세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 기본 교양된 마우스 신생아 Cardiomyocytes에 산소 소비 속도 분석

요약

이 프로토콜의 목표는 어떻게 다양 한 요인에에서 산소 소비를 변경할 수 있습니다 검사 마우스 신생아 cardiomyocytes 모델 시스템으로 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

초록

미토 콘 드리 아 및 산화 대사는 심장 근육 기능을 유지 하기 위한 중요 합니다. 연구는 미토 콘 드 리아 기능 장애는 심장 마비에서 장애인된 심장 기능에 중요 한 기여 요인으로 나타났습니다. 대조적으로, 결함이 있는 미토 콘 드리 아 기능을 복원 하는 것은 실패에 심장 기능을 개선 하기 위해 유익한 효과 있을 수 있습니다. 따라서 규제 메커니즘을 공부 하 고 미토 콘 드리 아 기능에 대 한 새로운 레 귤 레이 터를 식별 심장 질환 치료를 위한 새로운 치료 목표를 개발 하는 데 사용할 수 있는 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, 심장 myocyte 미토 콘 드리 아 호흡 독특한 셀 문화 시스템을 사용 하 여 분석 된다. 첫째, 프로토콜은 신속 하 게 격리 하 고 높은 생존 신생아 마우스 cardiomyocytes 문화 최적화 되었습니다. 다음, 96-잘 포맷 세포 외 유출 분석기는 이러한 cardiomyocytes의 산소 소비 속도 평가 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜에 대 한 우리 시드 조건을 최적화 하 고 그 신생아 마우스 cardiomyocytes 산소 소비 속도 세포 외 유출 분석기에서 쉽게 평가 될 수 있다 설명 했다. 마지막으로, 우리는 우리의 프로토콜 큰 문화 크기에 적용할 수 및 다른 연구, 세포내 신호 등 및 수축 성 기능 분석 주의.

서론

지속적인 심장 수축 기능을 하려면 cardiomyocytes ATP¹의 형태로 주로 세포 에너지의 지속적인 공급을 유지 해야 합니다. 에, ATP의 대략 95%는 미토 콘 드리 아 중요 한 역할 bioenergetic 심장 기능^2,3에서 보여주는 산화 인 산화를 통해 주로 미토 콘 드리 아에 의해 생성 됩니다. 그는이 개념을 지 원하는 미토 콘 드 리아 기능의 dysregulation 심근과 심장 마비^4,5이어질 수 있습니다. 반대로, 미토 콘 드리 아 기능을 복원 표시 되었습니다 실패의 심장 기능을 개선 하기 위해^6,7심장. 따라서 미토 콘 드리 아 생체의 메커니즘을 공부 하 고 미토 콘 드리 아 기능 cardiomyocytes에의 소설 레 귤 레이 터를 식별만 심장 에너지 생산의 기계 론 적인 통찰력을 공개 하지 않습니다 하지만 또한 이어질 것입니다 통찰력을 제공할 수 있습니다. 심장 질환⁶<....

프로토콜

신생아 쥐와 작품에 대 한 동물 보호 프로그램에 의해 규정 된 지역 대학/연구소 지침 설정을 참조 하 고 하나의 기관 및 다른 적절 한 규정을 준수 하십시오. 이 프로토콜에서 설명 하는 모든 방법 UC 샌디에고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)을 승인 하 고 연방 및 주 규정 준수.

1입니다. 시 약의 준비

1. 25 mL 사전 소화 솔루션의 준비: (캘리포니아^{2 +} 그리고 마그네슘^{2 +}) 없이 HBSS trypsin (0.5 mg/mL)와 보충. 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독 하 고 사용까지 얼음에 계속. 실험 당일 사전 소화 솔루션을 확인 합니다.
   참고: 그것 없이 캘리포니아^{2 +} HBSS를 사용 하 여 중요 한 이며, Mg^{2 +}, 캘리포니아^{2 +} 그리고 마그네슘^{2 +} myocyte 수축과 격리 중 후속 세포 죽음을 발생 합니다.
2. 30 mL 콜라 소화 버퍼의 준비: 콜라 (0.8 mg/mL, 약 350 U/mL) (캘리포니아^{2 +} 그리고 마그네슘<....

결과

설명 된 프로토콜을 사용 하 여 마음 하루 0 신생아 강아지에서 격리 했다. 5 x 10⁵ 셀/강아지 가져온, 그리고 cardiomyocytes 10 x 10³, 20 x 10³또는 잘/30 x 10³ 셀, 96 잘 접시 (그림 2A)에서 밀도에 씨를 뿌리고 있었다. 야간 문화, 후 cardiomyocytes 발견 코팅된 플라스틱 표면에 잘 부착 된 거의 연결 되지 않은 셀 (첨부 되지 않은 셀 계속 나타납니다으로 라운드 하 고 반짝이, spreadout는 건강 하 고, 연결 된 셀에 비해) 있었다 ( 그림 2A 그리고 B)입니다. 이 시점에서, 자발적 계약 cardiomyocytes 쉽게 볼 수 있었다. 30 x 10³ 셀/잘 시드 밀도.......

토론

이 연구에서 우리는 분리 하 고 마우스 신생아 cardiomyocytes 경작에 대 한 간단한 프로토콜을 설립 했다. 사용 하 여 이러한 cardiomyocytes, 우리는 또한 세포 외 유출 분석기 시스템을 사용 하 여 산소 소비 속도 측정 하는 조건을 최적화. 프로토콜을 사용 하 여 마우스 신생아 cardiomyocytes 모델 시스템으로 얼마나 다양 한 요인이 그대로 기관 측정 될 것 이다 가까운 심장의 주 작업 세포에 산소 소비를 변경할 수 있습니다 검사 있습니다. 우리의 프로토콜은 이전에 게시 프로토콜^16,18에 다릅니다. 첫째, 높은 생존 능력을 달성 하기 위해 출생 시 즉시만 새끼는 다른 프로토콜^16,19에 일반적으로 사용 되는 나이 (P3에 P0 새끼), 3 일 일 0에서에서 사람 대신 (예: P0)를 사용.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
안티마이신 A	SIGMA	A8674	의 복합체 III을 억제합니다
. m 모공	FALCON	352360	소화되지 않은 조직을 포착하기 위해
콜라겐 분해 효소 유형 II	Worthington	LS004176	콜라겐 분해 효소 분해 용액을 만들려면
D-Glucose	SIGMA	75351	미토 코드드 스트레스 테스트 매체를 만들려면
DMEM 고 포도당	Life technologies	11965-092	세포 배양 배지
를 만들려면NaHCO3, 포도당, 피루브산, 글루마닌 및 헤페가 없는 DMEM	SIGMA	D5030-10X1L	미토코드드리아 스트레스 테스트 매체
FCCP(카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존)	를	C2920	미토콘드리아 호흡
태아 소 혈청(FBS)	생명 기술	26140-079	세포 배양 배지
피브로넥틴을 만들기 위해 소 플라즈마	SIGMA	F1141-5MG	조직 배양 플레이트용 코팅 용액 만들기 위해
미세 가위	Fine Sciences Tools	14060-10
돼지 껍질에서 젤라틴	SIGMA	G-1890	조직 배양 플레이트용 코팅 용액 만들기 위해
HBSS(Hank의 균형 잡힌 소금 용액, Ca2+, Mg2+ 없음)	Cellgro	21-022-CV	심장을 씻고 사전 소화 및 콜라 그내 소화 용액을 만들기 위해
HEPES (1 M)	Fisher scientific	15630080	미토 코드리아 스트레스 테스트 배지를 만들기 위해
말 혈청	Life technologies	26050-088	세포 배양 배지
L-Glutamine	SIGMA	G-3126	위해 미토 코드리아 스트레스 테스트 배지
M-199	를 만들기 위해Cellgro	10-060-CV	세포 배양 매체
Moria 스푼 Fisher	과학	NC9190356	마음을 씻기 위해
올리고마이신	SIGMA	75351-5MG	미토콘드리아 ATP 합성효소
RIPA 완충제	Fisher scientific	89900	단백질 분석을 위해 세포를 용해
로테논	SIGMA	R8875	미토콘드리아의 복합체 I 억제
해마 XFe96 세포 외 플럭스 분석기	산소 소비율
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102601-100	플럭스 분석기 배양 플레이트, 센서 카트리지 및 캘리브런트 패키지
소듐 피루브산	SIGMA	P2256	미토코드드리아 스트레스 테스트 매체를 만들기 위해
직선 가위	Fine Sciences Tools	91401-12	심장 해부용
주사기 필터 0.2 μ m 크기			소화 매체의 멸균 여과 용
Trypsin	USB Corporation	22715-25GM	사전 소화 용액을 만들기 위해

는 미토콘드리아 세포 여과기 100 &mu 만들기 위해SIGMA 을 분리하려면 심장 해부용 을 만들기 억제 분석에 사용되는 애질런트 장치