방법 논문

세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 기본 교양된 마우스 신생아 Cardiomyocytes에 산소 소비 속도 분석

8.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59052

⸱

2019년 2월 13일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Pharmacology, University of California San Diego, 3Cardiology Section, Department of Medicine, Veterans Administration Healthcare, San Diego

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목표는 어떻게 다양 한 요인에에서 산소 소비를 변경할 수 있습니다 검사 마우스 신생아 cardiomyocytes 모델 시스템으로 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

초록

미토 콘 드리 아 및 산화 대사는 심장 근육 기능을 유지 하기 위한 중요 합니다. 연구는 미토 콘 드 리아 기능 장애는 심장 마비에서 장애인된 심장 기능에 중요 한 기여 요인으로 나타났습니다. 대조적으로, 결함이 있는 미토 콘 드리 아 기능을 복원 하는 것은 실패에 심장 기능을 개선 하기 위해 유익한 효과 있을 수 있습니다. 따라서 규제 메커니즘을 공부 하 고 미토 콘 드리 아 기능에 대 한 새로운 레 귤 레이 터를 식별 심장 질환 치료를 위한 새로운 치료 목표를 개발 하는 데 사용할 수 있는 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, 심장 myocyte 미토 콘 드리 아 호흡 독특한 셀 문화 시스템을 사용 하 여 분석 된다. 첫째, 프로토콜은 신속 하 게 격리 하 고 높은 생존 신생아 마우스 cardiomyocytes 문화 최적화 되었습니다. 다음, 96-잘 포맷 세포 외 유출 분석기는 이러한 cardiomyocytes의 산소 소비 속도 평가 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜에 대 한 우리 시드 조건을 최적화 하 고 그 신생아 마우스 cardiomyocytes 산소 소비 속도 세포 외 유출 분석기에서 쉽게 평가 될 수 있다 설명 했다. 마지막으로, 우리는 우리의 프로토콜 큰 문화 크기에 적용할 수 및 다른 연구, 세포내 신호 등 및 수축 성 기능 분석 주의.

서론

지속적인 심장 수축 기능을 하려면 cardiomyocytes ATP1의 형태로 주로 세포 에너지의 지속적인 공급을 유지 해야 합니다. 에, ATP의 대략 95%는 미토 콘 드리 아 중요 한 역할 bioenergetic 심장 기능2,3에서 보여주는 산화 인 산화를 통해 주로 미토 콘 드리 아에 의해 생성 됩니다. 그는이 개념을 지 원하는 미토 콘 드 리아 기능의 dysregulation 심근과 심장 마비4,5이어질 수 있습니다. 반대로, 미토 콘 드리 아 기능을 복원 표시 되었습니다 실패의 심장 기능을 개선 하기 위해6,7심장. 따라서 미토 콘 드리 아 생체의 메커니즘을 공부 하 고 미토 콘 드리 아 기능 cardiomyocytes에의 소설 레 귤 레이 터를 식별만 심장 에너지 생산의 기계 론 적인 통찰력을 공개 하지 않습니다 하지만 또한 이어질 것입니다 통찰력을 제공할 수 있습니다. 심장 질환6,8치료에 새로운 치료 목표의 개발.

온 마음에 비해, 매우 순수 하 고, 섬유 아 세포와 내 피 세포10같은 마음에서 비 myocytes의 최소한의 오염 있습니다 myocytes 및 비 myocytes9, cardiomyocyte 문화의 혼합물을 포함 하. 또한, 신생아 강아지에서 cardiomyocytes 격리 성인 마음10,11에서 고립 세포에 비해 시간의 작은 금액에 많은 수의 셀을 배양 수 있습니다. 가장 중요 한 것은, 기본 교양된 성인 마우스 cardiomyocytes 짧은 생존 시간 (예: 24 시간)와 장시간에 포인트 드 차별화. 신생아 마우스 cardiomyocytes 살아남을 수 그리고 문화, cardiomyocytes10마약 화합물 및 미토 콘 드리 아의 기능에 유전자 조작의 효과 테스트에 이상적에 7 일 이상에 대 한 조작. 물론, 성인 및 신생아 셀 사이의 중요 한 생물 학적 차이가 있다 하지만 미토 콘 드 리아 기능 포함 하는 연구의 다양 한 종류에 대 한 적절 한 게 신생아 셀의 문화에 대 한 사용할 수 있는 더 긴 기간.

날짜 하려면, 기본 교양된 신생아 마우스와 쥐 cardiomyocytes 심장 생체12,13연구 모델로 사용 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 연구 산소 소비 속도 (OCR)을 측정 하 고 쥐와 쥐 신생아 cardiomyocytes14,15산화 용량을 평가 하는 세포 외 유출 분석기를 사용 합니다. 쥐에 비해, 하는 동안 마우스 신생아 cardiomyocytes의 세포 생존 능력 낮은 이며 더 큰 다양성16했다. 또한, 유전자 조작된 마우스 모델에서 세포를 공부 하는 능력 만드는 마우스 셀 모델 매우 중요 하다. 감안할 때 그 OCR 연구 세포 수 및 밀도 뿌리기에 너무 민감합니다, 일관 된 셀 생산량 및 생존 능력 달성을 재현 하 고 신뢰할 수 있는, 간단한 프로토콜의 개발이 필요 합니다.

여기, 우리는 최적화 된 프로토콜 개발 된 OCR 분석에 대 한 교양된 마우스 신생아 cardiomyocytes 함께 96 잘 포맷 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 보고 합니다. 이 프로토콜은 매우 분석 결과의 재현성을 증가 한다. 또한, 프로토콜 소설 및 OCR 분석, 재현 방법 제공 뿐만 아니라 또한 필요한 myofibrillar 기능을 공부 하 고 세포내 있을 수 있습니다 같은 다른 실험적인 목적을 위한 큰 크기 문화에 적응 될 수 있습니다. 신호 경로.

특히,이 프로토콜 고립과 96 잘 셀 문화 접시에 신생아 마우스 cardiomyocytes의 문화에 대 한 일 절차를 설명합니다. 또한, 그것은 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 절차를 설명 합니다. 모든 솔루션에 사용 되는 살 균 또는 살 균 필터링. 모든 도구는 75% 에탄올에 의해 살 균. 우리는 절차의 다양 한 부분에 대 한 테이블의 자료 를 제공합니다. Cardiomyocytes 경작에 대 한 모든 절차 및 단계는 표준 셀 문화 후드에서 수행 됩니다. 이 프로토콜은 신생아 마우스 마음 한 쓰레기 (약 8-10 새끼)에서 격리에 대 한 개발. 그러나, 프로토콜 또한 cardiomyocytes 여러 담가에서 분리 하는 데 적용할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

신생아 쥐와 작품에 대 한 동물 보호 프로그램에 의해 규정 된 지역 대학/연구소 지침 설정을 참조 하 고 하나의 기관 및 다른 적절 한 규정을 준수 하십시오. 이 프로토콜에서 설명 하는 모든 방법 UC 샌디에고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)을 승인 하 고 연방 및 주 규정 준수.

1입니다. 시 약의 준비

  1. 25 mL 사전 소화 솔루션의 준비: (캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +) 없이 HBSS trypsin (0.5 mg/mL)와 보충. 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독 하 고 사용까지 얼음에 계속. 실험 당일 사전 소화 솔루션을 확인 합니다.
    참고: 그것 없이 캘리포니아2 + HBSS를 사용 하 여 중요 한 이며, Mg2 +, 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + myocyte 수축과 격리 중 후속 세포 죽음을 발생 합니다.
  2. 30 mL 콜라 소화 버퍼의 준비: 콜라 (0.8 mg/mL, 약 350 U/mL) (캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +) 없이 HBSS 버퍼에 녹아. 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독 하 고 사용까지 얼음에 계속. 실험의 하루에 콜라 소화 솔루션을 확인 합니다.
  3. 500 mL cardiomyocyte 문화 미디어 (성장 매체)의 준비: DMEM의 375 mL, M-199의 125 mL, 말 혈 청의 25 mL 및 FBS의 12.5 mL를 혼합. 1% 페니실린과 1% 스 솔루션으로 보충.
  4. 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 매체준비: DMEM의 게 200 mL 1 m m 나트륨 pyruvate, 2 m L-글루타민, m 그리고 10 mM 포도 당와 2 mM Hepes 보충 스트레스 테스트 매체 (DMEM NaHCO3, 없이 재료의 표참조)를 기반으로.
    참고: DMEM 매체의 1 L 나트륨 pyruvate, L-글루타민, 포도 당, Hepes, 살 균, 필터 없이 만들고 4 ° C에 저장 다른 시 약을 추가 하 여 분석 결과의 날에 스트레스 테스트 매체를 준비 합니다. DMEM을 사용 하 여 매체 NaHCO3 없이 중요 합니다.
  5. 사용 당일 7.4 미토 콘 드 리아 스트레스 테스트 미디어의 pH를 조정 합니다. 37 ° c 사용 하기 전에 따뜻한 미디어입니다.
  6. Oligomycin준비: 준비 DMSO에 5 m m 재고 솔루션의 5 mL, 250 µ L aliquots, 고-20 ° c.에 저장
  7. FCCP준비: 준비 DMSO에 5 m m 재고 솔루션의 5 mL, 250 µ L aliquots, 고-20 ° c.에 저장
  8. 준비 antimycin A: DMSO에 5 m m 재고 솔루션의 5 mL을 준비, 250 µ L aliquots, 고-20 ° c.에 저장
  9. 로 테 논준비: 준비 DMSO에 5 m m 재고 솔루션의 5 mL, 250 µ L aliquots, 고-20 ° c.에 저장
    참고: 모든 시 약 및 솔루션이이 프로토콜에 사용 되는 표 1에 나열 됩니다.

2. 수확 및 신생아 쥐 (주 1)에서 하트의 사전 소화

  1. 오토 클레이 브가 위, 집게, 그리고 소독 모리아 숟가락.
  2. 불 임에 대 한 셀 문화 후드에 있는 모든 단계를 수행 합니다.
  3. 6 잘 셀 문화 접시;의 각 잘 HBSS (없이 캘리포니아2 +, 마그네슘2 +)의 aliquot 5 mL 얼음에 놓습니다. Aliquot 10 mL HBSS 10 cm 세포 배양 접시에.
  4. 20 mL 50 mL의 멸 균 원뿔 튜브에 트립 신 소화 전 솔루션의 준비. 얼음에 모든 솔루션을 유지.
  5. 신속 하 게 신생아 (0 일) 쥐 살 균을 위한 70% 에탄올 용액에 담근 다.
  6. (똑바로) 마 취 없이 무 균가 위를 사용 하 여 새끼를 목을 벨 한 다음 흉 강 심장에 대 한 액세스를 허용 하도록 흉 골을 따라 가슴을 엽니다. (그림 1A)
    참고: 1) P0 신생아 쥐를 사용 하 여 높은 세포 생존 능력을 달성 하는 것이 중요. 2)이 안락사 메서드는 NIH와 미국 수의 의학 협회 지침 17에 따라 신생아에 대 한 허용 됩니다.
  7. 좋은 위와 HBSS (캘리포니아2 +, 마그네슘2 +) 없이 포함 된 살 균 세포 문화 접시에 즉시 전송 몸에서 마음을 추출 (그림 1B).
  8. 모든 잔여 폐 조직, 큰 혈관 등 을 제거 (및 심 방, 원하는 경우). 부드러운 동요를 사용 하 여 HBSS 솔루션에 마음을 씻으십시오.
  9. 각 심장 좋은 위 8 조각으로 잘라내어 HBSS (그림 1C 및 1d)와 6-잘 셀 문화 판의 한 잘에 집게와 모든 심 혼 직물을 전송.
  10. HBSS, 모리아 숟가락 (그림 1D)를 사용 하 여 가득 6 잘 플레이트에 마음 잘에서 우물을 전송 하 여 마음을 씻어.
    참고: 전송 마음 잘에서 잘 하는 것은 피를 충분 하다. 혈액 효소 소화를 방해 하는 때문에, 그것은 HBSS로 마음을 세척 하 고 혈액을 제거 하는 것이 중요입니다.
  11. 트립 신 (0.5 mg/mL) 20 mL를 포함 하는 원뿔 관으로 모리아 스푼으로 마음을 전송 및 4 ° C에서 4 h (그림 1E)에 대 한 부드러운 동요와 함께 품 어.

3. 준비 96 잘 문화 접시 (1 일)

  1. 코팅 액의 5 mL을 준비: PBS 0.5% 젤라틴 (압력솥 사용 하기 전에) 및 1 %fibronectin 솔루션 포함. (예: 5 mL 젤라틴 솔루션 플러스 fibronectin 솔루션의 50 µ L)
  2. 96-잘 셀 문화 플레이트의 각 음에 코팅 솔루션의 aliquot 50 µ L ( 재료의 표참조). 거품이 있으면, 거품 밖으로 빨 아 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 그들을 제거 합니다.
    참고: 그것은 각 잘 코팅 솔루션의 모든 표면 영역을 커버 해야 합니다.
  3. 매트릭스 코팅의 건조 수 있도록 1 시간 이상 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에 접시를 품 어.
  4. Cardiomyocytes 뿌리기 전에 어떤 잔여 코팅 솔루션을 발음.

4. 효소 소화와 세포 (주 1)의 도금

  1. 전 콜라 소화 솔루션 37 ° C 물 욕조에 따뜻한.
    참고: 이 효율적인 효소 소화를 달성 하기 위해 중요 한 단계입니다.
  2. 마음과 셀 문화 후드에 4 ° C에서 사전 소화 솔루션을 포함 하는 원뿔 튜브를 이동 합니다. (그림 1 층)
  3. 마음은 튜브의 맨 아래에 침 몰과 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 사전 소화 솔루션 제거 (절연 매체의 1 ~ 2 mL는 튜브에는 남아 있을 수 있습니다).
  4. 튜브에 HBSS의 10 mL를 추가 합니다. 다시 일시 중단 HBSS는 마음 2-3 회 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 트립 신에 밖으로 씻어. HBSS 발음 (1 ~ 2 mL는 튜브에는 남아 있을 수 있습니다).
  5. 마음으로 튜브에 미리 데워 진된 콜라 소화 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. (그림 1G)
  6. 마음이 동요 하지 않고 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 품 어 (1 소화).
  7. 1 소화 후 셀 문화 후드에 튜브를 이동 합니다. 부드럽게 다시 부드럽게 10 번 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 튜브 내 마음을 일시 중단 하 여 마음을 triturate. 이 분산 마음과 심장 조직에서 나올 셀 수 있게 됩니다. (그림 1 H)
    참고: Cardiomyocytes 깨지기 때문에, 부드러운 분쇄는 높은 생존 능력을 달성 해야 합니다.
  8. 소화 되지 않은 조직 싱크대, cardiomyocytes (약 9-10 mL) 새로운 원뿔 관에 농축 소화 솔루션 전송 및 즉시 콜라 소화 중지를 세포 배양의 동일한 금액을 추가 하자.
  9. 나머지 소화 되지 않은 심 혼 직물을 포함 하는 관으로 콜라 소화 솔루션의 10 mL를 추가 합니다.
  10. 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 심 혼 직물의 튜브를 품 어 (2 소화).
  11. 4.7-4.8 절차를 반복 합니다.
    참고: 여전히 훨씬 소화 되지 않은 조직의 경우, 소화 한 번 더 반복 합니다. 그러나, 대부분의 경우, 두 개의 소화 심장 조직에서 세포의 대부분을 분산에 충분 하다.
  12. 새로운 살 균 50 mL 원뿔 튜브에 멸 균 셀-스 트레이너 (100 µ m 나일론 메쉬)를 배치 합니다. 세포 배양의 2-3 mL와 함께 셀 스 트레이너를 미리 젖은 고 셀 셀 스 트레이너를 통해 전달 합니다. 세포 배양의 2-3 mL와 함께 셀 여과기를 헹 구 십시오. (그림 1I)
  13. Cardiomyocytes 180 x g (그림 1J)에서 5 분을 포함 하는 원뿔 튜브 원심 세포 조직 파편을 포함 하 고 다시 세포 배양 (그림 1 L) 10 mL에 셀 펠 릿을 중단 것입니다 (그림 1 K), 상쾌한 발음
  14. 부드럽게 resuspend 셀과 10 cm 세포 문화 접시 (플라스틱 코팅의 어떤 유형도 없이)에 판 셀 및 셀 문화 인큐베이터 (1 사전 도금)에서 1 시간에 대 한 품 어 (그림 1 M). 이 중 도금 단계 비-cardiomyocytes, 섬유 아 세포와 내 피 세포, uncoated 세포 배양 접시에 같은 수 있습니다.
    참고: 이 시점에서, cardiomyocytes는 일반적으로 둥근 모양 나타나고 현미경 빛나는 있습니다. (그림 1N)입니다.
  15. 1 h 부 화 후 부드럽게 접시 선동, 세척 비 부착 한 세포 (cardiomyocytes에 농축) 10 cm 배양 접시에서 하 고 다시 반복 해 서 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 접시에 세포 배양 매체를 pipetting으로 셀을 일시 중단. 다음, 새로운 10 cm 세포 문화 접시 (어떤 코팅 없이 플라스틱)에 비 부착 한 세포 (cardiomyocytes에 농축)을 전송 하 고 셀 문화 인큐베이터 (2 중 도금)에 추가 1 h에 대 한 품 어.
    참고: 비 코팅 판에 연결 된 셀은 대부분 비 cardiomyocytes: 섬유 아 세포와 내 피 세포를 현미경 (그림 1O) 구상 될 수 있다.
  16. 2 중 도금, 부드럽게 접시 선동, 10 cm 배양 접시에서 비 부착 한 세포 (cardiomyocytes)을 씻어 후는 cardiomyocytes 새로운 50 mL 원뿔 튜브로 전송 합니다.

5. 셀과 셀 셀 96 잘 문화 접시 (1 일)으로 도금

  1. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
  2. 셀 밀도 103 셀/잘 200 µ L (그림 1 P)의 마지막 볼륨에 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 x 10-30 사이 기질 코팅 96 잘 셀 문화 접시에 접시. 배경에 대 한 웰 스 A1, A12, H1, 및 H12 사용:이 웰 스 (셀)에 다른 우물으로 문화 매체의 200 µ L를 추가. 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에 접시를 품 어.
    참고: 이 연구에서는 산소 소비는 10 x 103, 20 x 103또는 30 x 103 셀/잘 같은 다른 셀 밀도 사용 하 여 시험 되었다. (그림 2A)입니다. 또한, 위의 절연 직후 cardiomyocytes는 일반적으로 둥근 모양 나타나고 현미경 빛나는 있습니다. 실행 가능한 세포 문화 16-24 h 이내 밖으로 평평 것입니다.

6. 산소 소비 분석 결과 96 잘 포맷 세포 외 유출 분석기 (주 2)를 사용 하 여

참고: 산소 소비 분석 결과 셀 도금 후에 1 일 실시 될 수 있습니다 이상. 신생아 cardiomyocytes 교양이 프로토콜 최대 7 일 이내에 살아남을 수 있는 사용 하 여 격리 게시.

  1. 플럭스 분석기 센서 카트리지 수 화 ( 재료의 표참조) 적어도 3 시간 동안, 하지만 이상적으로 분석 결과 전에 하루 종일. Calibrant 솔루션의 200 µ L를 추가 유틸리티 플레이트의 각 우물에 넣어 센서 카트리지 다시 유틸리티 접시에 ( 재료의 표참조)와 CO2 또는 O2 보충 없이 37 ° C 배양 기에서 품 어.
  2. 한 시간 분석 결과 전에 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 중간에 세포 배양을 변경 합니다. Cardiomyocytes는 약 합니다. 따라서, 부드럽게 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 셀 문화 미디어를 제거 하 고 미리 따뜻하게 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 미디어의 200 µ L 셀을 두 번 세척. 두 번째 세척 후 미리 따뜻하게 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 미디어의 175 µ L을 추가 하 고 37 ° C 배양 기 CO2 또는 O2 보충 없이 셀 문화.
  3. 집중된 테스트 화합물을 준비 합니다. 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트, 3.0 mL 각 16 µ M oligomycin, 9 µ M FCCP, 그리고 20 µ M로 테 논 및 20 µ M antimycin, 미토 콘 드리 아 스트레스 테스트 중간에 모두의 혼합을 준비 합니다.
    참고: 각 화합물 농도 설명에서 테스트 되었습니다. 그러나, 자신의 실험실에서 각 화합물의 농도 titrating 필요 하다.
  4. 멀티 채널 피 펫 (그림 1 분기)를 사용 하 여 센서 카트리지의 인젝터 포트를 각 화합물의 25 µ L를 로드 합니다. 볼륨 및 최종 농도 표 2에 설명 되어 있습니다.
  5. 세포 외 유출 분석 결과 프로토콜을 설정 합니다. 프로그램에서 설명 하는 표 3.
  6. 프로그램을 시작 합니다. 첫째, 캘리브레이션 (그림 1R) 용 기계로 센서 카트리지를 넣어. 교정 단계 완료 되 면 시험 접시에 대 한 calibrant를 교체 합니다.
    참고: 제조업체에서 제공 하는 소프트웨어를 사용 하 여, 우물과 각 화합물의 그룹 및 포트를 나타냅니다.
  7. 원하는 경우, 분석 결과, 후 신중 하 게 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 모든 분석 결과 매체를 삭제 하 고 셀 문화 microplate 단백질 분석 결과 사용 하 여 미래의 셀 정규화-20 ° C에서 저장 합니다.
  8. 단백질 함량을 측정 합니다. 50 µ L 표준 RIPA 세포 세포의 용 해 솔루션의 추가 ( 재료의 표참조). 완전 세포를 lyse을 30 분 동안 얼음에 플레이트를 품 어. 새로운 투명 플랫 바닥 96 잘 시험 접시에 모든 자료를 전송 합니다.
  9. 제조 업체의 프로토콜에 따라 분석 결과 BCA 단백질 농도 측정.
    참고: 기질과 잘 코팅 각 잘에서 높은 단백질 농도에서 발생 합니다. 따라서, 실제 세포 단백질 농도를 배경 well(s) (셀)의 금액을 뺍니다. 셀에서 파생 된 단백질 농도 96 잘 문화 접시에서 낮습니다. 또한, 단백질 농도 잘 기질 코팅으로 인해 우물에서 달라질 수 있습니다. 따라서, 셀 번호를 사용 하 여 OCR을 정상화 하는 것이 좋습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

설명 된 프로토콜을 사용 하 여 마음 하루 0 신생아 강아지에서 격리 했다. 5 x 105 셀/강아지 가져온, 그리고 cardiomyocytes 10 x 103, 20 x 103또는 잘/30 x 103 셀, 96 잘 접시 (그림 2A)에서 밀도에 씨를 뿌리고 있었다. 야간 문화, 후 cardiomyocytes 발견 코팅된 플라스틱 표면에 잘 부착 된 거의 연결 되지 않은 셀 (첨부 되지 않은 셀 계속 나타납니다으로 라운드 하 고 반짝이, spreadout는 건강 하 고, 연결 된 셀에 비해) 있었다 ( 그림 2A 그리고 B)입니다. 이 시점에서, 자발적 계약 cardiomyocytes 쉽게 볼 수 있었다. 30 x 103 셀/잘 시드 밀도...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 연구에서 우리는 분리 하 고 마우스 신생아 cardiomyocytes 경작에 대 한 간단한 프로토콜을 설립 했다. 사용 하 여 이러한 cardiomyocytes, 우리는 또한 세포 외 유출 분석기 시스템을 사용 하 여 산소 소비 속도 측정 하는 조건을 최적화. 프로토콜을 사용 하 여 마우스 신생아 cardiomyocytes 모델 시스템으로 얼마나 다양 한 요인이 그대로 기관 측정 될 것 이다 가까운 심장의 주 작업 세포에 산소 소비를 변경할 수 있습니다 검사 있습니다. 우리의 프로토콜은 이전에 게시 프로토콜16,18에 다릅니다. 첫째, 높은 생존 능력을 달성 하기 위해 출생 시 즉시만 새끼는 다른 프로토콜16,19에 일반적으로 사용 되는 나이 (P3에 P0 새끼), 3 일 일 0에서에서 사람 대신 (예: P0)를 사용...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

우리는 모든 로스 연구소 및 머피 연구소 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 미국 심 혼 협회 (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806)와 R.S.R. 버지니아 가치 (BX003260)에 의해 지원

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
안티마이신 ASIGMAA8674의 복합체 III을 억제합니다
. m 모공FALCON352360소화되지 않은 조직을 포착하기 위해
콜라겐 분해 효소 유형 IIWorthingtonLS004176콜라겐 분해 효소 분해 용액을 만들려면
D-GlucoseSIGMA75351미토 코드드 스트레스 테스트 매체를 만들려면
DMEM 고 포도당Life technologies11965-092세포 배양 배지
를 만들려면NaHCO3, 포도당, 피루브산, 글루마닌 및 헤페가 없는 DMEMSIGMAD5030-10X1L미토코드드리아 스트레스 테스트 매체
FCCP(카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존)를C2920미토콘드리아 호흡
태아 소 혈청(FBS)생명 기술26140-079세포 배양 배지
피브로넥틴을 만들기 위해 소 플라즈마SIGMAF1141-5MG조직 배양 플레이트용 코팅 용액 만들기 위해
미세 가위Fine Sciences Tools14060-10
돼지 껍질에서 젤라틴SIGMAG-1890조직 배양 플레이트용 코팅 용액 만들기 위해
HBSS(Hank의 균형 잡힌 소금 용액, Ca2+, Mg2+ 없음)Cellgro21-022-CV심장을 씻고 사전 소화 및 콜라 그내 소화 용액을 만들기 위해
HEPES (1 M)Fisher scientific15630080미토 코드리아 스트레스 테스트 배지를 만들기 위해
말 혈청Life technologies26050-088세포 배양 배지
L-GlutamineSIGMAG-3126위해 미토 코드리아 스트레스 테스트 배지
M-199를 만들기 위해Cellgro10-060-CV세포 배양 매체
Moria 스푼 Fisher과학NC9190356마음을 씻기 위해 
올리고마이신SIGMA75351-5MG미토콘드리아 ATP 합성효소
RIPA 완충제Fisher scientific89900단백질 분석을 위해 세포를 용해
로테논SIGMAR8875미토콘드리아의 복합체 I 억제
해마 XFe96 세포 외 플럭스
분석기		산소 소비율
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102601-100플럭스 분석기 배양 플레이트, 센서 카트리지 및 캘리브런트 패키지
소듐 피루브산SIGMAP2256미토코드드리아 스트레스 테스트 매체를 만들기 위해
직선 가위Fine Sciences Tools91401-12심장 해부용
주사기 필터 0.2 μ m 크기소화 매체의 멸균 여과 용
TrypsinUSB Corporation22715-25GM사전 소화 용액을 만들기 위해
는 미토콘드리아 세포 여과기 100 &mu 만들기 위해SIGMA 을 분리하려면 심장 해부용 을 만들기 억제 분석에 사용되는 애질런트 장치

참고문헌

  1. Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
  2. Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
  3. Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
  4. Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
  5. Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116(2015).
  6. Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
  7. Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13(2011).
  8. Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
  9. Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
  10. Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
  11. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
  12. Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
  13. Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).
  14. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
  15. Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
  16. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
  17. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  18. Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
  19. Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
  20. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  21. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  22. Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
  23. Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
  24. Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
  25. Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
  26. Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
  27. Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
  28. Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
  29. Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
  30. Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
  31. Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
  32. Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

96FCCP

관련 논문