampler vials	VWR International	97055-324; 9467671	sample vials
클로로포름	VWR International	JT9174-3	용매
에탄올	VWR International	BDH67002.400	용매
메탄올	VWR International	BDH85681.400	용매
피리딘	VWR International	BDH67007.400	용매
2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6	Sigma Aldrich	178837	표준
C8-C24 지방산 메틸 에스테르	Sigma Aldrich	CRM18918	표준
N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide	시그마 Aldrich	24589-78-4	표준
Suwanee River Fulvic Acid 표준	국제 부식 물질 학회	2S101F	표준
트리메틸 클로로 실란	Sigma Aldrich	89595	표준
튜닝 솔루션	Agilent
FTICR-MS 분석 소프트웨어	Bruker	Compass DataAnalysis 4.1
Formularity Software	Pacific Northwest National Laboratory	Formularity	다운로드 위치: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS		Agilent Agilent GC 7890A with MSD 5975C
silica-based sorbent	Phenomenex (Torrance, CA)	Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5	VWR International	KT897820-0008	NMR tube
Varian 다이렉트 드라이브 600MHz NMR 분광계	Varian Inova	Varian Direct Drive 600-MHz	NMR 분광계
Chenomx NMR Suite 8.3	Chenomx	Chenomx NMR Suite	NMR 소프트웨어
초고성능 액체 크로마토그래프	워터스	Aquity UPLC H	액체 크로마토그래프
Velos-ETD Orbitrap 질량분석기	ThermoFisher	Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos	질량분석기