감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

박테리아는 차동 적응과 생존에 필요한 유전자를 표현 하 여 생리 적 조건 및 그들의 환경에의 영양 상태에 변경 변경에 응답 합니다. 예를 들어, 기회 주의 병원 체는 몸 표면에 상대적으로 낮은 밀도, 그리고 자주 무해 한 식민지. 그러나, 박테리아는 물리적, 화학적 장벽을 침투 하 고, 일단 그것은 호스트 면역 세포 카운터 방어와 제한 된 양분 가용성¹맞설 까 해야 합니다. 예를 들어, 황색 포도상구균 인구의 약 1/3를 asymptomatically colonizes 하지만 치명적인 피부 및 연 조직 감염, 도왔습니다, 심장 내 막 염, 그리고 bacteremia²의 원인입니다. S. 구 균 병원 체로 서의 성공은 종종 대사 유연성 뿐만 아니라 혈 류를 탈출 하 고 주변 조직 ^{에서에서 복제에 박테리아 수 있도록 표면에 연결 하 고 분 비 독성 요인의 특성을 사용합니다 3,,45}. 호스트 죽음 포도 질병 때문 이며 진화 막다른 한계 전송 새 호스트⁶, 때문에 독성 요소 생산 하겠다는 신중 하 게 제어 해야 합니다.

밀도, 성장 단계, neutrophil 관련 요인, 및 독성 유전자가에 표현 되도록 양분 가용성 단백질 및 비 코딩 RNAs 응답 다양 한 환경 자극의 복잡 한 규제 네트워크, 세포 등에서 정확한 시간과 위치 호스트 조직^{7,8,9,10,11,,1213}. 예를 들어, SaeR/S 두 구성 요소 시스템 (TCS) 조절 센서 키 (SaeS)와 응답 레 귤 레이 터 (SaeR)¹⁴를 통해 여러 독성 요인의 표현. SaeS는 호스트 신호 (예:, 인간 호 중구 펩 티 드 [HNPs] calprotectin)^8,,1516응답에서 보존된 히스티딘 잔류물에 autophosphorylated입니다. Phosphoryl 그룹은 다음 aspartate 잔류물에 전송 SaeR, DNA 묶는 단백질으로 활성화 (SaeR ~ P)¹⁷. SaeR/S TCS fibronectin 의무적인 단백질 (FnBPs), coagulase^14,18,,1920, leukocidins, 등 병 인에 기여 하는 20 개 이상의 유전자를 통제 한다. 대상 SaeR의 수준으로 유발 확률이 높은 친 화력과 낮은 선호도 유전자 대상으로 분류 될 수 있다 ~ P 상승의 신호²¹에 노출 되 면. SaeR/S 활동 Agr 쿼럼 감지 시스템 같은 유전자 발현의 다른 레 귤 레이 터, 독 소 단백질 (썩 음), 그리고 대체 시그마 요인 B (SigB)^22,,2324의 진압에 의해 제어 됩니다.

nuc 황색 포도상구균 에 성폭력 종속 독성 유전자 이며 neutrophilic extracellular t비난 (그물)에서 탈출 한 동안 보급을 위한 필수적 이다 thermonuclease (Nuc)를 인코딩하는 감염^25,26의 과정. Nuc 의 식은 강하게 직접 측 쇄 사슬 아미노산, GTP²⁷, 존재 코디에 의해 하지 억압 이며 직접 포도 액세서리 레 귤 레이 터 단백질 사라^{28,29에 의해 억압} , 그의 활동이 산소 (산화 환 원 상태)와 산도³⁰에 의해 좌우 된다. 성폭력 및 nuc 돌연변이 감염 마우스 모델에서 감쇠는, 그에 주어진 그들의 해당 활동^26,31을 억제 하는 화학 개입 개발에 관심이 있다. 그럼에도 불구 하 고, 감염 시 그들의 규제에 관한 어떠한 정보도가 있다.

형광 기자 모니터링 하 고 단일 세포 수준에서 유전자 발현을 정량 사용 되었습니다. 여기, 우리는 S를 측정 하는 방법 제시. 감염 시 균 유전자 발현,와 결합 될 때 체 외 transcriptome 분석 및 자기 공명 영상 (MRI) 및 자기 공명 음 분광학 (MRS) 같은 강력한 이미징 기술을 계시 할 수 있다 어떻게 세균 생리학은 vivo 및 특정 틈새에서 영양소의 상대적 나타났는데에서 통제 된다. 메서드는 그러므로 유전 시스템과 어떤 세균성 병원 체에 적용할 수 있습니다.

게놈 통합 벡터의 개요입니다.

게놈 통합 벡터 pRB4 500 기본 쌍 각 동종 재결합을 촉진 하기 위하여 S. 구 균 USA300 SAUSA300_0087 pseudogene의 상류와 하류 지역에서 포함 되어 있습니다. pRB4는 리스로 마이 신 저항 카세트 (ermC)와 recombinants³²의 블루/화이트 심사에 대 한 내 베타-galactosidase 유전자 bgaB 를 포함 하는 온도 민감한 pMAD 벡터 등뼈에서 파생 됩니다. 조작된 기자 구문 또한 들어 페니 저항 마커 (고양이) 게놈 통합 및 플라스 미드 제거 뿐만 아니라 관심 superfolder 녹색 규제 영역을 융합 EcoRI와 SmaI 사이트 후 선택 형광 성 단백질 (sGFP) (그림 1). 그것은 알려져 그 리보솜 바인딩 사이트 (RBS)의 기자의 활동에 영향을 하며 종종 경험적 최적화³³. 따라서,는 RBS는 제공 되지. 여기, 네이티브 리보솜 바인딩 사이트는 유전자 발현의 좀 더 자연 스러운 패턴에 대 한 제공 하는 데 사용 됩니다 하지만 다른 사이트를 사용할 수 있습니다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 조지타운 대학에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. 형광 기자 스트레인의 발생

1. 게놈 통합 pRB4 벡터 순차적으로 EcoRI 및 SmaI 금지 효소로 소화. 제조 업체의 프로토콜을 따르고 25 ° C에서 1 µ g의 pRB4 사용 하 여 SmaI와 하룻밤 소화를 설정 하 고 37 ° C에서 1 시간에 대 한 두 번째 소화 EcoRI 반응 혼합물에 추가 하 여 진행. 20 분 동안 65 ° C에서 배양 하 여 효소 비활성화.
2. PCR 증폭의 genomic DNA에서 (이 경우는 ~ 350 기본적인 쌍 DNA 파편 포함 하는 thermonuclease [nuc] 발기인 지역), 규제 지역 5' EcoRI 금지 사이트와 3' SmaI 제한 사이트. SmaI 인식 시퀀스 프레임에 있어야 변환 시작 codon로. 이 연구에서 PCR 뇌관 앞으로 oRB015와 제조 업체의 권장 사항에 따라 높은 충실도 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 수행 되었다 (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') 및 뇌관 oRB016 (역 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). 어 닐 링 온도 53 ° c 이다. 제조업체의 지침에 따라 PCR 청소 키트를 사용 하 여 결과 조각 정화.
3. EcoRI와 SmaI 단계 1.1에서에서 수행 결과 PCR 제품을 소화 하 고 소화 DNA 파편을 사용 하 여 T4 DNA 리가 제조업체에서 권장 하는 대로 통합 구조를 생성 pRB4의 동일한 사이트에 선. 대장균 으로 결 찰 혼합물을 소개 하 고 구문을 시퀀스를 확인 합니다.
4. Electroporate S. 구 균 긴장 RN4220에 구조는 이전³⁴를 설명합니다. 간단히, 1 µ g의 플라스 미드를 사용 하 여 전기 유능한 세포의 70 µ L로 (100 Ω, 25 µ F, 및 2.3 kV) B2 국물 (1% [w/v] 카 제인의 2.5% [w/v] 효 모 추출 물, 2.5% [w/v] NaCl, 0.1% [w/v] K₂포₄, 0.5% [w/v] 포도 당). 에 리스로 마이 신 (5 µ g mL^-1)과 (X-여자; 80 µ g mL^-1) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside 보충 tryptic 간장 agar (TSA) 허용 온도 (30 ° C)에 리스로 마이 신 저항 (Em^r)을 선택 합니다. 결과 transformants는 플라스 미드로 인코딩된 β-galactosidase 활동으로 인해 블루.
   참고: 임상 분리로 DNA의 이동 때문에 강한 제한 수정 장벽³⁵매우 어렵습니다. 따라서, 그것은 부족 하 고 높은 변환 가능한 제한 때문에 S. 구 균 RN4220 퓨전 구문의 중간 받는 사람으로 사용 되었다.
5. S. 구 균 USA300 스트레인 electroporation 또는 살 균 소 중재 변환³⁶ 을 사용 하 여 허용 온도에서 관심사의 플라스 미드를 전송 합니다. 간단히, Φ₁₁ 살 균 소 입자 5mm CaCl₂ 를 포함 하는 TSA 격판덮개를 사용 하 여 기증자 스트레인에 30 ° C에서 하룻밤 그리고 다음 0.45 μ M 셀 루 로스 아세테이트 주사기 필터를 통해 여과 하 여 소독을 전파 합니다. 그들^r S. 구 균 긴장 락 transduce lysates 사용.
   참고: 락 널리 임상 분리 이전 Em 민감한 의해 만들어진 TSB 매체 수 여 Em^{r 37,38}네이티브 플라스 미드 pUSA03의 변형 치료에 직렬 통로 이다.
6. 앞에서 설명한³²염색체에 두, 연속 동종 재결합 이벤트에 구조를 통합. recombinants 페니, 리스로 마이 신은 취약 음 (^s), 및 더 이상 파랑의 페니-내성 (Cm^r)에 TSA 격판덮개 5 μ g m l^-1 를 포함 하는.
   참고: 가능 하면 다시 생체 외에서 스트레인 통로³⁹ 및 온도 교대와 관련 된 돌연변이의 축적을 피하기 위하여 변환 페이지 중재를 통해 USA300로 표시 된 퓨전 소개.

2. 동물 감염: 준비 Inoculum, 전신 감염, 및 조직 처리

1. 세균성 inoculum의 준비
   1. 냉동된 글리세롤 재고에서 혈액 한 천 배지에서 격리에 대 한 관심의 S. 구 균 종자를 행진. 적혈구 (Rbc) lyse 그들의 능력에 기반 하는 hemolytic 고기 확인 16-24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어와 양식 투명 영역 합니다.
   2. 메 마른 유리관에 tryptic 간장 국물 (TSB)의 4 mL를 각 스트레인의 단일 식민지를 접종 하 여 숙박 문화를 시작 합니다. 약 70 ° 각도와 [RPM] 분당 70 회전 설정 튜브 롤러에서 16-24 h에 대 한 37 ° C에서 튜브를 회전 합니다.
   3. 600에서 광학 밀도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 단계 2.1.2에서에서 문화의 nm (OD₆₀₀). 메 마른 매체를 사용 하 여 광학 참조 (빈)로. 0.05에서 25 ml의 멸 균 Tryptic 간장 국물 (TSB) 별도의 OD₆₀₀ 이 세포를 희석, 125 mL DeLong 플라스 크 (볼륨 비율 플라스 크 5:1) 및 (에 대 한 올바른 열 전달 문화), 물 목욕 문화를 품 어 280 RPM에서 진동 하 고 37 ° c.로 설정
      참고:는 inoculum의 성장; 다양 한 방법으로 수행할 수 있습니다. 지 수 단계 성장 하는 셀에 대 한 한 가지 방법은 제공 됩니다. 어쨌든, 그것은 지속적으로 동일한 메서드를 사용 하 여 접종에 대 한 셀을 준비 하는 것이 중요입니다.
   4. 세₆₀₀ ~ 1, 다시 시작 세₆₀₀ 세포 지 수 단계를 달성 하 고 야간 보육 동안 축적 요인 지 수 단계 수준으로 감소 되었습니다 0.05의 신선한 매체에 셀 희석.
   5. 실 온에서 10 분 동안 3000 x g 에서 centrifuging 여 지 수 단계 (OD₆₀₀ ~0.6–0.8) 세포를 수확.
   6. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4) x 살 균 1의 해당 볼륨에 두 번 알 약을 씻으십시오.
   7. 1 x 10⁸ 콜로 니 형성 단위 (CFUs) mL^-1 의 농도를 1 x PBS (pH 7.4)에 셀을 일시 중지 하거나 원하는 적합 실험.
      참고: 셀 크기와 모양의 스트레인-종속 변경 산란 속성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 세₆₀₀ 사이의 CFU mL^-1 관심의 각 변형에 대 한 관계를 결정 하는 것이 중요 하다 고, 궁극적으로 감염 복용량입니다.
2. 동물 및 세균 감염의 준비
   1. 정화 다이어트 아 인-93에 7 일 동안 마우스를 적응. 다이어트는 표준 마우스 차 우⁴⁰에 사용 되는 식물 기반 재료의 소비와 관련 된 조직 자동-형광을 줄이면서 적절 한 영양을 제공 하 공식화 했다.
      참고: 여성 C57/BL6 마우스 (6-8 주 이전) 여기에, 사용 된다 그러나 마우스 긴장과 섹스 연구에 따라 달라 집니다.
   2. 감염, 전에 미지근한 물으로 마우스 꼬리 혈관 같은데요.
   3. 생산 조직의 감염을 꼬리 정 맥을 통해 세균 inoculum의 100 µ L를 주입 하 여 동물을 감염. Cytometry 수행 하는 경우 초기 inoculum의 약 수를 저장 (섹션 4 참조).
   4. 동물을 매일 모니터링 하 고 검토 하 고 하나의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 모니터링 시스템을 사용 하 여 자신의 건강 상태를 평가.
   5. 원하는 기간에 대 한 진행에 감염을 수 있습니다. 여기, 실험 종료 3 일 후 감염입니다.
      참고: 이러한 조건 하에서 박테리아, 면역 세포^5,41의 동심 층으로 둘러싸여 있고 섬유 소 예금의 포도 농 공동체 농에 의하여 이루어져 있다.
3. 수확 하는 기관 및 조직 처리
   1. CO₂ 흡입 및 보조 방법으로 자 궁 경부 전위에 의해 동물 안락사 고 검 시를 수행 합니다.
   2. 신장 (오른쪽) 및 다른 중요 한 장기 (심장, 간, 폐, 비장)을 수확 하 고 10% [v] 버퍼링 말린을 포함 하는 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브로 전송. 이러한 장기 2.3.4 아래 단계를 계속 수행 하십시오.
   3. 살 균 2 mL 충격 방지 튜브 2 m m 실리 카 구슬의 1 mL 균 1 x PBS (pH 7.4) ~ 500 µ L을 포함 하는 왼쪽된 신장 전송. 4.2 단계로이 기관으로 진행 합니다.
   4. 2.3.2 부드러운 진동 또는 회전 24 시간 이상 하지만 이상의 48 시간 실 온에서 어둠 속에서 수정 단계에서 장기를 허용 합니다.
   5. 매체를 동결 명확한 조직에 장기를 포함 하 고 저장-80 ° c.에 조직
   6. 10 µ m 두께의 조각으로 cryostat, 조직 섹션을 사용 하 여.
   7. 어둠 속에서 20 분에 대 한 사전 청소, 충전 유리 슬라이드에 섹션을 건조, 하드 설치 매체와 함께 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 얼룩을 적용 하 고 coverslip 적용. 하룻밤 실 온에 탑재 된 슬라이드를 치료 하 고 장기 저장을 위한 4 ° C에 전송.

3. 레이저 스캐닝 Confocal 현미경 검사 법 및 이미지 처리

1. 사용 되 고 형광 기자에 대 한 적절 한 레이저를 사용 하 여 병 변을 찾을 수 마운트 슬라이드를 검사 합니다. 이 경우, 그린 (GFP), 레드 (tdTomato), 그리고 파랑 (DAPI) 형광 신호 사용 됩니다.
2. 개별 셀을 시각화에 대 한 적절 한 목표를 사용 하 여 이미지를 획득 (예를 들어, 일반적으로 20 x 또는 40 x 목표 사용 된다).
3. 공초점 이미지의 형광 강도 측정 합니다.
   1. 이미지 J에 confocal 이미지를 열고 제대로 병 변의 형광 신호를 시각화 하기 위해 밝기/대비를 조정 합니다.
   2. 관심, 그리고 임계 처리 옵션을 사용 하 여 영역을 정의 필요에 따라 하위 및 상위 형광 한계를 설정.
   3. 선택 하 여 중심을 정의 영역 → 평균 회색 값 → 중심 → 임계값 제한 제이 이미지에서 분석 탭
   4. 중심 형광 강도 값을 추출 하거나 GFP와 tdTomato에 대 한 단위 지역 (의미 형광 강도, MFI) 당 주어진된 병 변에서 평균 형광 강도 측정 합니다. 여기, 1 µ m² 의 영역 사용 되었다.
      참고: 멀게 두 번째 분석 샘플의 정체성 알려져 때 바이어스를 최소화 합니다.
   5. 데이터를 플롯 하 고 각 비교에 대 한 적절 한 통계 분석을 수행.

4. 교류 Cytometry 분석

1. (선택 사항) (2.2.3 단원)에서 감염의 날에는 inoculum의 융합 활동을 결정
   1. 1 x 899 µ L를 살 균 PBS (pH 7.4) 100 µ L의 각 inoculum 추가 하 고 막 permeant 핵 산의 1 µ L 얼룩 ( 재료의 표참조). 컨트롤, 핵 산 얼룩 부족 샘플을 포함 해야 합니다.
   2. 모든 샘플에 cytometry를 수행 합니다.
      참고: 첫 실험에 대 한 사용 하 여 적절 한 전압을 결정 하는 관심의 융합에 대 한 벡터만 컨트롤을 포함 해야 유용 합니다. 긍정적이 고 부정적인 샘플 간의 구분이 분명 데이터 분석을 위해 필수적인 기자를 나타내는 이다 배경 신호 이상.
   3. 세균성 인구를 식별 하려면 핵 산 얼룩 (y 축)을 사용 하 여 이벤트를 플롯 하 고 분산형 (x 축)를 전달 합니다.
   4. 두 핵 산 얼룩 긍정적인 이벤트와 앞으로 분산형 ( S. 구 균에 대 한 0.5 ~ 2.0 µ m) 사이 따라 박테리아의 정확한 크기 포함 게이트를 그립니다.
      참고: 이러한 매개 변수에서 명확 하 게 이벤트를 포함 하는 것이 중요으로이 인구를 식별할 때 엄격한 수.입니다 이 게이트는 다른 조건 하에서 부정적인 컨트롤에 대 한 모든 이벤트를 제외 해야 합니다. 이 연구에서는 약 70%는 세포 인구 만난 분석에서 이러한 요구 사항을.
2. 희생 후 조직 샘플의 분석:
   1. 동물 안락사, 왼쪽된 신장 (2.3 단계 참조), 수확 및 비드 구타로 이동 관 포함 1 mL 균 PBS (pH 7.4) x 1 및 2 m m 붕 구슬의 250 µ L.
   2. 세균성 세포 출시 조직 방해. 신장 세포를 방해 하는 균질 화기를 사용 합니다. 여기, 냉각 기간 주기 사이 젖은 얼음에 1 분으로 6800 rpm에서 3 개의 30 s 파열 난방 샘플을 최소화 하기 위해 사용 되었다.
   3. 펠 릿 centrifuging 250 x g 탁상 microcentrifuge 3 분에 의해 더 큰 조직 파편 4 ° c.에 냉각
      참고: 일반적으로, 셀 펠 렛 튜브와 상단에 떠 있는 파편의 층의 밑에 있다. 중간의 수성 층 세균 셀을 포함합니다.
   4. PBS의 989 µ L에서 핵 산 얼룩의 1 µ L을 포함 하는 깨끗 한 1.5 mL microcentrifuge 관으로 수성 층에서 10 µ L를 전송 (전체 용량 1 mL).
   5. 동일한 데이터 수집 매개 변수를 사용 하 여 및 초기 inocula에 관해서는 게이팅 cytometry를 수행 합니다.
      참고: 세균성 세포 수 샘플은 주로 조직 파편을 포함 하기 때문에 매우 낮은 것입니다. "라이브 게이트" 옵션 세포는 핵 산 얼룩 긍정적이 고 크기 문이 데이터 응용 프로그램에 로드 되 면 경우에 사용할 수 있습니다. 이 또한 대상 이벤트의 더 분석 하 고 파일 크기를 줄일 데 도움이 됩니다. 샘플 당 거의 1 백만 이벤트 계산 됩니다, 하지만 더 많은 이벤트 카운트는 감염의 심각도 및 조직 분석의 크기에 따라 필요할 수 있습니다.
   6. 데이터 분석: 결정 각 fluorophore 섹션 4.1.4 결정 포함 게이트를 사용 하 여 주어진된 샘플에 대 한 형광 강도 (MFI)을 의미. 이벤트 카운트를 흐름 분석 소프트웨어에서 샘플을 정상화. 10000 카운트는 분석에서 일반적으로 충분 하다.
      참고: 이후이 농 양 형성, 감염의 심각도에 따라 이벤트의이 수 보다는 더 적은 포함 하는 샘플을 찾아내는 것은 드물지 않다. 이 접근, 500-40, 000를 사용 하 여 이벤트는 일반적으로 감염 된 조직에서 발견 된다.

우리는 어떤 기자를 제공할 수 있는 pMAD32 에서 파생 된 플라스 미드를 개발 더블 크로스 오버 동종 재결합 (그림 1)에 의해 염색체에 퓨전 구문. 이 구조는 GFP 단백질 생산 배경 위에 형광 신호를 지 원하는 어떤 규제 지역의 정량 분석에 대 한 수 있습니다. 플라스 미드 암 피 실린 저항 (Apr) 유지 보수 및 대장균 에서 전파에 대 한 수 여 하 고에 리스로 마이 신 저항 (Emr)를 수 여 S. 구 균. 구조는 페니 저항 (rCm), 정교한 유전자 분석에 대 한 다양 한 돌연변이 체 긴장 사이 기자는 통합된 융합의 쉽게 전송 허용에 또한 수 여 S. 구 균.

원리의 증거로 우리 융합 nuc gfp nuc 규제 지역 그것의 유전자 제품 전체 독성에 대 한 필요이 필요 농42, 유도에서 미 균-대 식 세포를 제한 때문에 선정 되었다 43. 구성은 프로토콜의 1.4-1.6 단계에 설명 된 대로 염색체에 통합 이었다. AH3926 PsarAP1-tdTomato 융합을 포함 하는 통합된 융합 다음 이송 됐다. 사라 P1 발기인 이전 constitutively 활성44 로 표시 되었습니다, 따라서, 모든 셀 라벨.

처음 기자 융해 했다 생체 외에서 동안 액티브 Tryptic 간장 국물 (TSB, 풍부 하 고 복잡 한 매체)에서 플라스 크 성장 동요 그리고 형광의 수준 세포 자동 형광 배경 (그림 2) 위에 확인 합니다. 형광 기자 vivo에서 동작 방법을 결정, 수정 된 신장 농 양 모델 사용된5이었다. 여성 C57BL/6 쥐의 그룹은 1 x 107 CFU S. 구 균 락 셀 기자 융해 부족 또는 nuc-sGFP 및 sarAp1 tdTomato 융해를 들고 락 셀의 각 정 맥 도전 했다. 동물 희생된 3 일 게시물 감염 했다입니다. 그런 다음 수확된 장기 10% [v] 버퍼링 포 르 말린에 고정 했다, cryo sectioned, 그리고 DAPI 얼룩 설명한 후 confocal 현미경 검사 법에 의해 이미지에서 단계 2와 3 (그림 3A, B). 신장 병 변에서 단위 면적 당 형광 측정 되었다와 이미지 이미지 J를 사용 하 여 분석 했다. 그림 3C에서처럼 nuc gfp 융해 형광 들고 안 들고 기자 퓨전; 셀 보다 융합 세포에 거의 9-fold 더 높은 평균에 있던 후자의 신호 검출 (자동-형광) (비교 sGFP 엔 유씨 락)도 구성합니다. 마찬가지로, PsarAP1-tdtomato 퓨전 형광 했다 ~ 접을 아니 기자 컨트롤 (그림 3E, sarAP1-tdT vs 락 비교) 보다 더 높은. Cytometry 사용 하 여, 기자 활동의 패턴 신장 homogenates를 사용 하 여 확인 및 flow cytometry 4 단계에 설명 된 대로, 비록 배 형광에 차이 (그림 3D, F) 낮은 했다.

흥미롭게도, 형광 기자 융해를 운반 하는 세포에 의해 형성 된 병 변에서 형광 데이터 부족 기자 보다 더 높은 변동성을 보여 등장. 우리 궁금 여부 관찰 형광 측정에서 변형 기자의 다른 유형의 표현으로 (즉, 생물학 근원의). 일부 병 변 중 하나 또는 둘 다 기자 (그림 4) 표현, ~ 100 µ m 거리 내에서 발견. 중요 한 것은, 강한 DAPI 얼룩, 아마 연관과 circumscribed 농에 nuc 식의 공간 조절 밝혀 단일 셀 해상도 포도 농 사회 (Sac)에서 기자 활동을 검사는 형성과 neutrophil 세포 외의 릴리스 트랩 (그림 5A-C)45. 예를 들어, 우리는 (그림 5B, E) 주변에 그와 비교 하는 골목의 내부 코어에 상당히 높은 nuc sGFP 퓨전 형광 측정. 같은 농 sarAp1 tdTomato 퓨전 형광 패턴 것으로 나타났다 (그림 5D) 거꾸로. 그러나, 패턴 (그림 5F) 동물의 동일한 수를 사용 하 여 통계적으로 중요 한 되지 않았습니다.

그림 1 : 게놈 통합 기자 플라스 미드 pRB4의 도식 대표. 플라스 미드 pRB4 S. 구 균 오 라 pE194 (ts)에 복제의 온도 중요 한 근원으로 pMAD의 파생입니다. 3 약물 저항 마커 있다: (i) 즐, 대장균;에서 암 피 실린에 저항을 부여 (ii) ermC, S. 구 균;에 리스로 마이 신 저항을 부여 그리고 (iii) 고양이, 페니 미 균에 저항을 부여. 기자 구조 ~ 500에 의해 형벌 이다 bp pseudogene SAUSA300_0087 의 업스트림 및 다운스트림 시퀀스에서 각 (게놈을 참조: FPR3757) 두 배 크로스 오버 동종 재결합 및 통합을 위한 게놈. sGFP, 녹색 형광 단백질 유전자; CS, 복제 사이트; TT, 강력한 양방향 transcriptional 종결자 그림은 규모. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 나 ntegrated nuc-sGFP 그리고 sarAp1-tdTomato 생체 외에서 성장 하는 동안 기자는 표현 . S. 구 균 락 셀 (야생-타입 [WT]), (A) nuc-sGFP 또는 (B) sarAp1 tdTomato 기자 없이) 고 다시 동일한 매체에 희석 TSB에 지 수 단계 성장 했다. 광학 밀도 (OD) 및 형광 표시 된 광학 밀도 값에 측정 되었다. 배경 빼기 형광 강도 값 (여기/방출: sGFP, 485/535 nm; tdTomato [tdT] 535/590 nm) 상대 형광 단위를 생성 하는 광학 밀도 값으로 분할 되었다. 데이터는 두 개의 독립적인 실험에서 SEM + 수단. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 형광 기자 신장 조직에서 볼 수 있습니다. 그룹 13 C57BL/6 마우스의 정 맥 락 셀 또는 락 셀 nuc sGFP 과 sarAp1-tdTomato (tdT), 도전 그리고 감염 3 일 동안 진행 하는 것이 허용 되었다. 마우스 했다 안락사 고 장기 2-프로토콜의 3 단계에 설명 된 대로 처리 했다. 여러 병 변 (A)에 대 한 관련 된 형광을 보여주는 대표적인 신장 섹션 엔 유씨-sGFP 및 (B) sarAp1-tdTomato. 스케일 바 = 250 µ m (10 x 목표). 단위 면적 (RFU [μ m2]-1) 연관 신장 병 변 당 상대 형광 단위 단계 3.3에에서 설명 된 대로 이미지 분석을 사용 하 여 측정 되었다와 대 한 표시 했다 (C) 엔 유씨-sGFP 및 (전자) sarAp1-tdTomato; 각 점 대표 한 병 변 및 막대 표시 중간; 3-5 병 변 마우스 당 분석입니다. Nuc-sGFP (D) (F) sarAp1 tdTomato 퓨전 형광 감염된 신장 homogenates 3 일 게시물 감염 으로부터 격리 하는 세균성 인구에의 교류 cytometry 분석. 말은 형광 강도 (MFI) 단단한 막대로 표시 되 고 각 점은 한 신장. 락, reporterless 야생-타입 스트레인 통계: 맨-휘트니 테스트; p < 0.05입니다. 데이터는 두 개의 독립적인 실험의 대표. 여기 파장 형광 채널은 다음과 같습니다: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. 데이터를 내보낸된 형광 파장의 범위 수집 된: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : 농 전시 신장 조직에서 기자 들의 가변 식. 13 C57BL/6 마우스의 그룹 1 x 107 CFU 꼬리 정 맥을 통해 미 균 세포의 도전 되었다. 동물 안락사 3 일 게시물 감염 했다입니다. 신장, 고정, 및 형광 현미경 검사 법 (40 x 목표)에 대 한 프로토콜의 2 단계에서 설명한 대로 sectioned 수확 했다. Nuc sGFP (A) (B) sarAp1 tdTomato 형광 변수 수준의 가까이에 3 개의 병 변은입니다. (C) 핵 산 포도 상 구 균 및 호스트에서 셀 표시 됩니다 DAPI 얼룩으로. 녹색과 빨강 채널은 (D)에 병합 됩니다. 유사한 결과 다른 섹션에서 본 했다. 이미지는 40 x 목표;를 사용 하 여 인수 했다 눈금 막대 25 µ m =. 여기 파장 형광 채널은 다음과 같습니다: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. 데이터를 내보낸된 형광 파장의 범위 수집 된: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 : nuc-sGFP 포도 농 마이크로-환경에서 규제 공간. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (CLSM) S. 구 균 긴장 락 들고 nuc-sGFP 및 sarAp1 tdTomato 기자 융해에 의해 생성 한 포도 농 양 커뮤니티 (SAC) 병 변의 이미지. (A)은 엔 유씨-sGFP 와 sarAp1-tdtomato, (B) nuc sGFP 형광 (녹색)에 대 한 채널을 병합 (C) DAPI 핵 산 (파란색), 및 (D) 의 얼룩 sarAp1-tdTomato 형광 (레드). 별표 표시 셀 코어 (중심)에 고 화살표는 주변에 있는 셀을 나타냅니다. 형광 강도 (E) nuc-sGFP 및 (F) sarAp1 tdTomato 셀 코어 및 SAC의 주변에 대 한 표시 됩니다. 여기 파장 형광 채널은 다음과 같습니다: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. 데이터를 내보낸된 형광 파장의 범위 수집 된: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm 데이터 (마우스 당 1 개), 8 신장에서 파생 되 고 1-2 병 변 각 신장에서 몇 군데 있었다. 막대 중간을 나타냅니다. 파선, 탐지의 한계입니다. 통계: 스튜던트 t-검정 (홀된), 데이터의 정규 분포 * * *p < 0.05. (눈금 막대 = 20 µ m; 모든 이미지에 적용 됩니다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.