방법 논문

플루오레세인 이소티오차네이트-폴리수크로오스 70을 가진 마우스에서 사구체 투과성의 고감도 측정

DOI:

10.3791/59064

⸱

2019년 8월 9일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서, 우리는 고과민성, 비방사성 추적자를 사용하여 마우스에 있는 사구체 투과성을 시험하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 작은 소변 볼륨을 가진 반복적인 소변 분석을 허용합니다.

초록

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소변에 있는 알부민의 손실 (알부민뇨) 심장 혈관 결과를 예측합니다. 생리적 조건하에서, 소량의 알부민은 사구체에 의해 여과되고 흡수 한계에 도달 할 때까지 관 시스템에서 재흡수됩니다. 병리학 적인 알부민의 초기 증가따라서, 알부민뇨증을 분석해서 놓칠 수 있습니다. 따라서 사구체 파면을 테스트하기 위해 트레이서를 사용하는 것이 유리해 보입니다. 형광 표지된 트레이서 플루오레세인 이소티오차네이트(FITC)-폴리수크로오스(즉, FITC-Ficoll)는 사구체 파면선택성을 연구하는데 사용될 수 있다. FITC-폴리수크로오스 분자는 사구체에 의해 자유롭게 여과되지만 관형 시스템에서 재흡수되지 는 않습니다. 마우스 및 래트에서 FITC-polysucrose는 기술적으로 복잡한 절차 (즉, 방사성 측정, 고성능 액체 크로마토그래피 [HPLC], 겔 여과)를 사용하여 사구체 투과성의 모델에서 조사되었습니다. 우리는 마우스에서 FITC-polysucrose 70 (알부민의 크기)에 사구 체 투과성의 초기 및 작은 증가를 테스트하기 위해 FITC-polysucrose 추적자 기반 프로토콜을 수정하고 촉진했습니다. 이 방법은 작은 소변 볼륨 (5 μL)을 가진 반복적인 소변 분석을 허용합니다. 이 프로토콜은 트레이서 FITC-polysucrose 70이 정맥내 적용되고 소변이 간단한 오줌 카테터를 통해 집합되는 방법에 대한 정보를 포함합니다. 소변은 형광 판 리더를 통해 분석하고 소변 농도 마커 (크레아티닌)로 정규화되어 기술적으로 복잡한 절차를 피합니다.

서론

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사구 여과 장벽 내의 기능적 또는 구조적 결함은 알부민에 사구체 투과성을 증가시켜 소변에서 알부민 (알부민뇨)을 검출합니다. 알부민뇨아는 심혈관 결과를 예측하고 사구체 부상에 대한 중요한 마커입니다1. 알부민뇨증의 낮은 수준조차도 정상 범위 내에 놓여있으며 심장 혈관 위험 증가와 관련이있습니다 1.

생리적 조건하에서, 알부민은 사구체를 통해 여과되고 관 계통2,3에서거의 완전히 재흡수됩니다. 마우스에서, 소변에 있는 알부민의 검출은 일반적으로 소변 수집의 24 시간에서 알부민 효소 연결된 면역 흡착 분석 (ELISA)에 의해 수행됩니다. 24 시간 소변 수집 또는 반점 소변에서 소변을 사용하는 경우, 알부민 농도의 작은 차이는 분석 감도 문제로 인해 놓칠 수 있습니다. 대부분의 연구원은, 그러므로, 독소, 약 및 신장 수술 때문에 강력한 신장 상해에 의해 알부민뇨가 유도되는 동물 모형을 이용합니다.

따라서 사구 체 투과성의 작고 일시적인 변화를 감지하는 민감한 방법의 발견은 현장에서 매우 중요합니다. Rippe 등은 알부민4의크기로 형광 표지 된 트레이서, 즉 FITC-폴리 수크로오스 70 (즉, FITC-Ficoll 70)을 적용하여 사구체 투과성을 테스트하는 랫트 모델을 제시했습니다. 추적 응용 프로그램은 사구 체 투과성의 단기 변화를 테스트 할 수 있습니다 (분 이내) 매우 민감한4. 2건의 연구에서는 마우스5,6에서트레이서 방법을 사용하였다. 그 이점에도 불구하고,이 방법은 불행히도 기술적으로 매우 복잡하고 방사능및 침습적이라는 단점이 있습니다. 소변의 추가 분석은 겔 여과 또는 크기 배제 HPLC5,6을사용하여 수행된다.

이 논문에서, 우리는 형광으로 표지된 FITC-polysucrose 70를 사용하여 마우스에 있는 사구 체 투과성을 측정하는 대안, 과민한, 비방사성 및 빠른 방법을 제시합니다. 요도 카테터를 도입함으로써, 소변 수집은 방광 천자, 요도 절제술 및 상피 카테터 적용보다 덜 침습적이며, 적어도 30 분마다 소변 수집을 허용합니다. 형광 플레이트 리더. 소변에 있는 추적자 농도효소 크레아티닌 분석술을 사용하여 소변에 있는 크레아티닌 농도로 정규화됩니다.

따라서, 이 새로운 방법은 증가 사구 체 투과성 초기 사구체 부상을 연구하는 민감한 도구를 제공합니다.

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프로토콜

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조사는 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 가이드에 설명된 지침에 따라 실시되었습니다 (미국 국립 보건원 제85-23호, 개정된 1996). 모든 동물 실험은 관련 기관 승인에 따라 수행되었다(주 정부 Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] 참조 번호 84-02.04.2012.A397).

1. 기기, 솔루션 및 장비 준비

  1. FITC-폴리수크로오스 70을 0.9% 멸균 염화나트륨(NaCl)으로 재구성하여 최종 농도10 mg/mL(즉, NaCl 10 mL에서 100 mg)으로 재구성합니다.
  2. 투석 FITC-폴리수크로오스 70 용액은 4°C에서 밤새 자유 FITC 분자를 제거한다(분자량 컷오프[MWCO]에서 10,000). FITC-폴리수크로오스 70의 10 mL당 0.9% 멸균 NaCl 1L을 일정한 교반 하에 사용하십시오. 빛으로부터 보호하십시오. 투석된 FITC-폴리수크로오스(70)를 알리쿼트하고 -20°C에 보관한다.
  3. FITC-폴리수크로오스 70 볼루스의 경우, 0.9% NaCl의 996 μL에 10 mg/mL FITC-폴리수크로오스 70 용액 4 μL을 추가합니다(FITC-폴리수크로오스 70: 40 μg/mL).
  4. 평형 주입 용액의 경우, 10 mg/mL FITC-폴리수크로오스 70 용액의 20 μL을 0.9% 멸균 NaCl의 9.98 mL에 추가하여 최종 농도20 μg/mL로 산출합니다.
  5. 실험 용액의 경우 주입 용액에 약물 이나 물질을 추가하십시오 (예를 들어, 25 g 마우스에 대한 안지오텐신 II [Ang II][100 ng/kg/min]의 경우, 1 mM 용액의 Ang II 의 3 μL을 추가하십시오).
  6. 수술의 경우 면도기 1개, 수술용 클램프 2개, 수술용 가위 1쌍, 핀셋 2개, 파인트셋 2개, 고급 가위 1쌍, 면봉 을 준비합니다. 결찰 절차를 위해 10cm 실크 실 2개(4-0~ 6-0)를 준비합니다.
  7. 중앙 정맥 카테터의 배치를 위해 21G 바늘로 10 mL 주사기를 준비하십시오. 바늘 끝을 30cm 길이의 카테터에 넣습니다(내경 [ID]는 0.58mm). 0.58mm 카테터를 10cm 카테터에 연결합니다(ID는 0.28mm). 작은 카테터 경사의 끝을 잘라 경정맥에 도입 된 날카로운 팁을 만듭니다.
  8. 마취를 준비하십시오 (즉, 복강 내 마취 케타민, 체중 100 mg / kg, 자일라진, 체중 5 mg / kg).
  9. 바늘을 버리고 팁에서 카테터를 1cm 표시하여 22 G angiocatheter를 준비합니다. 가열 패드를 37 °C로 예열합니다.
  10. 혈압 장치를 준비하고 필요한 경우 혈압 측정 막을 변경합니다.

2. 준비 단계

  1. 오줌 카테터
    참고: 섹션 2.1은 Reis et al.7에 설명된 프로토콜을 따릅니다. 도 1 및 보충도 1은 암컷 마우스에서 오줌 카테터의 배치를 나타낸다.
    1. 케타민/자일라진으로 마우스를 마취시다(1.8단계 참조). 발가락 핀치 테스트를 사용하여 적절한 마취를 확인하십시오. 마취를 유지하기 위해 60 분 후에 마취 (예 : 절반 복용량)를 반복하십시오. 발가락 핀치 테스트가 반사 인출을 초래하지 않으면 적절한 마취가 확인됩니다.
      참고: 암컷 FVB 마우스는 이 프로토콜에서 사용된다.
    2. 37°C 가열 패드에 등쪽 의 장황한 위치에 마우스를 놓습니다. 하복부를 조이고 요도 오슘 (예 : 현미경)을 찾습니다.
    3. 22 G angiocatheter의 카테터의 플라스틱 부분을 사용하고 실로카인 젤로 윤활하십시오. 원위 요도 축을 평행하면서 요도 오슘에 조심스럽게 3mm를도입하십시오 (그림 1A).
    4. 요도 오세움 내에 팁을 유지하고 요도의 축을 유지하여 협심증180°의 상단을돌립니다(그림 1B).
    5. 카테터를 마우스에 7mm 더 하여 방광 내에 두게 합니다(그림1C). 카테터를 저항 이상으로 강요하지 마십시오. 저항이 느껴지면 카테터의 위치를 처음부터 수정합니다. 오줌 카테터의 위치가 정확하다면, 소변은 이미 카테터 내에 나타날 수 있습니다.
    6. 소변을 수집하기 위해 angiocatheter의 상단에 1.5 mL 갈색 튜브를 놓습니다. 소변 생산을 향상시키기 위해 피하적으로 0.9 % NaCl의 1 mL을 적용하십시오.
  2. 중앙 정맥 카테터
    1. 마우스의 목을 면도하고 외과 의사를 향해 머리와 함께 recumin에 배치합니다. 테이프로 마우스 헤드를 과도하게 확장합니다.
    2. 70 % 이소 프로판놀로 목을 소독하십시오. 핀장과 가위를 사용하여 턱선 아래작은 피부 절개 (5mm)를 만듭니다. 흉골의 중간에 도달 할 때까지 흉골의 방향으로 약 1cm 피부를 잘라.
    3. 가위를 사용하여 목 오른쪽의 피부를 조심스럽게 해부하십시오. 목의 연조직을 노출하기 위해 마우스의 오른쪽에 피부의 직사각형 절개를합니다. 가위와 핀처를 사용합니다. 두 개의 클램프로 피부 플랩을 고정합니다.
      참고 : 경정맥은 갑상선의 왼쪽을 따라 실행하거나 약간 갑상선의 오른쪽 엽에 의해 덮여있다. 이 단계 후, 수술에 현미경을 사용.
    4. 조심스럽게 미세 핀저의 끝을 사용하여 무딘 준비로 경정맥을 노출하십시오. 정맥 가지에 부상을 피하십시오.
      참고 : 미세 가위로 조직을 제거해야 할 수도 있습니다. 가위를 사용하여 출혈의 위험을 증가시키기 때문에 조직을 제거할 때주의하십시오.
    5. 눈에 보이는 경정맥의 말단 부분(마우스 머리 쪽)에 실크 실(4-0 에서 6-0)으로 합자를 놓고 닫습니다. 경정맥에 약간의 장력을 보장하기 위해 테이프로 실크 실을 고정하여 합자에 긴장을 가합니다. 경정맥의 근위 부분 주위에 합자를 준비하십시오.
    6. 카테터를 평형 주입 용액(1.4단계 참조)으로 채우고 카테터가 경정맥을 정렬되도록 테이프로 카테터를 고정합니다. 공기 색전증을 피하기 위해 기포를 제어합니다.
    7. 삽입 부위에서 미세 핀셋으로 경정맥을 들어 올립니다 (삽입 부위는 합자의 근위 1-2mm입니다). 튜브를 경정맥에 평행하게 맞춥춥습니다. 경정맥을 뚫고 내강을 조준하고 약 2-4mm동안 삽입하여 경정맥의 축과 평행하게 합니다. 활발한 움직임을 피하십시오.
    8. 카테터를 고정하기 위해 합자를 닫습니다. 현미경을 통해 신중하게 확인하여 합자의 압박감을 제어합니다. 수술 부위에 젖은 면봉을 놓습니다.
  3. 혈압 측정
    1. 마우스가 등쪽 의 식으로 누워있는 동안 마우스 꼬리 꼬리의 하단에 꼬리 커프를 배치합니다. 측정을 시작하고 시간당 10배 반복합니다. 측정에서 평균을 작성합니다.
    2. 혈압 측정이 정확하지 않고 잘못된 데이터가 생성되는 경우 꼬리 커프의 위치를 조정합니다.

3. 평형 단계

  1. 평형 단계가 시작되기 전에 오줌 수집 튜브를 변경하고 얼음에 놓습니다.
  2. FITC 평형 위상 용액으로 채워진 10mL 주사기(1.4단계 참조)를 21G 바늘과 더 큰 카테터(ID 0.58mm)로 도입하여 주사기 펌프에 넣습니다.
  3. 면봉을 접고 경정맥에 도입된 작은 용기 카테터(ID 0.28mm)에 넣습니다. 면봉 안에 카테터를 놓습니다. 면봉 위에 클램프를 놓아 역행 혈류 또는 공기 색전증을 폐지하십시오. FITC 볼러스로 채워진 1mL 주사기로 27G 바늘을 소형 용기 카테터 끝에 연결합니다.
  4. 클램프를 열고 FITC 볼러스(100 μL)를 적용합니다. 클램프를 다시 닫고 더 큰 카테터를 더 작은 카테터와 연결합니다. 주사기 펌프를 0.008 mL/min(0.480 mL/h)으로 시작합니다. 60 분 동안 주입을 계속하십시오.

4. 실험 단계

참고 :이 단계에서 는 사구체 permselectivity에 대한 약물의 효과를 조사 할 수 있습니다.

  1. 오줌 관 (시간 점 0 분)을 다른 1.5 mL 갈색 튜브로 변경합니다. 작은 용기 카테터 주위에 면봉을 넣고 3.3 단계에서 표시된 대로 클램프를 닫습니다.
  2. 대형 카테터를 소형 용기 카테터에서 분리합니다. 주사기를 실험 단계 용액으로 변경합니다(1.5단계 참조). 큰 카테터가 평형 용액으로 채워지도록 주입 펌프를 실행하십시오.
  3. 공기 색전증을 피하면서 카테터를 다시 연결하고 클램프를 다시 엽니다. 주사기 펌프를 0.008 mL /min에서 시작합니다.
  4. 주사기 펌프를 60 분 동안 계속 실행하고 그 후 요로 관 내의 소변을 수집합니다 (소변 60 분). 소변 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
  5. 마취 도중 자궁 경관 탈구에 의해 마우스를 희생하십시오. 폐기하기 전에 마우스가 죽은지 확인하기 위해 5 분 동안 관찰됩니다.

5. 소변 분석

  1. 형광 측정
    1. 오줌 풀을 해동하고 인산염 완충 식염수 (PBS)로 1:10을 희석하십시오.
      참고: 오줌 풀은 신진 대사 케이지에 있는 12-24 시간 소변 집합에 있는 건강한 마우스에서 집합된 소변의 풀입니다.
    2. 형광 측정을 위한 표준을 준비합니다. 10 개의 갈색 1.5 mL 튜브를 가지고 빈 (1 : 10 희석 된 소변 풀) 및 다음 FITC -polysucrose 70 농도 (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 및 160 μg / mL)에 라벨을 붙입니다.
    3. 1.5 mL 갈색 튜브에 희석 된 소변 풀의 파이펫 246 μL 및 FITC -폴리 수크로오스 70 재고 농도의 4 μL을 추가 (단계 1.1 참조) 160 μg / mL FITC-폴리 수크로오스 70의 최종 농도를 얻을 수 있습니다. 다른 모든 튜브로 희석 된 소변 풀의 피펫 100 μL.
    4. 1:2를 160 μg/mL FITC-폴리수크로오스 70 튜브의 100 μL을 80 μg/mL 튜브에 피펫팅하여 희석하고 다른 농도로 계속합니다. 희석 된 농도의 적절한 혼합물을 보장하십시오 (예 : 계속하기 전에 튜브를 소용돌이치면서).
    5. 희석 된 오줌 풀로 마우스 소변 샘플 (0 분, 60 분) 1 :10을 희석하십시오.
    6. 각 표준 FITC-폴리수크로오스의 피펫 5 μL은 70 농도 및 마우스 소변 샘플의 검정 384 웰 플레이트에서 삼중으로. 거품을 피하기 위해 15 s에 대 한 1,000 x g에서 접시를 원심 분리.
    7. 플레이트 리더에서 384 웰 플레이트를 분석합니다. 496 nm에서 여기를 수행하고 525 nm에서 형광을 측정합니다.
  2. 크레아티닌 측정
    1. 제조업체의 지침을 따르십시오. 간단히 말해서, 크레아티닌 분석 버퍼 990 μL로 100 mM크레아티닌 표준 용액의 10 μL을 희석하여 크레아티닌 표준을 준비하여 1 mM 표준 용액을 준비합니다.
    2. 1mm 크레아티닌 표준 용액의 0, 2, 4, 6, 8 및 10 μL을 96웰 플레이트에 추가하여 각각 0, 2, 4, 6, 8 및 10 nmol/well 표준을 생성합니다. 크레아티닌 분석 버퍼를 각 우물에 추가하여 부피를 50 μL로 가져옵니다.
    3. 크레아티닌 분석 버퍼 42-44 μL, 크레아티나아제 2 μL, 크레아티나아제 2 μL, 크레아티닌 효소 믹스 2 μL, 크레아티닌 프로브 2 μL을 추가하여 반응 혼합을 준비합니다. 블랭크의 경우 크레아티닌 분석 버퍼 44 μL, 크레아티나아제 2 μL, 크레아티닌 효소 믹스 2 μL, 크레아티닌 프로브 1-2 μL을 사용하십시오.
    4. 96웰 플레이트에서 각각의 웰에 50 μL의 적절한 반응 믹스를 넣고 37°C에서 수평 셰이커상에 60분 동안 배양한다. 배양 중에 빛으로부터 플레이트를 보호하십시오. 플레이트 리더에서 570 nm에서 흡광도를 측정합니다.
    5. 모든 판독값에서 빈 값을 빼서 크레아티닌 농도를 계산합니다. 결과는 단위 나노 몰 / 마이크로 리터를해야합니다. 크레아티닌의 농도에 크레아티닌의 분자량(113.12 ng/nmol)을 곱하여 나노그램/마이크로리터 단위를 수신합니다.

6. 데이터 분석

  1. 표준 곡선에서 FITC-폴리수크로오스 70 소변 농도를 계산합니다.
  2. FITC-폴리수크로오스 70소변 농도를 참조하여 대표적인 소변 샘플에서 크레아티닌 농도를 참조하였다.
  3. 소변 60 분 샘플을 소변 0 분 샘플대조군 및 처리된 마우스를 참조하였다.

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결과

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도2에 도시된 바와 같이, 마우스에서 사구체 투과성을 시험하는 방법은 3단계로 구축된다. 첫 번째 단계는 오줌 카테터와 중앙 정맥 카테터가 배치되는 준비 단계라고합니다. 두 번째 단계는 FITC-폴리수크로오스 70의 정맥 볼러스 주입으로 시작하여 60 분 동안 FITC-폴리 수크로오스 70의 연속 주입으로 시작하여 평형 단계라고합니다. 마지막 단계는 실험 단계라고합니다. 이 단계에서 FITC-폴리수크로오스 70의 주입이 계속되고 약물 또는 기타 물질이 사구체 투과성에 영향을 미치는 지 테스트할 수 있습니다. 소변은 각 단계의 끝에 집합됩니다.

이 추적자 모형 내의 사구 체 투과성을 조사하기 위하여는, 점막을 손상시키지 않고 제대로 오줌 카테터를 두는 것이 필수적입니다. 여성 마우스 방광에 오줌 카테터를 배치하는...

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토론

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제시된 방법은 조사자가 추적자를 사용하여 매우 민감한 방식으로 마우스의 사구 체 투과성을 테스트 할 수 있게합니다. 이 방법을 사용하면 소량의 소변만 사용하여 사구 체 투과성의 단기 증가를 진단 할 수 있습니다. 이 기술을 성공적으로 마스터하기 위한 가장 중요한 단계는 1) 마우스 수술, 특히 중앙 정맥의 통조림, 2) 점막에 해를 끼치지 않고 오줌 카테터를 배치하는 수동 전문 지식 개발, 3) 취급에 대한 수동 전문 지식입니다. 샘플의 작은 볼륨 384 웰 플레이트.

중앙 정맥 카테터를 배치 할 때 카테터가 경정맥에 침투하지 않는 것이 필수적입니다. 침투를 피하기 위해 원위 합자 (단계 2.2.7 참조)로 경정맥에 긴장을 가하고 경정맥의 내강을 연장하기 위해 미세 핀셋으로 경정맥을 들어 올리는 것이 좋습니다. 삽입 부위를 작게 유지하려면 카테터를 삽입하는 동안 심한 움직임을 피하고 항상 여분의 조직을 제거하여 수술 부위의 최상의 시야를 확보하십시오. 오줌 카테터의 배치에 있는 ...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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저자들은 뛰어난 기술 지원에 대해 크리스티나 슈반트, 블랭카 듀벤작, 니콜라 쿠어에게 감사를 표하고, 데니스 손 박사는 형광 스캔에 도움을 주었습니다. 이 연구는 도이치 포충스게마인샤프트(DFG) SFB 612 TP B18을 L.C.R. 및 L.S에 부여하여 지원되었다. 자금 은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
수술용Motic SMZ168 BLMoticSMZ168BL
KL1500LCDPulch 및 Lorenz 현미경150500마우스 수술용 광
MicrofederschereBraun, AesculapFD100R미세 가위
Durotip Feine ScherenBraun, 넥 컷용 AesculapBC210R
PinzetteBraun, 수술용 AesculapBD215R 
홍보ä 수술용 parierklemmeAesculapBJ008R 
SeraflexSerag WiessnerIC108000실크 스레드
케타민 10%Medistar마취
Rompun (Xylazin) 2%Bayer마취
파인 보어 폴리에틸렌 튜빙 ID 0.28mm OD 0.61mmPortex800/100/100카테터
파인 보어 폴리에틸렌 튜빙 ID 0.58mm OD 0.96mmPortex800/100/200카테터
하버드 장치 11 플러스하버드 장치70-2209주사기 펌프
BD Insyte AutoguardBD381823  요로 카테터
다중 모드 검출기 DTX 880Beckman Coulter플레이트 리더
384 웰 마이크로타이터플레이트Nunc262260384 웰 플래
크레아티닌 분석 키트Sigma-AldrichMAK080크레아티닌 농도 측정
96 웰 플레이트아티닌 분석을 위한Nunc260836
FITC 표지 polysuccrose 70TBD ConsultancyFP70FITC-ficoll
Angiotensin IISigma-AldrichA9525구체 투과성 테스트에 사용
혈압 측정용BP-98ASoftron
OTS 40.3040Medite01-4005-00마우스 수술용 가열판
Instillagel 6mLFarco-Pharma GmbH요로 카테터용
ExactaAesculapGT415면도기
마우스 현미경트 크레  사

참고문헌

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