인간 P53을 연구하기 위한 기능성 어세이 개발을 위한 섀시로 효모

요약

여기에 제시된 효모 Saccharomyces 세레비시아에 종족을 건설하고 악용하는 네 가지 프로토콜은 인간 P53 의 일시 활성화 잠재력, 다양한 암 관련 돌연변이의 영향, 공동 발현 된 상호 작용 단백질, 및 특정 작은 분자의 효과.

초록

잘 알려진 포유류 P53 단백질이 효모 S. 세레비시아에서 전사 인자(TF)로서 작용할 수 있다는 사실은 1) 결합 부위의 영향을 연구하기 위해 상이한 기능성 검사의 개발을 허용하였다[즉, 반응 요소(RE)] P53 환동성 특이성 또는 2) TP53 돌연변이, 공동 발현 보조 인자, 또는 P53 환활성화 활성에 대한 소분자에 대한 서열 변이체. 다른 기본 및 번역 연구 응용 프로그램이 개발되었습니다. 실험적으로, 이러한 접근법은 효모 모델의 두 가지 주요 장점을 이용한다. 한편으로는, 게놈 편집의 용이성은 P53 의존의 서열 특이성을 조사하기 위하여 특정 P53-RE의 수준에서만 다른 이소제닉 긴장을 이용해서 정성적 또는 정량적인 리포터 시스템의 빠른 건설을 가능하게 합니다 트랜스 활성화. 한편, 이소성 P53 발현에 대한 조절 시스템의 가용성은 광범위한 단백질 발현에서 의 역활성화의 평가를 허용한다. 이 보고서에서 검토된 것은 컬러 리포터 유전자, luciferase 및 효모의 성장을 기반으로 하는 시스템을 광범위하게 사용하여 주요 방법론 단계를 설명하고 예측 능력을 비판적으로 평가합니다. 더욱이, 이러한 접근법의 극단적인 다양성은 TP53 유전자 가족의 다른 구성원인 P63 및 P73을 포함하여 다른 F를 연구하기 위하여 쉽게 이용될 수 있습니다.

서론

전사는 특정 자극에 응하여 염색질 지구에 RNA 중합효소의 모집 그리고 변조를 위한 전사 인자 (TFs) 및 공동 인자의 동적, 공간 및 시간적 조직을 관련시키는 매우 복잡한 프로세스입니다¹ . 인간 P53 종양 억제제를 포함하는 대부분의 TFs는, 단일 (또는 다중) 독특한 모티브로 구성된 응답 요소 (REs)에게 불린 DNA 서열의 형태로 특정 시스 작용 요소를 인식합니다 ~6-10 뉴클레오티드 긴. 이러한 모티브 내에서, 개별 위치는 다양한정도의 가변성 2를 나타낼 수 있으며, 일반적으로 위치 중량 행렬(PWM) 또는 로고^3,4로요약된다.

상기 효모 S. 세레비시아는 정형고효모 유전자가 존재하지 않는 경우에도 보완 성 검사, 자궁외 발현 및 기능성 관찰을 통해 인간 단백질의 다양한 측면을 연구하는 데 적합한 모델 시스템입니다^{5. 6개 , 7.}전사 계통 8의 기저 성분의....

프로토콜

1. 특정 RE를 포함하는 ADE2 또는 LUC1 기자 효모 균주의 건설 (yAFM-RE 또는 yLFM-RE)

1. 줄무늬 yAFM-ICORE 또는 yLFM-ICORE 균주^12,14 (ICORE = I, GAL1 프로모터하에서 의 ISce-I 엔도너렐리스; CO = 카운터 선택 우라3; RE = 카나마이신 저항을 수여하는 KanMX4 리포터; 표1) YPDA 한천 플레이트상에 -80°C에 보관된 15%글리세롤 스톡으로부터(표 2). 30 °C에서 2-3 일 동안 자랍니다.
2. 신선한 접시에서 효모 콜로니 1개를 꺼내 (3주 이상 된 것) YPDA 5 mL을 함유한 작은 플라스크에 놓습니다(표 2). 밤새 30°C에서 배양하고, 150-200 rpm에서 흔들어.
3. 다음 날, 덱스트로스의 모든 흔적을 제거하기 위해, 3,000 x g에서 2 분 동안 세포를 펠렛하고 튜브의 반전으로 상판을 버립니다.
   참고: 실온(RT)에서 이 프로토콜의 모든 원심분리를 수행합니....

결과

의 건설 ADE2 또는 LUC1 리포터 효모 균주

델리토 퍼페토접근법^{12,14,15,16은} P53 리포터 효모 균주의 시공을 가능하게 하도록 적응되었다(도1B). 이 방법은 양단에, 적어도 30개의 뉴클레오티드를 포함하는 단일 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 선택된 통합 궤적에 동봉한.......

토론

효모 계 분석에 따르면 P53 단백질 기능의 다양한 측면을 조사하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다. 이러한 해학은 기능적 다형성의 평가를 포함하여 RE 표적 부위의 변이체로 P53 환활성화 잠재력을 평가하는 데 특히 민감하다. 색상 리포터의 사용뿐만 아니라 루시퍼라아제 분석의 소형화는 비용 효율적이고 상대적으로 확장 가능한 분석결과를 낳습니다. 또한, 성장 억제 시험은 잠재적으로 흡수의 측정을 통해 효모 세포 생존의 정량화를 자동화, 화학 라이브러리 스크리닝에 사용되는 것이 가능하다. ABC 수송기의 세포벽 및 작용으로 인한 투과성이 제한적이지만 약물 스크리닝을 위한 효모 사용에 한계가있는 것으로 여겨지고 있지만, 유전자 변형은 22,^65에성공적으로 개발되었다.

포유류 세포 기반 분석과 비교하여 효모 기반 P53 분석사는 P53이 더 높은 진핵생물에서 기능을 조절하는 보조.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
L-아스파르트산	SIGMA	11189
QIAquick PCR 정제 키트	QIAGEN	28104
L-페닐알라닌	SIGMA	78019
펩톤	BD 박토	211677
효모 ex+A2:C26tract	BD Bacto	212750
Difco 효모 질소 염기(아미노산 및 황산암모늄	제외) BDTM	233520
리튬 아세테이트 이수화물	SIGMA	517992
세균 한천 A형	Biokar Diagnostics	A1010 HA
G418 이황산염	SIGMA	A1720
황산암모늄	SIGMA	A2939
L-아르기닌 모노하이드로 클로라이드	SIGMA	A5131
아데닌 헤미설페이트 염	SIGMA	A9126
수동 용해 버퍼 5x	PROMEGA	E1941
Bright-Glo Luciferase 분석 시스템	PROMEGA	E2620
5-FOA	Zymo Research	F9001
D-(+)-Galactose	SIGMA	G0750
L-Glutamic acid	SIGMA	G1251
덱스트로스	SIGMA	G7021
L-히스티딘	SIGMA	H8125
L-이소류신	SIGMA	I2752
L-라이신	SIGMA	L1262
L-류신	SIGMA	L8000
L-메티오닌	SIGMA	M2893
PEG	SIGMA	P3640
D-(+)-라피노스 펜타하이드레이트	SIGMA	R0250
L-세린	SIGMA	S4500
L-트립토판	SIGMA	T0271
L-트레오닌	SIGMA	T8625
우라실	SIGMA	U0750
L-발린	SIGMA	V0500