방법 논문

인간의 본질적인 Microbiota 공부 기술을 경작 하는 체 외에서 고급 적용

DOI:

10.3791/59054

⸱

2019년 2월 15일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Dairy and Functional Foods Research Unit, Eastern Regional Research Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2ProDigest, 3Division of Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Children's Hospital of Philadelphia

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 선물이 위장 장 관의 생리 조건을 시뮬레이션 bioreactors의 시리즈를 사용 하 여 콜론 생체 외에서, 의 본질적인 microbiota 경작을 위한 프로토콜.

초록

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인간의 본질적인 microbiota 인간의 건강과 질병에 중요 한 역할을 한다. Vivo에서 모델을 사용 하 여 본질적인 microbiota 공부, 복잡 한 자연, 및 포유류 구성 요소와의 다양 한 연결 어렵습니다. 이 프로토콜의 목표는 본질적인 microbiota 생체 외에서, 본질적인 microbiota 역학의 연구에 대 한 포유류 환경의 기여를 고려 하지 않고 수 있는 문화 이다. 체 외에서 배양 기술을 사용 하 여, 위장 장 관의 생리 상태는 시뮬레이션, pH, 온도, anaerobiosis, 운송 시간 등의 매개 변수를 포함 하 여. 결 장의 표면 mucin 코팅 사업자를 추가 하 고, 점 막 단계를 만드는 추가 차원을 추가 하 여 시뮬레이션 됩니다. 본질적인 microbiota 인간의 배설물 소재 접종에 의해 소개 된다. 박테리아의이 복잡 한 혼합 접종 시 특정 미생물 풍성 하 게는 다른 경도 (오름차순, 가로 및 내림차순 콜론) 및 생체 외에서 모델의 횡단 (luminal 및 점 막) 환경. 그것은 있는 지역 사회와 대사 산물 생산 안정적으로 유지 하는 정상 상태에 도달 하는 게 중요 합니다. 이 원고에서 실험 결과 시간이 지남에 접종된 본질적인 microbiota 커뮤니티 안정적인 커뮤니티로 개발 하는 방법을 보여 줍니다. 정상 상태 달성 되 면 세균성 상호 작용 및 지역 사회 기능을 분석 하거나 음식, 음식 구성 요소, 의약품 등 본질적인 microbiota에 어떤 첨가물의 효과 테스트 하는 시스템을 사용할 수 있습니다.

서론

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본질적인 microbiota 인간의 위장 지역 (GIT)에 있는 미생물의 커뮤니티입니다.  이 커뮤니티는 콜론 콜론 환경1,2공생에 살고 있는 500-1000 종에서 1013-10-14 박테리아를 추정 되는 최대 농도 도달 합니다. 본질적인 microbiota의 기능과 구성2,3,,45distally 발견 대부분 다양성 지역 특정 커뮤니티를 형성 하는 GIT 따라 공간적으로 변경 합니다. 각 해 부 지역에 대 한 별도 미생물 지역 사회 거주 루멘에와 점 막 라이닝6에. 루멘 커뮤니티 기판 이동 luminal 구획7영양소에 대 한 직접적인 액세스를 있다. 그럼에도 불구 하 고, 일부 박테리아는 mucin 에너지 소스1,,58로 결 장 세포에 의해 생산을 활용 하 여 점액 층에 우선적으로 상주 합니다. Luminal 및 점 막 단계 microenvironments에 차이 위상 특정 커뮤니티의 개발에 결과. 함께, 이러한 커뮤니티 영양소 대사와 비타민, 생산 등의 신진 대사 기능 및 인간 병원 체1,3, 의 식민을 방지 하는 등 면역 기능 제공 9. 본질적인 microbiota 또한 인간의 콜론 셀3활용에 기능적으로 작동.

인간의 GIT의 중요 한 부분으로 그것은 놀라운 본질적인 microbiota 두 호스트 건강 및 질병 상태3,9,10,,1112을 알려져 있다. 창 자 미생물 인구 변화 장 장 질병 (IBD)와 장 창 자 증후군 (IBS), 뿐만 아니라 비만, 순환기 질환, 자폐증 등 다른 질병 처럼 GIT 질환 등 여러 인간의 질병와 연결 되어 3 , 9 , 10 , 11 , 12. 본질적인 microbiota에서 생산 하는 대사 산물 용기12,13까지 위치를 도달 글로벌 효과 있다. 예를 들어 창 자 뇌 축14불안과 우울증 같은 정신 질환에 연결 됩니다. 따라서, 본질적인 microbiota을 공부, 연구의 여러 분야에 중요 한 이며 심지어 그는 GIT와 자주 관련 된 많은 질병에 적용 됩니다.

그것은 널리 인정 본질적인 microbiota을 공부 하 고 중요 한, 그것은 복잡 한 노력입니다. 여러 동물 모델 원숭이 돼지15-19같은 큰 것 zebrafish, 쥐, 및 쥐 같은 작은 동물에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 인간의 본질적인 microbiota 측면에서이 동물의 응용 하지 간단 때문이 동물에 독특한 세균성 지역 사회 진화 환경에 다이어트, 따라 그리고 그들은 해부학 다른 인간20 , 21. 인체를 사용 하 여 관련성의 질문 제거 아직 도전의 또 다른 세트를 소개 합니다. 인간 연구는 비싼, 시간이 소모 되 고 윤리적 제한11. 또한, 혼동 요인 나이 또는 발달 단계, 환경, 다이어트, 약물 치료, 그리고 유전적 요인2,,422를 포함 하 여 인간 연구에서 본질적인 microbiota 영향.  인 간에, 테스트할 수 있습니다 그리고 어떤 유형의 샘플4번에서 무엇을 수확 수 있습니다에 대 한 제한도 있습니다.

본질적인 microbiota 공부을 vivo에서 시스템을 사용 하 여 1 개의 중요 한 불리는 포유류 부품의 존재입니다. 본질적인 microbiota와 인간 세포 서로, 상호 작용 그리고 vivo에서 설정, 그것은 둘을 구별할 수 있습니다. 본질적인 microbiota에 의해 생산 하는 대사는 촬영 결 장 세포에 의해 측정 정밀도로 산출 될 수 없습니다. 따라서, 모든 기계 연구 끝점 측정11를 제한 해야 합니다. Vivo에서 학문에 대 한 또 다른 주요 단점은 경도 GIT의 다른 지역에서 샘플을 수확 하는 무 능력은23. 이 시간12에 콜론의 microenvironments에서 발생할 수 있는 변경의 평가 대 한 허용 하지 않습니다.  많은 비보에 연구, 인간 연구, 본질적인 microbiota12변경 내용을 감지 하 배설물 샘플의 분석에 의존 합니다. 그러나이 유익, GIT에서 본질적인 microbiota에 데이터를 제공 하지 않습니다 그것과 luminal 및 점 막 커뮤니티5,6,,78을 구분 하지 않습니다.

본질적인 microbiota 포유류 구성 요소에서 간섭 없이 세균성 지역 사회의 역학을 공부 하는 체 외에서 방법의 응용 프로그램이 필요 합니다. 생체 외에서 메서드를 사용 하 여 환경 조건10, 동시에 여러 개의 매개 변수 테스트 및 경도, 샘플 수의 꽉 컨트롤 큰 볼륨11에 대 한 수 있습니다. 때문에 생체 외에서 메서드 사용 기계 장치 및 호스트 하지, 아니 고려 나이, 환경, 다이어트, 또는 유전 배경 필요 하다. 이러한 시스템 전체 본질적인 microbiota 커뮤니티 테스트를 사용할 수 있는, 유기 체, 또는 심지어 단일 종자만 선택. 중요 한 것은, 생체 외에서 결과 재현할, 아직 vivo에서 연구11,22에 비해 다양성의 수준을 유지.

문제의 가설 및 원하는 결과 따라 in vitro 연구는 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다.  그들은 단일 선박 시스템 및 배설물 homogenate24 샘플 잠복기 또는 24-48 h25의 과정을 통해 단일 일괄 처리 문화 등 간단한 방법을 활용할 수 있습니다. 그들은 또한 단일 선박 시스템 및 생산 안정 창 자 미생물 커뮤니티11chemostat 시스템을 사용 하 여 더 복잡 한 메서드를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나, 단일 반응 기를 사용 하 여 지나치게 단순화할 수 microbiota12 만 콜론의 한 부분을 대표 하기 때문 결 가로, 오름차순, 내림차순 영역의 구성에 불구.

본질적인 microbiota 커뮤니티 콜론 (오름차순, 내림차순 가로, 지역)의 다른 지역에서 개발 하 고, 공부 하기 위하여 복잡 하 고 다단 시스템을 사용할 수 있습니다. 이러한 시스템에서 여러 용기 오름차순, 내림차순 가로, 지역의 본질적인 microbiota 독립적으로 재배 하지 않습니다 콜론의 다른 지구를 모방 하 설치 된다. 순서 대로 오름차순 내림차순 콜론 지역에 통과에서 기판 이동 펌프를 사용 하 여, GIT 통해 영양분의 흐름을 흉내 낸 이러한 혈관 연결 됩니다.

이 연구의 목적은 5 단계 생체 외에서 문화 시스템 ( 재료의 표참조) 사용 하는 방법을 본질적인 microbiota 커뮤니티 육성에 있고 안정성 및 구성 지역 사회 역학을 설명 했다. 이 시스템에서는, 한 그릇 위 나타내고 하나 소장을 나타냅니다. 결 각 지역26를 대표 하는 한 그릇으로 (가로 오름차순, 내림차순), 3 개의 지역으로 분할 된다. 이 실험적인 체제에서 두 개의 완전 한 시스템을 동시에 실행 했다, 단위 1 점 막 표면 및 아무 mucin 사업자를 포함 하는 단위 2 나타냅니다 mucin 캐리어를 포함 하. 각 지역의 luminal 및 점 막 단계에서 개발 커뮤니티 16S rRNA 유전자 시퀀싱 및 SCFA 분석을 사용 하 여 시간이 지남에 지저분한 inoculum을 서로 비교 했다. 제시 결과 커뮤니티, 구성 및 기능, 생체 시스템의이 종류에서 생성 될 수 있다 둘 다의 종류를 보여 줍니다.

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프로토콜

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1. 재료 및 준비

참고: 정의 된 중간 파우더로 구입 ( 재료의 표참조). G/L에서 정의 된 매체의 구성은 다음: 포도 당 (0.4), 효 모 추출 물 (3.0), 특별 한 펩 (1.0), Mucin (2.0), L-시스테인-HCl (0.2), Xylan (0.5), 펙 틴 (2.0), Arabinogalactan (1.2).

  1. 정의 된 매체 준비
    1. 두 배 증류수, 이온을 제거 된 물 2 l 4 L 플라스 크를 채우십시오.
    2. 정의 된 중간 분말의 29.2 g 물에 추가 하 고 혼합 단위 완전 한 무 균.
    3. 자기 활동가 추가 하 고 느슨하게 뚜껑에 나사.
    4. 30 분 동안 121 ° C에 고압입니다.
    5. 냉각 후, 일정 한 동요 (자력)와 4 ° C에서 냉장고에 준비 된 정의 된 매체를 저장 합니다.
  2. 췌 장 주스를 준비
    1. 압력솥 추가 활동가 바와 5 리터 용기에 증류수, 이온을 제거 된 물 2 L, 30 분 동안 121 ° C에서.
    2. 압력가 마로 소독, 후 실내 온도에 냉각 하 물 허용.
    3. 12.5 g NaHCO3, 6 g 담 즙 및 0.9 g pancreatin를 추가 합니다. 혼합 자력에 놓습니다.
      참고: 췌 장 주스 2-3 일 마다 신선한 준비 하 고 그것을 만든 후 동요와 함께 냉장 해야 합니다.
  3. 인산 염 버퍼
    1. 장소는 자력에 자력 bar가 포함 된 1 L 플라스 크. 증류수, 이온을 제거 된 물 0.5 L을 추가 하 고 동요를 켭니다.
    2. 다음, 6.8 g KH2포4, 8.8 g K2HPO4, 그리고 0.1 g 나트륨 thioglycolate를 추가 합니다. 물 1 l.의 최종 볼륨을 위로합니다
    3. 구성 요소는 완전히 해산 후 NaOH를 사용 하 여 7.0에 pH를 조정 합니다.
    4. 느슨하게 그리고 단단히 폐쇄 하는 스크류 캡 뚜껑 및 뚜껑에 망 30 분 확인 위한 121 ° C에서 압력솥 2 L 용기로 한 버퍼를 붓는 다.
    5. 오토 클레이 브에서 제거한 후 실내 온도에 냉각 솔루션을 수 있습니다. 2까지 주 동안 실내 온도에 버퍼를 저장 합니다.
  4. 준비 하는 Mucin agar 캐리어
    1. 압력솥 플라스틱 mucin 사업자 ( 재료의 표참조), 집게, 플라스틱 메쉬 (관 모양), 그리고 30 분 131 ° C에서 우편 넥타이.
    2. 압력솥의 더블 300 mL 소 주, 드 이온 수 131 ° C 실 온에서 30 분이 게에서 사용까지.
    3. Biosafety 층 류 캐비닛에 접시 살 균 소독 집게를 사용 하 여 플라스틱 mucin 사업자 채워 놓습니다.
      참고: Mucin 캐리어는 mucin agar로 채워지는 빈 플라스틱 원. 뚜껑 위에 놓일 수 있다, 일단 고이 따로 있습니다.
    4. Mucin agar를 준비 하려면 3g 세균성 agar의 돼지 mucin의 15 g 압력가 물 300 mL를 추가 합니다.
    5. 증기 두건에서이 솔루션을 끓여 야 다음 열 소스에서 제거 하 고 끓는 및 총 3 번에 대 한 냉각을 반복 하는 1 분에 대 한 시원한 수 있습니다.
    6. 일단 mucin agar 솔루션을 포함 하는 유리 그릇을 만지고 충분히 멋지다, biosafety 층 류 캐비닛으로 이동 합니다.
    7. 층 류 캐비닛 biosafety에 액체 mucin agar 배양 접시에 배치 했다 플라스틱 mucin 사업자 붓는 다. 모든 항공사 mucin agar와 완전히 가득 확인 합니다.
    8. 페 트리 접시에 다시 뚜껑을 배치 하 고 층 류 아래 시원한 수 있도록.
    9. Mucin 운반대를, 압력가 플라스틱 그물에 걸릴 하 고 소독 집게를 사용 하 여 배양 접시에서 응고 mucin agar를 포함 하는 mucin 사업자를 삽입 합니다.
    10. 우편 넥타이 사용 하 여 메시의 끝을. 이런식으로 mucin 사업자를 포함 하도록 net 기능 mucin agar 가득 합니다. 사용 될 때까지 4 ° C에서 저장 합니다.

2. 설정, 접종, 그리고 시스템의 실행

  1. 자란 시스템의 설정
    참고:     인간 장내 미생물 생태계의 트윈 시뮬레이터가이 연구를 위해 사용 되었다.
    1. 장소 10 생물 반응 기 교 반기 자석 교 반기에 막대를 포함 하 고 동요를 켭니다.
      참고: 각 단위는 2 대 10 bioreactors 필요 합니다 5 bioreactors의 구성 됩니다.
    2. 5 bioreactors 실리콘 튜브 연동 펌프 (그림 1)의 방법으로 순서 대로 사용 하 여 서로 연결 합니다. 사용 하 여 가로를 펌프 유체 내용을 한 생물에서 다음.
    3. 다음 순서로 bioreactors 라벨: 위, 소장, 오름차순 콜론, 가로 장, 위장의 순서를 나타내는 콜론 내림차순.
      참고: 생물 반응 기 모두 수 동일, 또는 위장과 소장 bioreactors 비교 될 수 있다 작은 콜론 bioreactors 이후 그들은 더 적은 볼륨을 개최 한다. 이 방법으로 bioreactors 설정 의미 오름차순 콜론 지역 소장에서 영양분을 받고, 가로 콜론 지역 오름차순 콜론 지역에서 양분을 받는 내림차순 콜론 지역 수신에서 영양분은 가로 영역입니다. 이 방법으로 시스템은 위장 기관을 통해 양분의 순차적 움직임 흉내 낸.
    4. 자석 교 반기를 사용 하 여 일정 한 동요와 4 ° C에서 냉장고에 정의 된 매체 및 췌 장 주스를 두십시오. 실리콘 튜브를 사용 하 여 정의 된 매체 연동 펌프를 통해 위 생물 하 고 연결 췌 장 주스 연동 펌프를 통해 소장 하.
    5. 소변 배수 가방에 응고 에이전트를 추가 합니다. 연동 펌프를 통해 소변 배수 가방에 하강 콜론을 연결 합니다. 폐기는 응고의 실험 기간 동안 생물학 낭비로.
    6. 실리콘 튜브를 사용 하 여, 순서 대로, 각 선박의 물 재킷 고 회람 물 목욕을 각 끝을 연결. 증류수 (이 금액은 회람 물 목욕 사용의 유형에 따라 달라 집니다)와 37 ° c.로 설정 회람 물 목욕을 채우십시오
    7. 실리콘 튜브를 사용 하 여, 산과 기본 연동 펌프를 통해 각 그릇의 뚜껑을 연결 합니다. 권장된 농도 0.5 M HCl 0.5 M NaOH.
    8. 뚜껑에 지정 된 포트를 통해 각 선박에 pH 프로브를 삽입 합니다. 이 포트는 pH 프로브와 나사 뚜껑 (그림 1)에 설계 되었습니다. 각 지역에 대 한 pH를 다음과 같이 설정: 위, pH = 2; 소장, pH 6.7-6.9; = 오름차순 콜론, pH = 5.6-5.9; 가로 결 장, pH = 6.15-6.4; 하강 콜론, pH = 6.6 6.9.
      참고: 초기 단계는 지역 사회 지역 pH 값에 차이에 따라 차별화 됩니다. 그러나, 일단 먹이 주기 시작, 지역 사회 더 영양 입력의 차이에 따라 성숙 됩니다.
    9. 지정 된 포트를 사용 하 여 각 그릇의 뚜껑에 실리콘 튜브를 사용 하 여 질소 선을 연결 합니다. 질소 선 다음 순서로 흐름 해야: 가로 콜론 콜론 내림차순, 오름차순 콜론, 소장, 위장. 각 단위는 그것의 자신의 flush 상호 오염 방지를 확인 합니다.
      참고: 질소는 시스템에서 제거 된 산소를 사용 하 고 실험 기간 동안 anaerobiosis를 유지 합니다.
    10. 지정 된 포트를 사용 하 여 각 생물의 뚜껑을 통해 금속 샘플 튜브를 삽입 합니다. 금속 튜브는 생물에 아래로 확장 하 고 액체 샘플을 수집 하는 데 사용 됩니다.
    11. 샘플 튜브의 맨 끝에 실리콘 튜브의 작은 조각을 추가 하 고 허용 하기 위해 주사기를 사용 하 여 샘플링 동안 Luer 잠금 연결.
  2. 시스템의 접종
    1. 다음 볼륨을 사용 하 여 정의 된 매체와 콜론 영역 채우기: 오름차순 콜론에 500 mL, 가로 결에서 800 mL 및 하강 콜론에서 600 mL.
    2. 원자로의 볼륨에 비례 금액에서 콜론 지역에 mucin agar 사업자를 추가 합니다. 이 실험에 대 한 반응 기 당 60 캐리어 사용 되었다.
    3. 이후는 생물 반응 기에 있는 액체의 수준을 제기 사업자 추가 샘플 튜브와 주사기를 사용 하 여 모든 초과 정의 된 매체를 제거 합니다.
    4. 컴퓨터를 사용 하 여 각 반응 기에 pH를 조정 하는 pH 프로브를 켭니다.
    5. 20 분 동안 질소 플러시를 켭니다.
      참고: 분 변 homogenate 접종에 대 한 사용은 10% 글리세롤 용액에 무 균 10% 배설물으로 구입 ( 재료의 표참조). 분 변 샘플은 다음과 같은 기준으로 기증자의 수영장에서 무작위로 선정: 미국 무료는 평균 체 질량 지 수 (18.5-24.9)와 1 년 이상에 대 한 전형적인 서쪽 규정식 (철저 한 채식주의자 또는 채식주의), 21-45 세 나이, 항생제의 소비 . 이 프로토콜에 대 한 하나의 기증자만 사용 됩니다. 그러나,이 실험 설계 변경 될 수 있습니다.
    6. 이전에 접종, 제조업체의 지침에 따라 지저분한 homogenate 녹여.
    7. 5% (25 mL 오름차순 콜론, 가로 콜론 내림차순 콜론에 대 한 30 mL 40 mL에 대 한) 60 mL 주사기를 사용 하 여 샘플 포트를 통해 원자로 볼륨의 동일한 금액에서 배설물 homogenate를 추가 하 여 각 콜론 원자로 예방.
    8. PH 제어와 하룻밤 bioreactors에서 문화를 성장.
    9. 밤새 성장 후 각 콜론 지역 아래 섹션 3에서에서 luminal 액체의 샘플을 수확. 샘플링을 완료 후 수 유 하려면 컴퓨터 프로그램 설정.
  3. 매일 먹이 주기
    참고:     매일 먹이 주기는 자동 컴퓨터.
    1. 하루에 세 번 위 생물에 정의 된 매체의 140 mL를 펌프 하 고 1 시간에 대 한 품 어 수 있습니다.
    2. 1 h 부 화 후 소장으로 복 부의 내용을 펌프. 동시에 소장으로 췌 장 주스의 60 mL를 펌프.
    3. 작은 창 자에서 pH 6.7-6.9에 산도 조정에 바뀌고 90 분 동안 품 어 혼합물 허용. 부 화를 하는 동안 10 분의 총에 대 한 각 시스템에 대 한 질소 플러시를 켭니다.
    4. 90 분 부 화 후 오름차순 콜론, 가로 장, 폐기물을 내림차순 콜론 내림차순 콜론을 가로 콜론을 오름차순 콜론을 작은 창 자에서 펌프에 동시에 설정.
  4. 실험 일정
    참고:     는 길이에서 약 8 주 동안 지속적인 패션 여기 사용 하는 생체 외에서 시스템 운영. 그러나 아래 권장된 실험 일정은,,이 요구 사항 및 실험의 목적에 따라 수정할 수 있습니다.
    1. 다음 단계는 단계 2.1에에서 나열 된 시스템을 설정 합니다.
    2. 하룻밤 성장 아래 프로토콜을 다음에서 베스트 샘플. 매일 주기, 먹이 하루에 세 번 다음 위의 프로토콜을 시작 합니다.
    3. 총 안정화에 박테리아 수 있도록 2 주에 대 한 실험을 실행 합니다.
      참고: 시스템 실행 의미 pH 유지, 매일 먹이 주기는 하루에 세 번 다음 점 막 사업자 각 2-3 시간 변경 됩니다 주.
    4. 안정화, 후 제어 기간으로 2 주 동안 실험을 실행 합니다.
    5. 제어 기간 후 다른 구성 요소 또는 치료 기간으로 알려진 변수를 테스트 하는 시스템을 사용 합니다.
    6. 치료 기간 후 추가 구성 요소 또는 변수를 중지 하 고 조건 정상으로 반환 합니다. 이 워시 아웃 기간 간주 되며 사회 변화는 영구 여부를 결정 하는 데 사용.

3. 샘플 시스템에서 수확

참고: 실험 기간 동안 샘플 수확 수 있습니다 언제 든 지, 어떤 영역의 luminal 또는 점 막 단계에서 다음에 지침 아래.

  1. 수확 luminal 샘플
    1. 문화 액체의 중간에 확장 샘플 포트를 통해 luminal 액체 샘플을 수확. 70% 에탄올 또는 작은 알코올 패드 샘플 포트에 Luer 잠금 청소 하 여 시작 하 고 건조를 허용 합니다.
    2. 모든 공기 30 mL 주사기에서 제거 됩니다 확인 하 고 샘플 포트에 연결. 그리기를 위아래로 3-5 회 선박 부품의 적절 한 혼합을 보장. 후, 문화의 30 mL의 총을 그립니다.
    3. 약 수로 luminal 샘플 메 마른 팔 콘 튜브와 얼음에 저장소에 필요한. 샘플링 완료-80 ° C 냉동 고에 전송 합니다.
    4. SCFA 분석용 luminal 샘플의 15 mL는 4 ° C, 10 분 동안 5000 x g 에서 회전 된다. 상쾌한 주사기 PES 0.2 μ M 필터를 사용 하 여 필터링입니다. -80 ° c.에 필터링 된 상쾌한 저장
      1. DNA 분석, 스핀 4 ° C에서 luminal 액체의 1 mL, 10 분에 대 한 5000 x g 는 상쾌한 삭제 하 고-80 ° c.에 펠 릿을 저장
      2. 백업으로 대부분 실험-80 ° C에서 luminal 액체의 10 mL를 저장 합니다.
  2. 점 막 샘플 채취
    참고:     변경 점 막 사업자 마다 2-3 일.
    1. 제거 하 고 냉장고에서 준비 mucin 운반대 밖으로 내 보일.
    2. 질소 플러시를 켜고 신속 하 게 원자로 뚜껑을 엽니다. Mucin 사업자의 50%를 제거 하 고 새로운 것 들을 추가.
    3. 신속 하 게 뚜껑을 밀봉 하 고 또 다른 20 분에 대 한 플러시에 질소를 유지.
    4. DNA 추출, aliquot 0.25-0.5 g 2 mL 튜브에 agar의-80 ° C까지 필요에 저장.

4. DNA 추출, 시퀀싱, 및 분석

참고: DNA는 연기 후드29물리적 균질와 CTAB DNA 추출 방법을 사용 하 여 추출 됩니다. 추출, 다음 한 분 광 광도 계는 각 샘플에서 DNA의 양을 계량 하는 데 사용 됩니다.

  1. 준비 하는 CTAB 버퍼
    1. 4.2 g K2HPO4 와 4.09 g NaCl 이온, 증 류 물, 다음 30 분 동안 121 ° C에 고압의 200 mL에 용 해.
    2. 실내 온도에 냉각 솔루션을 수 있습니다.
    3. 동요와 60 ° C에 Hexadecyltrimethylammonium 브 로마 이드 (CTAB)와 열 10 g를 추가 합니다.
    4. 모든 CTAB 해산 후 실내 온도에 열과 멋진 솔루션을 제거 합니다.
  2. 못-6000 솔루션 준비
    1. 폴 리 에틸렌 글리콜 6000 및 93.5 g 이온, 증 류 된 물 1 L에 NaCl의 300 g을 분해.
    2. 후에 모든 입자는 해산, 압력솥 30 분 동안 121 ° C에서 솔루션.
    3. 압력가 마로 소독, 후 솔루션을 사용 하기 전에 실내 온도에 냉각 한다.
  3. DNA 추출
    1. 2 mL 샘플 튜브를 균질을 소용돌이 CTAB 버퍼의 500 μ와 페 놀-클로 프롬-Isoamyl 알콜의 500 μ를 추가 합니다.
    2. 0.1 m m 물리적 조직 관 ( 재료의 표참조)을 샘플 튜브의 전체 내용을 전송 합니다.
    3. 균질 20 튜브는 가장 높은 설정 두 번, 물리적 균질 화기를 사용 하 여 사이 20 s 일시 중지와 함께 s ( 재료의 표참조).
    4. 5 분 동안 3000 x g 에서 무 균된 튜브 원심
    5. 깨끗 한, 1.7 mL 튜브에는 상쾌한의 300 μ를 전송 하 고 추가 500 μ CTAB 버퍼의 원래 튜브.
    6. 다시 방법을 사용 하 여는 단계 4.3.2-4.3.3와 원심 분리기 3000 x g 에서 5 분이이 튜브 균질
    7. 원심, 후 지금 600 μ를 포함 하는 새로운 튜브에 상쾌한의 또 다른 300 μ를 전송.
    8. 600 μ는 상쾌한의 포함 된 튜브에 600 μ 클로 프롬 Isoamyl 알콜의 총을 추가 합니다.
    9. 혼합, 및 다음 짧게 원심 튜브 반전. 깨끗 한 1.7 mL 튜브에 상위 단계의 500 μ를 전송. 최고 단계만을 확인 합니다.
    10. 다음, 추가 말뚝-6000 솔루션의 1000 μ, 혼합, 및 다음 2 시간에 대 한 실 온에서 품 어 튜브 반전.
    11. 부 화, 후 원심 18200 x g, 4 ° C, 10 분에 관.
    12. 삭제는 상쾌한 고 얼음 차가운 70% 에탄올과 펠 릿을 청소.
    13. 10 분 삭제는 상쾌한 고 수 층 류에서 biosafety 내각을 펠 릿 18200 x g, 4 ° C에서 다시 튜브를 원심.
    14. 펠 릿 건조 후 각 튜브를 무료 RNAse, DNAse 무료, 메 마른 물 75 μ를 추가 합니다.
    15. Resuspended DNA는 분 광 광도 계에 의해 측정 하 고 16S rRNA 유전자 시퀀싱에 대 한 그것을 밖으로 보낼.

5. 짧은 사슬 지방산 (SCFA) 탐지 및 분석

  1. 30 분 동안 40 ° C에서 냉동된 샘플을 해 동 하 고 2:1 (v: v) 비율로 diethyl 에테르를 사용 하 여 짧은 사슬 지방산을 추출.
  2. 전송 열, 30 m, 0.25 m m를 장착 하는 GC/MS ( 재료의 표참조)을 유기 단계 ID, 0.25 µ m ( 재료의 표참조) 10 µ L 주입 됩니다.
  3. 주입 포트 온도 및 설정 초기 열 온도 260 ° C 및 125 ° C에 각각. 1 분에 대 한 초기 온도 누른 다음 250 ° C, 1 mL/min의 열 유량과 11.5 분 이상이 증가 합니다.
    참고: 이온 소스에 대 한 MS 온도 220 ° C, 250 ° C 인터페이스에 대 한.
  4. 내부 표준으로 표준 곡선 및 2 methylhexanoic 산을 사용 하 여 각 SCFA의 양을 계량.

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결과

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위의 프로토콜 설정을, 접종, 그리고 콜론의 본질적인 microbiota 공부 5 단계 생체 시스템의 실행에 설명 합니다. DNA 추출, 다음 아래, 데이터를 생성 하 V1V2 지역의 16S rRNA 마커 유전자 DNA 시퀀싱 미생물 센터 아 이들의 병원에 (예:, MiSeq Illumina 플랫폼)을 시퀀싱 하는 높은 처리량을 사용 하 여 수행 했다 필라델피아27의 QIIME (양적 통찰력 미생물 생태학) 버전 1.928 시퀀싱 데이터를 처리 하는 데 사용 했다 하 고 통계 분석 통계 컴퓨팅29R 환경에서 수행 되었다. 분류학 할당 Greengenes 16 참조 데이터베이스30,31를 사용 하 여 생성 되었다. OTU 관계...

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토론

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생체 외에서 자란 시스템 장의 본질적인 microbiota 연구 개발 되었습니다. 그들은 콜론33의 각 지역에 대 한 성숙한 본질적인 미생물 커뮤니티의 성장을 촉진 위장 장 관의 생리 상태를 시뮬레이션 하도록 설계 된 기구를 사용 합니다. 개념은 논리적이 고 이해할 수 있는, 본질적인 microbiota 공부를 생체 외에서 자란 시스템의 실제 실행 정밀 이해와 무엇을 요구 하 고 신뢰할 수 있는 결과 생산할 것으로 예상 합니다.

생체 외에서 본질적인 microbiota 실험에 대 한 필수 요소는 지역 사회 접종 후 안정성을 도달 해야 하 고 지저분한 inoculum의 미생물 다양성을 유지 해야 합니다. 실험 제대로 실행 하는 경우이 두 개의 필수 요소는 쉽게 하 고 예상 대로 달성 된다. 시스템의 안정성과 다양성에 영향을 미칠 것입니다 프로토콜의 중요 한 단계는 다음: 정의 된 매체와 췌 장 주스의 준비, 정확 해야 합니다 및 배달이이 ...

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공개 사항

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저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다. 상호 또는이 간행물에서 상용 제품의 언급만을 목적으로 특정 정보를 제공 하 고 미국 농 무부에 의해 승인 또는 추천을 의미 하지는 않습니다. 미국 농 무부는 평등한 기회 제공 및 고용주입니다.

감사의 글

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양 오드리 토마스 Gahring 그녀의 GC/MS 작동에 대 한 인정 이다. 우리 또한 마시모 Marzorati 원고를 편집 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
TWINSHIMEProdigestNA
정의 배지 (전분을 함유 한 성인 M-SHIME 성장 배지)ProdigestNA
Masterflex 튜빙콜 파머NA
소변 배액 백BardNA
NA
대변 샘플OpenbiomeNA
주사기Becton DicksonNA
정의 매체프로 다이제NA
Oxgall 담즙Becton 딕슨NA
췌장, 시그마 - 알드리치NA
유리 제품에이스 유리NA
돼지 뮤신시그마 - 알드리치NA
세균 한천Sigma-AldrichNA
살균 파우치VWRNA
BeadBugBenchmark ScientificNA
Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1 mm Bead beater tubeBenchmark ScientificNA
RNAse free, DNAse free, sterile waterRocheNA
Shimadzu QP2010 Ultra GC/MSShimadzu
Stabilwax-DA 컬럼, 30m, 0.25mm ID, 0.25 &마이크로; mRestekNA
플라스틱 뮤신 캐리어ProdigestNA
Labsorb Sigma-Aldrich 스트 틴NA

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).
  2. Xu, J., Gordon, J. Honor thy symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).
  3. Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. Role of the normal gut microbiota. World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).
  4. Macfarlane, G., Macfarlane, S. Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut. Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).
  5. McDonald, J., et al. Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).
  6. Van den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model. NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016(2016).
  7. Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept. FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).
  8. Van den Abbeele, P., et al. Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli. Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).
  9. Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. Gut microbiome-host interactions in health and disease. Genome Medicine. 3 (3), 14(2011).
  10. Wissenbach, D., et al. Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems. International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).
  11. McDonald, J., et al. Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model. Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).
  12. Venema, K., van den Abbeele, P. Experimental models of the gut microbiome. Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).
  13. Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).
  14. Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides. Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).
  15. Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota. Zebrafish. 00 (00), (2017).
  16. Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats. Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).
  17. Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  18. Hale, V., et al. Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species. Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).
  19. Lu, D., et al. Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth. Microbiome. 6 (1), 4(2018).
  20. Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling. Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).
  21. Muegge, B., et al. Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans. Science. 332 (6032), 970-974 (2011).
  22. Santiago-Rodriguez, T., et al. Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces. Microbiome. 9 (3), 58(2015).
  23. Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).
  24. Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract. Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).
  25. Cueva, C., et al. In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites. FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).
  26. Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem. Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).
  27. Wang, M., et al. Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus. Molecules. 22 (8), (2017).
  28. Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  29. Edgar, R. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
  30. Cole, J., et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).
  31. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).
  32. Liu, L. S., et al. Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator. PLoS ONE. 13 (7), e0197692(2018).
  33. Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M. Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME ®). The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. Verhoeckx, K., et al. , Springer Link. (2015).
  34. Van den Abbeele, P., et al. Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model. The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).
  35. Possemiers, S., Verthé, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem. FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).
  36. Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. The role of short-chain fatty acids in health and disease. Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).
  37. Yang, J., Kweon, M. The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases. BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).
  38. Sonnenburg, J., Bäckhed, F. Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism. Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).

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