방법 논문

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

21.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59086

⸱

2019년 4월 11일

 ,  ,  , 
1Genome Institute of Singapore, Agency for Science Technology and Research, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

이 논문에서

요약

CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

초록

클러스터 된 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 시스템 세균성 적응 면역에 자연스럽 게 작동 하지만 성공적으로 많은 다른 살아있는 유기 체에 있는 게놈 엔지니어링에 대 한 용도가 변경 되었습니다. 가장 일반적으로, CRISPR wildtype 관련 9 (Cas9) 또는 Cas12a endonuclease 게놈, DNA 이중 가닥 휴식 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 통로 또는 상 동 감독 수리 (를 통해 복구 후에 특정 사이트를 쪼개 다 하는 데 사용 됩니다. HDR) 통로 기증자 서식 파일 인지에 따라 결 석 또는 각각 제시. 날짜 하려면, 다른 세균 종에서 CRISPR 시스템 게놈 포유류 세포에서 편집을 수행 할 수 표시 되었습니다. 그러나, 기술의 명백한 단순에도 불구 하 고 여러 설계 매개 변수 필요 간주, 종종 그들의 게놈 편집 실험 수행에 최고의 방법에 대 한 당황 하 게 하는 사용자를 떠나. 여기, 우리가 원하는 DNA 수정, 편집 하는 포유류 세포에 실험 하는 게놈의 성공적인 실행을 촉진의 목표를 수행 하는 세포 클론의 식별에 실험적인 디자인의 완벽 한 워크플로우를 설명 합니다. 우리는 사용자의를 위한 주요 고려 사항 선택 CRISPR 시스템, 공백 길이 그리고 단일 가닥 oligodeoxynucleotide (ssODN) 기증자 서식 파일의 디자인을 포함 하 여 강조 표시 합니다. 우리는이 워크플로 유전자 녹아웃 연구, 모델링 노력, 질병에 대 한 도움이 될 것입니다 또는 기자 생성 세포 라인을 구상.

서론

어떤 생명체의 게놈 엔지니어링 능력은 많은 생물 의학 및 바이오 응용 프로그램, 질병 발생의 수정 같은 돌연변이, 질병 연구에 대 한 정확한 휴대 전화 모델의 건설 또는 농업 생성 바람직한 특성을 가진 작물입니다. 세기의 차례 이후 다양 한 기술 개발 되었으며, meganucleases,12,3을 포함 한 포유류 세포에서 게놈 엔지니어링, 아연 손가락 nucleases4,5또는 전사 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs)6,7,,89. 그러나, 이러한 이전 기술을 어려운 프로그램 또는 조립, 지루한 연구 및 업계에서 광범위 하 게 채택 함으로써 방해.

최근 몇 년 동안에는 클러스터 된 정기적으로 짧은 구조 반복 (CRISPR) interspaced-CRISPR 관련 (Cas) 시스템 엔지니어링 기술10,11강력한 새로운 게놈으로 떠오르고 있다. 원래 박테리아에 적응 면역 체계, 되었습니다 성공적으로 식물과 동물, 인간을 포함 한 게놈 수정에 대 한 배포. CRISPR-Cas 같은 짧은 시간에 너무 많은 인기를 얻고 있다 왜 주된 이유 주요 Cas endonuclease, Cas9 또는 Cas12a (Cpf1 라고도 함) 등을 제공 하는 요소, 게놈에 있는 정확한 위치는 단순히 공상 단일 가이드 RN의 짧은 조각 (SgRNA), A는 디자인을 간단 하 고 저렴 한 합성. 대상 사이트에 보충 되 고, 후 Ca 효소 분자가 위 한 쌍으로 하 고 그것의 RuvC, 트, 또는 Nuc 도메인12,,1314바인딩된 DNA를 앞. 결과 두 배 좌초 휴식 (DSB)은 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 또는 상 동 감독 수리 (HDR) 통로 통해 세포에 의해 연속적으로 복구 됩니다. 복구 서식 파일의 부재, DSB 단백질 코딩 유전자에 frameshift 돌연변이 일으키는 잠재적으로 야기할 수 있는 난수 삽입 또는 삭제 컷된 사이트에 뉴클레오티드 (indels), 오류가 NHEJ 통로 의해 수리는. 그러나, 원하는 DNA 변화를 포함 하는 기증자 템플릿을, 존재 DSB 고화질 HDR 통로 의해 수리는. 기증자 서식 파일의 일반적인 종류 단일 가닥 oligonucleotides (ssODNs) 및 플라스 미드 포함 됩니다. 전 반면 후자는 일반적으로 사용 하나 비교적 긴 시퀀스를 삽입 하고자 하는 경우 원하는 DNA 변경 (예: 단일 기본적인 쌍의) 작은 경우에 일반적으로 사용 됩니다 (예를 들어 녹색 형광 단백질의 코딩 순서 또는 GFP) 대상 장소에.

Cas 단백질의 endonuclease 활동 대상 사이트15에 protospacer 인접 한 모티프 (PAM)의 존재를 요구 한다. Cas9의 팸은 protospacer의 3' 끝에는 PAM의 Cas12a (Cpf1 라고도 함)는 5' 끝에 대신 하는 동안16. Cas-가이드 복잡 한 RNA는 PAM은17에 결 석 하는 경우는 DSB 소개 하 수 없습니다. 따라서, PAM 특정 Ca nuclease 쪼개 다 수가 게놈 위치에 제약 조건을 배치 합니다. 다행히, 다른 세균 종에서 Cas nucleases 일반적으로 다른 팸 요구를 전시 한다. 따라서, 우리의 엔지니어링 도구 상자에 다양 한 CRISPR Cas 시스템을 통합, 우리는 게놈에 타겟이 될 수 있습니다 사이트의 범위를 확장할 수 있습니다. 또한, 자연 Ca 효소 설계 수 있습니다 또는 대체 팸 시퀀스, 게놈 목표 조작18,,1920에 액세스할 수의 범위를 더욱 확대 인식 진화.

여러 CRISPR Cas 시스템 게놈 기술 설계 목적을 위해 사용할 수 있지만, 기술의 대부분의 사용자는 여러 이유로 주로 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 Cas9 nuclease에 의존 했습니다. 첫째,이 상대적으로 단순히 NGG 팸, 더 복잡 한 PAMs 존재만 쪼개 다 수 다른 많은 Ca 단백질 달리 필요 합니다. 둘째, 인간의 세포21,,2223,24에 성공적으로 배포 하는 첫 번째 Ca endonuclease 이다. 셋째, SpCas9까지 날짜에 최고의 특징이 효소 이다. 연구자 다른 Cas nuclease 사용 하고자 하는 경우 그 또는 그녀가 종종 것 디자인 실험 및 다른 효소 SpCas9에 비해 다른 생물학 문맥에서 얼마나 잘 수행 하는 최선의 방법에 대 한 명확한.

다른 CRISPR Cas 시스템의 상대적인 성능에 선명도 제공 하려면 우리 최근 포도 상 구 균 (SaCas9), 에서 Cas9 효소에서에서 Cas9 효소 5 개의 Ca endonucleases-SpCas9의 체계적인 비교를 수행 했습니다. Neisseria meningitidis (NmCas9) (AsCas12a)에 Acidaminococcus sp. BV3L6에서에서 Cas12a의 효소 및 Cas12a 효소 Lachnospiraceae 박테리아 ND2006에서에서 (LbCas12a)25. 공정한 비교를 위해 우리는 다른 실험 조건 및 대상 사이트의 동일한 세트를 사용 하 여 다양 한 Cas nucleases 평가. 연구 또한 delineated 디자인 매개 변수 각 CRISPR Cas 시스템 기술의 사용자를 위한 유용한 참고 자료 역할을. 여기, 더 나은 CRISPR Cas 사용 하도록 연구 활성화 시스템, 다른 Cas9 및 Cas12a 효소 ( 그림 1참조)로 최적의 게놈 엔지니어링에 대 한 단계별 프로토콜 제공. 프로토콜 뿐만 아니라 포유류 세포에서 게놈 성공적인 엔지니어링 결과의 가능성을 최대화 하기 또한 중요 한 디자인 고려 하지만 실험 내용을 포함 합니다.

CRISPR 유전자 편집 프로세스 다이어그램; sgRNA 설계, 플라스미드 클로닝, 세포 형질도입, 클론 스크리닝
그림 1 : 게놈을 생성 하는 워크플로 개요 편집 인간의 세포 라인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1입니다. sgRNAs의 디자인

  1. 적절 한 CRISPR-Cas 시스템을 선택 합니다.
    1. 첫째, 모든 Cas9 및 Cas12a nucleases 포유류 세포16,21-32에 작동 표시 되어의 팸 시퀀스에 대 한 대상 영역을 검사 합니다. 5 자주 사용된 효소 그들의 각각 PAMs 함께 표 1 에 주어진 다.
      참고: 외는 endonucleases 성공적으로 배포 된 포유류 세포 뿐만 아니라, 연쇄 상 구 균 thermophilus (St1Cas9)에서 Cas9 nuclease 같은 다른 보다 적게 일반적으로 사용 되 Ca 효소는 표 1에 나열 된, 그 PAM NNAGAAW를 인식합니다. 원하는 대상 사이트 알려진된 팸 포함 되어 있지 않으면, 다음 하나 것 없을 게놈 엔지니어링에 대 한 CRISPR-Cas 시스템을 사용 하 여.
    2. 둘째, 대상 게놈 소재 시 또는 유전자의 알려진된 속성을 고려 하십시오. 유전자 표현 수준이 나 chromatin 접근성 고려 일부 속성 포함 하 고 있는지 다른 밀접 하 게 관련 시퀀스 뿐만.
      참고: 특정 효소는 더 나은 특정 생물 학적 상황에 적합 합니다. 예를 들어 반복 genomic 소재 시 또는 여러 다른 가까운 paralogs 가진 유전자를 편집 하려면 것이 좋습니다 (SpCas9와 LbCas12a 보다는 sgRNA와 표적 DNA 사이의 불일치에 대 한 낮은 관용) 때문에 어느 AsCas12a를 사용 하 여 또는 SaCas9 (때문에 그 더 높은 대상 특이성을 제공 하 긴 공백에 대 한 요구)25.
Cas Endonuclease팸최적의 공백 길이
SpCas9NGG17-22 nt 포함
SaCas9NNGRRT≥ 21 nt
NmCas9NNNNGATT≥ 19 nt
AsCas12a 및 LbCas12aTTTV≥ 19 nt

표 1: 일부는 일반적으로 그들의 동족 PAMs와 최적의 sgRNA 길이 Ca 효소를 사용. N = 모든 뉴클레오티드 (A, T, G, 또는 C); R = A 또는 G; V = A, C, 또는 g.

  1. 적당 한 공백 시퀀스를 선택 합니다. 식별 가능한 폭발33 와 대상 게놈을 검사 하거나 여러 자유롭게 사용 가능한 온라인 도구를 사용 하 여 대상에서 분열 이벤트의 위험을 최소화 하는 독특한 시퀀스: Feng 장 연구소34에서에서 (a) 프로그램 (http://crispr.mit.edu/); (b) CHOPCHOP35 (http://chopchop.cbu.uib.no/); (c) 전자-선명36 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/); (d) CRISPOR37 (http://crispor.tefor.net/); (e) Cas OFFinder38 (http://www.rgenome.net/cas-offinder/).
    참고: 최적의 길이 스페이서의 17 25 뉴클레오티드 (nt) 포함 하는 Ca에 따라 효소는에서 다를 수 있습니다 ( 표 1참조). Cas9는 스페이서, PAM의 상류는 Cas12a에 스페이서는 또한 PAM.의 하류, HDR 효율 컷된 사이트에서 거리 증가 함께 급속 하 게 떨어진다. 따라서, 정확한 DNA 편집, sgRNA 의도 수정 사이트에 최대한 가까이 배치 합니다.
  2. 사용 중인 CRISPR 플라스 미드에 대 한 적절 한 돌출부와 DNA oligonucleotides 음성 합성.
    1. 가이드의 첫 번째 위치는 스페이서의 역방향 보완 시퀀스 G. 확인 하지 않으면는 스페이서 앞 G 뉴클레오티드를 추가 합니다. 목적으로 복제에 대 한 필요한 돌출부에 추가 합니다.
      참고: 그림, 우리의 평가 연구25에서 사용 되는 플라스 미드를 통해 합성을 oligonucleotides 표 2에 표시 됩니다. 가이드로, 그림 2 에서 예제를 사용 하 여 필요한 경우. 많은 CRISPR 플라스 미드 상용 소스 (예: Addgene)에서 사용할 수 있습니다. 일부는 더 인기 있는 플라스 미드의 재료의 테이블에에서 부여 됩니다.
CRISPR 플라스 미드시퀀스
pSpCas9 및 pSaCas9감각: 5 '-CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
Antisense: 3 '-(C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5'
pNmCas9감각: 5 '-CACC (G) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
Antisense: 3 '-(C) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAC-5'
pAsCas12a 및 pLbCas12a감각: 5 '-AGATNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
Antisense: 3 '-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA-5'

표 2: Oligonucleotides sgRNA 시퀀스는 최근 평가에 사용 되는 CRISPR 플라스 미드에 클로닝에 필요한 연구25. 돌출부는 이탤릭체는.

CRISPR 유전자 편집 다이어그램, 엑손 표적화, 올리고뉴클레오티드 서열, SpCas9, SaCas9 비교.
그림 2 : 대상 사이트를 선택 하 고 디자인 oligonucleotides CRISPR 플라스 미드로 복제 하는 방법을 보여주는 예. 대상 게놈 소재 시 여기 인간 CACNA1D 유전자의 엑손 45입니다. PAMs SpCas9 및 SaCas9은 각각 NGG 및 NNGRRT AsCas12a에 대 한 PAM 동안 빨간색으로 강조 표시 됩니다와 LbCas12a TTTN 이며 녹색으로 강조 표시 됩니다. 빨간색 가로 막대가 녹색 수평 막대 나타냅니다 두 Cas12a 효소에 대 한 protospacer SpCas9 및 SaCas9는 protospacer를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 복제 oligonucleotides 백본 벡터에의

  1. Phosphorylate 고 감각과 antisense oligonucleotides anneal.
    1. 경우는 oligonucleotides는 동결 건조 된, 트리 스-ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 100 µ M 농도에 그들을 resuspend (TE 버퍼 테이블의 자료를 참조 하십시오) 또는 ddH2o.
    2. 10 µ L 반응 혼합 감각 oligonucleotide, 센스 oligonucleotide의 1 µ L, T4 DNA 리가 버퍼 (10 배), T4 polynucleotide 키 니 아 제 (PNK)의 1 µ L 그리고 ddH2오 믹스의 6 µ L의 1 µ L의 1 µ L를 포함 하는 pipetting에 의해 잘 준비 하 고 반응 혼합 열 사이에 배치 다음 매개 변수를 사용 하 여 cler: 30 분, 5 분 및 경사 6 ° C/min에서 25 ° c 95 ° C에 대 한 37 ° C.
    3. 반응 혼합 1: 100 ddH2O (예를 들어, 2 µ L 반응 혼합 + 198 µ L ddH2O)를 희석.

유전자 서열이 포함된 CRISPR 플라스미드 다이어그램, DNA 편집용 프라이머, 벡터 맵 분석.
그림 3 : CRISPR 플라스 미드의 예. (한) A 지도 플라스 미드의 다른 중요 한 특징을 나타내는. 여기, EF-1a 발기인 U6 발기인은 sgRNA의 식을 하는 동안 Cas9의 식을 드라이브. Amp(R)는 플라스 미드에는 암 피 실린-저항 유전자를 나타냅니다. (b) 플라스 미드에 "BbsI BplI 복제 사이트"의 순서. BbsI 인식 순서 GAAGAC 이며 BplI의 인식 순서는 개 그-N5하는 동안 빨간색으로 표시 됩니다-CTC 녹색으로 표시 됩니다. (c) sgRNA 시퀀스 플라스 미드에 성공적으로 복제 되었습니다 여부를 확인 하려면 식민지 PCR에 사용 될 수 있는 뇌관. 보편적인 M13R(-20) 뇌관 플라스 미드에 분홍색 화살표로 표시 됩니다 동안 hU6_forward 뇌관 플라스 미드 지도에 보라색 화살표로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. CRISPR 플라스 미드는 적절 한 제한 효소로 다이제스트.
    참고: IIs 제한 효소 타입으로 골든 게이트 어셈블리에 의존 일반적으로 sgRNAs의 클로닝. 다른 효소는 다른 CRISPR 플라스 미드에 대 한 사용할 수 있습니다. PSpCas9, BbsI 또는 BplI 사용 ( 그림 3참조). PSaCas9, pNmCas9, pAsCas12a, 및 pLbCas12a, BsmBI를 사용 합니다.
    1. 포함 하는 원형 플라스 미드 벡터의 1 µ g 20 µ L 반응 믹스를 준비, 버퍼 (10 배)의 2 µ L, 1 µ L의 제한 효소 (예: BbsI, BplI, 또는 BsmBI), 그리고 ddH2O 20 µ L의 최종 볼륨을 품 어 2.5 h에 대 한 37 ° C에서 반응.
    2. 새우 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (SAP)의 1 µ L, 반응에 추가 하 고 다른 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    3. DNA 로드 x 6의 5 µ L을 추가 하 여 반응 끄다 염색 ( 재료의 표참조), 혼합, 그리고 해결 트리 스-아세테이트-EDTA (태) 버퍼 x 1와 0.8 %agarose 젤에 반응. 그런 다음 삭제할 올바른 밴드 하 고 젤을 선형화 벡터를 정화.
  2. 단련된 oligonucleotides 소화 CRISPR 플라스 미드에 선.
    1. 10 µ L 반응 혼합 준비: 50 선형화 벡터, 희석된 단련된 oligonucleotides의 1 µ L, T4 DNA 리가 버퍼 (10 배)의 1 µ L, T4 DNA 리가 및 ddH2O 10 µ L의 최종 볼륨을 1 µ L의 ng ( 재료의 표참조). 반응에서 16 ° C 하룻밤 또는 2 h에 대 한 실 온에서 품 어.
      참고: 프로세스의 속도를 내 고, 집중된 T4 DNA 리가 사용을 15 분 동안 실 온에서 반응 혼합물을 품 어 ( 재료의 표참조).
  3. 화학적으로 유능한 대장균 으로 합자 제품 변형 세포 ( 보조 파일 1참조). 100 µ g/mL 암 피 실린과 파운드 한 천 배지에서 변형 된 세균성 세포 확산.
  4. 식민지 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 박테리아를 식별 하기 위해 삽입 수행 합니다.
    1. 살 균 PCR 스트립 튜브의 두 세트를 준비 합니다. 설정 1에서 ddH2세트 2에서 O의 4.7 µ L을 추가, 적절 한 항생제 (예, 100 µ g/mL 암 피 실린)와 파운드 국물의 50 µ L을 추가.
    2. 살 균 피 펫 팁, 접시에서 식민지를 선택 하 고 설정 1 관에서 짧게 슬쩍 팁 설정 2 관에서. 때마다 다른 PCR 튜브를 사용 하는 몇 가지 식민지를 반복 합니다.
      참고: 일반적으로 4 개의 식민지를 상영은 충분 합니다. 그러나,이 복제 효율에 따라 달라질 수 있습니다.
    3. 다음 시 약 각 설정 1 튜브 (는 10 µ L PCR)에 대 한 추가: 2 x PCR 마스터 믹스의 5 µ L (염료를 로드 테이블의 자료참조), 감각 또는 antisense oligonucleotide (100 µ M), 뇌관 (100 µ M) CRISPR 플라스 미드 하류를 대상으로 또는 최대 0.15 µ L의 0.15 µ L sgRNA 카세트의 스트림 각각 ( 그림 3참조).
      참고: PCR 제품 이상적으로 대략 150의 제품 크기를 산출 해야 한다 혈압 또는 더 큰, 모든 긍정적인 밴드는 뇌관 이합체로 착각 하지.
    4. PCRs 다음 매개 변수를 사용 하 여 열 cycler에서 실행: 95 ° C 30에 대 일 분 동안 95 ° C 30에 대 한 60 ° C (2 단계), s s (3 단계), 72 ° C 30에 대 한 s (단계 4), 또 다른 34 주기를 5 분 동안 72 ° C에 대 한 단계 2\u20124를 반복 4 ° c.에서 개최
      참고: 60 ° C의 어 닐 링 온도 뇌관 설계에 대 한 최적화를 할 수 있습니다. 30의 신장 시간 s 예상된 PCR amplicon 크기와 사용 하는 DNA 중 합 효소에 따라 다를 수 있습니다.
    5. 해결 1 x TAE 버퍼를 사용 하 여 1 %agarose 젤에 반응.
    6. 적절 한 항생제와 5 mL 파운드를 포함 하는 더 큰 원뿔 관으로 해당 설정 2 관에서 그것의 문화의 50 µ L를 전송 하 여 PCR에 긍정적인 밴드를 생성 하는 식민지 접종 문화 인큐베이터 통 37 ° C에 하룻밤 성장 하자.
    7. 플라스 미드는 하룻밤 문화는 miniprep ( 재료의 표참조) 키트와 사용 감각 또는 antisense oligonucleotide (hU6_forward 또는 M13R(-20) 그림3에서)은 식민지 PCR 뇌관을 사용 하 여 샘플 시퀀스를 격리 합니다.
      참고: 필요한 경우 다운스트림 실험에 대 한 더 큰 금액을 얻기 위해 시퀀스 확인 CRISPR 플라스 미드의 maxiprep를 수행 합니다.

3. 디자인의 복구 템플릿 및 합성

참고: 정밀 게놈 엔지니어링에 대 한 템플릿을 지정 하 여 원하는 DNA 수정 CRISPR 시 약 함께 제공 될 필요 합니다. 단일 뉴클레오티드의 변경 같은 작은 DNA 편집을 위해 가장 적합 한 (섹션 3.1 참조)는 ssODN 기증자 템플릿. 5' 또는 3' 특정 단백질 코딩 유전자의 태그는 GFP의 삽입 등 더 큰 DNA 편집에 대 한, 플라스 미드 기증자 템플릿은 가장 적합 한 (섹션 3.2 참조).

  1. 설계 및 합성 ssODN 기증자 템플릿 ( 그림 4참조).
    1. 올바른 물가 템플릿을 따라야 그 순서를 결정 합니다.
      참고: Cas12a 전시 비 대상 가닥 시퀀스의 ssODNs에 대 한 선호 대상 가닥의 ssODNs 시퀀스 대신25 에 대 한 특혜를 전시 하는 Cas9 동안 (참조 그림 4는).
    2. 복구 순서는 대상 선택한 Ca nuclease에 의해 다시 확인 합니다. 예를 들어 아미노산 변화는 같은 방식으로 PAM을 변형 또는 기능 결과 경우 기증자 템플릿에서 팸을 제거. 그림 4b 에 가이드로, 주어진 예제를 사용 하 여 필요한 경우.
    3. 대칭 또는 비대칭 기증 템플릿을 원하는 경우 결정 합니다. 대칭 기증자에 대 한 각 상 동 팔 DNA 수정 사이트 측면에 서는 적어도 17 nt 긴25확인 합니다. 비대칭 기증 서식 파일에 대 한 원하는 DNA 변화를 (참조 그림 4는)의 더 긴 팔 5 '를 사용 합니다. 중요 한 것은, 짧은 팔 약 37 인지 확인 길이, 다른 상 동 팔은 약 77 nt nt 길이25,39.
    4. 단일 가닥 DNA의 조각으로 디자인 된 서식 파일을 음성 합성.
      참고: 비대칭 ssODNs 수 있습니다, 하지만 항상 안, 대칭 ssODNs 보다 높은 HDR 효율성을 전시. 일반적으로 비대칭 기증자는 일반적으로 적어도 대칭 기증자 뿐만 아니라 때 수행 올바르게 설계 합니다. 그러나, 비대칭 템플릿 오래 이며 따라서 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지) 정화 또는 특별 한 합성 절차를 필요로 하기 때문에 훨씬 더 많은 비용. 일상적인 유전자 녹아웃 보통 NHEJ 복구 경로에 의존 하 고 복구 서식 파일을 필요 하지 않습니다. 그러나 녹아웃 효율 낮은 경우 frameshift 돌연변이 포함 하 고 적어도 120 ssODN 기증자 서식 파일을 디자인 하는, 길이25,40에서 nt.

CAS9/12a를 통해 표적 유전자좌에서 대칭/비대칭 ssODN 통합을 보여주는 유전자 편집 다이어그램.
그림 4 : SsODN 기증자 서식 파일의 디자인. (a) 다양 한 가능한 디자인을 보여주는 회로도. 빨간 가로 사각형 파란색 사각형 표시 대상 (T) 가닥 동안 비 대상 (NT) 가닥을 나타냅니다. 또한, 작은 녹색 사각형 나타냅니다 (예: 단일 뉴클레오티드 변화) 원하는 DNA 수정. 각 상 동 팔의 최소 길이 최소한 17 이어야 한다 대칭 ssODN을 사용 하는 경우 nt (하지만 더 이상 있을 수 있습니다). 비대칭 ssODNs에 대 한 37/77 T ssODN 77/37 NT ssODN Cas12a 유도 HDR에 대 한 최적의 나타납니다 동안 SpCas9 유도 HDR에 대 한 최적의 것 처럼 보인다. L = 왼쪽된 상 동 팔; R = 오른쪽 상 동 팔. (b) ssODN 서식 파일을 디자인 하는 방법을 보여 주는 구체적인 예 를. 여기, 대상 게놈 소재 시 exon 인간 CACNA1D 유전자의 45입니다. PAM은 Cas9는 분홍색과 밑줄, Cas12a 갈색을 위한 PAM을 동안 및 밑줄. 목표 (아르기닌 인코딩) AGG에 AGU (떠들고 인코딩) 변환 하 여 missense 돌연변이 (에서 강조 표시 된 녹색)를 만드는 것입니다. 를 방지 하기 위해 Cas12a에 의해 재 타겟팅 TTTC 팸 CTTC에 돌연변이 이다. Note는 (UAU 및 UAC 모두 코드 티로신) 아미노산에 변화가 없습니다. 추가 방지 하기 위해 Cas9에 의해 재 타겟팅 AGU codon (굵게), UCC codon 바뀝니다 떠들고에 대 한 코드의 둘 다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 디자인과 적절 한 플라스 미드 기증자 서식 파일 복제. 예를 들어 그것은 동종 대상 게놈 소재 시에는 긴 팔을가지고 있는 GFP 시퀀스를 포함할 수 있습니다 ( 그림 5참조).
    1. 수정 된 시퀀스는 선택한 Ca nuclease에 의해 대상 다시 확인 합니다. 예를 들어 protospacer는 삽입된 (GFP) 태그에 의해 분할 수 있습니다. 또는, PAM 돌연변이 수 있습니다 하거나 유전자 기능에는 영향을 주지 않는 방식으로 기증자 서식 파일에서 제거 합니다.
    2. 게놈 DNA는 PCR를 사용 하 여에서 상 동 팔을 증폭. 각 상 동 팔의 길이 일반적으로 1000 1500 bp입니다.
      참고: 복제를 촉진 하기 위하여 있는지 확인 전달 뇌관 homology 왼쪽된 팔과 오른쪽 상 동에 대 한 역방향 뇌관 각 팔에 대 한 최소 20 nt 선택한 벡터 백본이 있는 시퀀스를 중복. 또한, 왼쪽된 상 동 팔 역 뇌관과 오른쪽 상 동 팔 앞으로 뇌관은 또한에 피토 프 태그와 일부 겹치는 시퀀스 확인 합니다.
    3. 두 상 동 팔, (GFP) 태그 깁슨 어셈블리41 을 사용 하 여 벡터 등뼈에 복제 ( 재료의 표참조). 생어 시퀀싱 앞으로 사용 하 여 플라스 미드를 확인 하 고는 업스트림 및 다운스트림 기증자 서식 파일의 각각 뇌관을 역방향.
      참고: 생어 시퀀싱은 광범위 하 고 저렴 하 게 사용할 수 있는 상업적인 서비스. 서비스 공급자를 시퀀싱 뇌관 함께 플라스 미드의 약 수를 보냅니다.
    4. 만 한 번 왼쪽된 상 동 팔의 업스트림 또는 다운스트림 오른쪽 상 동 팔의 플라스 미드를 인하 하는 제한 효소와 기증자 서식 파일 선형화
      참고: 최근에, sgRNA-PAM 시퀀스에 의해 형벌 이다, 분열 후 해당 Ca nuclease 플라스 미드에서 발표 되는 더블 컷 기증자 표시 되었습니다 HDR 효율42증가. SgRNA-PAM 시퀀스 상류 삽입 됩니다 (예를 들어 깁슨 어셈블리)에 의해 각각 왼쪽 및 오른쪽 homology의 다운스트림 팔 때 상 동 팔 길이 300을 줄일 수 있습니다 혈압 그리고 플라스 미드를 선형화를 필요가 없습니다.

sgRNA, CLTA 유전자 표적화, P2A-GFP 통합 및 프라이머 서열을 사용한 유전자 편집 다이어그램.
그림 5 : 설계 및 플라스 미드 기증자 템플릿의 복제. (한)이 목표 구체적인 예 P2A-GFP CLTA 단백질의 C-말단에 융합 하입니다. 빨간색 가로 사각형 오른쪽 상 동 팔을 나타냅니다 파란색 가로 사각형 왼쪽된 상 동 팔을 나타냅니다. 대문자 소문자 비 코딩 시퀀스를 표시 하는 동안 단백질 코딩 시퀀스를 나타냅니다. SpCas9 및 Cas12a PAMs 이탤릭체 고 밑줄. (b) 플라스 미드 기증자 endogenously P2A GFP CLTA의 C-말단에 태그를 사용할 수 있는 템플릿. 제공 된 뇌관 시퀀스 깁슨 어셈블리에서 플라스 미드 복제를 사용할 수 있습니다. PCR 조건은 다음과 같습니다: 3 분, 30 대 98 ° C에 98 ° C s (2 단계), 63 ° C 30에 대 한 s (3 단계), 72 ° C 1 분 (4 단계)에 대 한 또 다른 34 주기, 3 분, 72 ° C에 대 한 단계 2\u20124를 반복 하 고 4 ° c.에서 개최 벡터 시퀀스에 해당 하는 검은 글자, 왼쪽된 상 동 팔에 해당 하는 파란색 글자, P2A GFP에 해당 하는 녹색 편지 그리고 오른쪽 상 동 팔에 해당 하는 붉은 글자. P2A GFP 인코딩 시퀀스는 성공적으로 대상 로커 스에 통합 되어, 일단 SpCas9 여 재 타겟팅 되지 것입니다, 유일한 9 이후는 protospacer (GTGCACCAG)의 nt는 그대로 남아 있을 것입니다. 또한, Cas12a, 3 basepairs에 의해 재 타겟팅 하는 것을 막기 위해 즉시 중지점의 다운스트림 (굵게)에 codon 플라스 미드 시퀀스에서 삭제 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4. 세포 transfection

참고: 프로토콜의 나머지 부분은 마음에 HEK293T 세포로 작성 됩니다. 문화 매체 사용의 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) 4.5 g/L 포도 당, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2 m L-글루타민, m과 0.1% 페니실린/스 보충 구성 됩니다. 프로토콜의 다른 단계는 사용 하는 실제 셀 라인에 따라 수정할 할 수 있습니다. 모든 셀 문화 작업 살 균 작업 환경을 보장 하려면 클래스 2 Biosafety 내각에서 이루어집니다.

  1. 24-잘 조직 문화 접시 한 전날 transfection에에서 시드 1.8 × 105 셀.
    1. 미디어를 발음 150 µ L을 0.25% 추가 하 여 셀을 해리 트립 신-EDTA 잘 당. 2 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.
    2. 세포 배양의 150 µ L (또는 1 x 볼륨)를 추가 하 여는 트립 신을 무력화. 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 5 분 동안 1000 x g 에서 벤치 가기 원심 분리기에 셀 아래로 회전 합니다.
    3. 상쾌한, 발음 그리고 세포 배양의 5 mL와 함께 resuspend. 별도 원심 분리기 튜브, 0.4 %trypan 블루 솔루션의 aliquot 10 µ L에서. 그런 다음 단계의 4.1.2 10 µ L resuspended 셀에 추가 하 고 철저 하 게 혼합.
    4. (셀 + trypan blue) 혼합물의 10 µ L를 hemocytometer로 플라스틱. 수동으로 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 셀로 이동 합니다.
    5. 24-잘 조직 배양 접시의 한 잘에 시드 1.8 × 105 셀.
  2. Transfection 믹스 중 500을 포함 준비 (NHEJ 중재 편집)에 대 한 CRISPR 플라스 미드 또는 300의 ng CRISPR 플라스 미드 및 300의 ng ng transfection 시 약 (참조 함께 제공 된 지침에 따라 (편집을 위해 HDR-중재), 기증자 서식 파일의 재료의 표). (일반적으로 주위에 10\u201220 분) 권장된 시간 동안 실 온에서 품 어.
  3. Transfection 믹스 dropwise 패션 셀에 추가 하 고 부드럽게 후 접시에 소용돌이.
  4. 37 ° c 습도 5%에서 품 어 CO2 공기 인큐베이터 (NHEJ 기반 실험)에 대 한 24 시간 또는 72 h (HDR 기반 실험)에 대 한.

5. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)의 transfected 세포

  1. 미디어를 발음 잘 당 0.25% trypsin EDTA의 150 µ L 추가 하 여 세포를 분리. 2 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.
  2. 세포 배양의 150 µ L (또는 1 x 볼륨)를 추가 하 여는 트립 신을 무력화. 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 235 x g 5 분에서 microcentrifuge에 셀 아래로 회전 합니다.
  3. 상쾌한 발음 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 셀을 resuspend. 30 µ m 메쉬를 통해 셀 필터링 또는 여과기 5 mL FACS 튜브에 세포.
  4. 약 100 µ L 문화 미디어 또는 2% 다른 원심 분리기 튜브 준비 FBS 셀의 컬렉션에 대 한 PBS에.
  5. 교류 cytometer에서 부정적인 제어로 비 페 셀과 셀 게이트. 정렬 하 고 있는 형광에 따르면 마커 사용 CRISPR 플라스 미드에 존재 하는 transfected 세포를 수집 합니다. 예를 들어 만약 플라스 미드 mCherry 유전자 운반, RFP 긍정적인 세포에 대 한 정렬.
    참고: 다른 CRISPR 플라스 미드 다른 선택 가능한 마커를 있을 것 이다. 플라스 미드 (pSpCas9, pSaCas9, pNmCas9, pAsCpf1, 및 pLbCpf1)이 평가 연구에 사용 된 세트 오렌지 형광 성 단백질 (OFP) 또는 mCherry 유전자를 나 른 다.

6입니다. 개별 클론의 확장

  1. 정렬된 셀 5 분 Aspirate는 상쾌한에 대 한 최대 속도 (18000 x g) 벤치 가기 원심 분리기에 원심 고 300 µ L 문화 미디어와 펠 릿을 resuspend. 24-잘 조직 문화 접시에 200 µ L 셀 씨와 37 ° C 배양 기에서 몇 일 동안 복구 하자. 섹션 7에 대 한 나머지 100 µ L 셀을 계속.
  2. 일단 셀 confluent 되기 시작, 단계 4.1.1\u20124.1.3에 따르면 그들을 통과. 개별 식민지 성장을 위한 충분 한 공간이 있도록 100 m m 조직 문화 접시에 띄엄띄엄 셀 씨. 37 ° c 습도 5%에서 품 어 CO2 공기 인큐베이터.
    참고: 다양 한 희석을 보십시오. 단일 셀 개별 식민지로 성장에 충분 한 공간이 필요 합니다. 그러나, 그들은 또한 수 없습니다 지나치게 부족으로 일부 셀 라인 셀의 수는 부족 하는 때에 잘 성장 하지 않는다.
  3. 일단 식민지 시작 양식, (4 배 확대)와 현미경 아래에서 그들을 선택 하 고 각 복제 세포 배양을 포함 하는 24-잘 접시의 개별 잘 합니다. 37 ° c 습도 5%에서 품 어 CO2 공기 인큐베이터까지 셀 confluent 되고있다.
    참고: 직렬 희석 및 식민지 따기 하는 대신 cytometry 96 잘 접시로 단일 셀에 대 한 정렬 하는데 사용 하는. 그러나,이 하나의 셀만 있는 경우에 잘 성장 하지 않는 일부 셀 라인에 대 한 작동 하지 않을 수 있습니다.

7입니다. 편집 효율 평가

  1. 5 분 Aspirate는 상쾌한에 대 한 최대 속도 (18000 x g) 벤치 가기 원심 분리기에 (단계 6.1)에서 나머지 100 µ L 정렬 셀 centrifuging 여 genomic DNA를 추출 하 고 게놈 DNA 추출 킷 (참조 테이블의 사용 하 여 격리를 진행합니다 재료).
  2. T7 endonuclease 수행 (T7EI) 나 분열 분석 결과 ( 그림 6참조).
    1. 50 µ L PCR 반응 버퍼 (5 배), dNTP 믹스 (10mm), 사용자 정의 앞으로 뇌관 (10 µ M), 사용자 정의 반전 뇌관 (10 µ M), DNA 중 합 효소, (에 따라 얼마나 많은 세포 게놈 DNA 템플렛의 2\u20125 µ L의 0.5 µ L의 2.5 µ L의 2.5 µ L의 1 µ L의 10 µ L을 포함 하는 PCR 설정 되어 정렬), 다음 ddH2O 50 µ L까지 가기 ( 재료의 표참조).
      참고: 뇌관 설계 되었습니다 T7EI 분석 결과의 결과 두 가지 밴드는 ag 대상 게놈 소재 시 및 수율의 PCR 제품 400\u2012700 bp. 보통 한 뇌관 주변 다른 뇌관 보다는 Ca 효소의 컷된 사이트에 가까이 위치를 측면을 젤을 일어났다 ( 그림 6참조).
    2. 다음 매개 변수 열 cycler에서 PCR을 실행: 3 분, 30 대 98 ° C에 98 ° C s (2 단계), 63 ° C 30에 대 한 s (3 단계), 72 ° C 30에 대 한 s (단계 4), 또 다른 34 주기를 2 분 동안 72 ° C에 대 한 단계 2\u20124 반복 4 ° c.에서 개최
    3. 해결 1 x TAE 버퍼를 사용 하 여 2 %agarose 젤에 반응.
    4. 깨끗 하 고 날카로운 메스로 젤에서 PCR 제품 소비 세 하 고 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용 하 여 DNA를 정화. 260 nm 흡 광도의 파장에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 PCR 제품의 농도 측정 ( 재료의 표참조).
    5. 200를 포함 하는 분석 결과 믹스를 준비 DNA, T7EI 반응의 2 µ L의 ng 버퍼 (10 배), 그리고 ddH2O 최대 19 µ L 돌파 ( 재료의 표참조).
    6. 다음 매개 변수를 사용 하 여 열 cycler에 PCR 제품을 다시 anneal: 95 ° C 5 분, 25 ° c에서 6 ° C/분, 램프에 대 한 다음 4 ° c.에서 개최
    7. 다시 단련된 PCR 제품을 5 U T7EI를 추가 하 고 pipetting, 잘 혼합 일 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    8. 1 x TAE 버퍼를 사용 하 여 2.5 %agarose 젤에 T7EI 소화 DNA를 해결.
    9. 젤 이미지, 계량 ImageJ를 사용 하 여 밴드 농도 및 indel 형성 다음 수식을 사용 하 여 계산:
      인델 백분율 공식; 삽입/결실 돌연변이에 대한 방정식; 유전자 분석 응용 프로그램.
      어디는 나타내는 그대로 PCR 제품 및 b와 c의 강도 분열 제품43의 농도에 해당 합니다.
      1. ImageJ에 밴드의 강도 계량, 먼저 가능한 경계 주변으로 밴드 주위 직사각형 상자를 그립니다. 둘째, 분석 하 고 측정 설정클릭 합니다. 지역, 회색 값을 의미, 그리고 통합된 밀도 옵션 체크 확인 하십시오. 확인을 클릭 하 여 설정 창을 종료 합니다. 셋째, 클릭 분석 및 측정. 평균 또는 RawIntDen 값 밴드 강도 사용 됩니다.

PCR 설정, 불일치 절단 분석, NGS 결과가 포함된 CRISPR 유전자 편집 프로세스 다이어그램.
그림 6 : 성공적인 게놈 편집 결과 대 한 셀을 확인. 2 일반적으로 설명 (a) A 회로도 분석 실험을 사용, 즉 불일치 분열 분석 결과 T7 endonuclease와 나 (T7EI) 효소와 다음 세대 시퀀싱 (NGS) 또는 타겟된 amplicon 시퀀싱 합니다. 파란색 가로 사각형 DNA와 노란색 원 표시 수정 CRISPR Cas 시스템에 의해 유도 된 나타냅니다. NGS amplicons 생성을 위한 프라이 머는 빨간색으로 표시 하는 동안 T7E1 분석 결과 대 한 프라이 머는 녹색으로 표시 됩니다. (b) 뇌관 설계의 시퀀스 및 NGS T7EI 분열 분석 결과 대 한. 여기, 대상 게놈 소재 시 exon 인간 CACNA1D 유전자의 45입니다. 원하는 수정 사이트는 별표로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 타겟된 amplicon 시퀀싱을 수행 ( 그림 6참조).
    1. 대상 게놈 소재 시 증폭 PCR 뇌관 디자인. 100 미만 뇌관 중 하나 위치 20 개 이상 하지만 bp bp는 protospacer에서.
      참고: 일반적으로, 총 PCR 제품의 크기는 수 있도록 설계 되었습니다 150\u2012300 bp 주위 ( 그림 6참조).
    2. 뇌관에 다음과 같이 추가 시퀀스를 추가: (a) 5' \u2012GCGTTATCGAGGTC-NNNN-[앞으로]-뇌관 3'; (b) 5'-GTGCTCTTCCGATCT-[반전 뇌관]-3 '.
    3. PCR 반응 버퍼 (5 배), dNTP (10 m m)의 1 µ L, 뇌관 (10 µ M), 뇌관 b (10 µ M), 0.5 µ L DNA 중 합 효소, (에 따라 얼마나 많은 셀 정렬 되었습니다) 2\u20125 µ L genomic DNA 템플렛의 5 µ L의 5 µ L 10 µ L를 포함 된 50 µ L PCR 반응 혼합 설정 다음 50 µ L ddH20 탑.
    4. 다음 매개 변수 열 cycler에서 PCR을 실행: 3 분, 30 대 98 ° C에 98 ° C s (2 단계), 63 ° C 30에 대 한 s (3 단계), 72 ° C 15에 대 한 s (단계 4), 또 다른 34 주기를 2 분 동안 72 ° C에 대 한 단계 2\u20124 반복 4 ° c.에서 개최
    5. 해결 2 %agarose 젤에 반응 하 고 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용 하 여 PCR 제품을 정화. 260 nm 흡 광도의 파장에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA를 계량 ( 재료의 표참조).
    6. 2 PCR 뇌관 라운드 다음 합성: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC-3 (c) 5' \u2012'; (d) 5' \u2012CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-[바코드]-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'
    7. 설정 20 µ L PCR 반응 혼합 포함 4 µ L PCR 반응 버퍼 (5 배), dNTP (10 m m), 뇌관 c (10 µ M), 뇌관 d (10 µ M), DNA 중 합 효소, DNA 템플릿 (단계 7.3.5 오디오의 2 µ L의 0.2 µ L의 2 µ L의 2 µ L의 0.4 µ L의 1: 100 희석), 및 9.4 µ L ddH2o.
      참고: DNA 템플렛에 대 한 희석 비율의 원래 농도 따라 달라질 수 있습니다. 농도 20\u201240 ng / µ L 주위, 1: 100 희석 비율을 사용 합니다. 또한, 경우 각 실험 샘플에 대 한 다른 바코드를 선택 같은 뇌관은 뇌관 b 단계 7.3.3에서에서 사용 됩니다.
    8. 다음 매개 변수 열 cycler에서 PCR을 실행: 3 분, 30 대 98 ° C에 98 ° C s (2 단계), 30 위한 65 ° C s (3 단계), 72 ° C 30에 대 한 s (단계 4), 또 다른 14 주기를 2 분 동안 72 ° C에 대 한 단계 2\u20124 반복 그리고 개최 4 ° C.
    9. 5 µ L를 확인 하는 PCRs. 결합의 성공 모든 샘플 함께 (가정 다른 바코드 각 샘플에 대 한 사용 되었습니다) 2 %agarose 젤에 각 반응의 해결 및 제조 업체의에 따르면 PCR 정화 키트를 사용 하 여 풀링된 DNA를 정리 지침입니다. PCRs의 일부 전시 이상의 악대 (일반적인 제품의 존재를 나타내는), 만약 추가 젤 추출 단계를 수행 합니다.
    10. 높은 처리량 시퀀싱 악기에 라이브러리 순서 ( 재료의 표참조) 짝된 151 bp 읽기를 생산 하는 제조업체의 지침에 따라. 읽기 1 시퀀싱 뇌관 사용자 정의 설계 이며 별도로 제공 될 수 있다. 그 순서는 다음과 같습니다: Read1_seq: 5'-CCACCGAGATCTACACCCTACACGAGCGTTATCGAGGTC-3'. 읽기 2 시퀀싱 뇌관 및 인덱스 시퀀싱 뇌관 표준 및 시 약 카트리지에서 제공 됩니다.
      참고: T7EI 분석 결과 및 타겟된 amplicon 시퀀싱 통용 된다 게놈 편집의 효율성을 확인 하. 그러나, 다른 실험은 DNA 수정 도입의 종류에 따라 편집 효율성 평가를 수행할 수 있습니다. 예를 들어 제한 사이트에 대상 사이트를 만든 경우 제한 조각의 길이 다형성 (RFLP) 분석 결과 수행할 수 있습니다. 그것 비슷합니다 T7EI 분석 결과 제외 하 고 금지 endonuclease PCR 제품을 대신 소화 하는 데 사용 됩니다.

8입니다. 개별 클론의 심사

  1. 6.3 단계에서 일단 confluent 받기 시작 셀을 분할 합니다. 각 개별 복제에 대 한 나머지를 수집 하 고 단계 7.1에 따라 genomic DNA를 추출 합니다.
  2. 한 수정 제외 섹션 7.2에 따라 모든 개별 클론에 대 한 T7EI 분석 결과 수행 합니다. Wildtype 셀에서 대상 게놈 소재 시를 증폭 하 고 200를 사용 하는 대신 7.2.5 단계에서 테스트 DNA만 100 테스트 DNA의 믹스 100 ng ng ng wildtype DNA의.
    참고: 수정된 단계에 대 한 이유는 그 어떤 클론 성공적인 biallelic 변환 받은 있을 수 있습니다 고 homozygous 돌연변이. 그러한 경우에 있을 것입니다 아무 분열 밴드 T7EI 분석 결과에서 wildtype DNA 혼합 되지 경우.
  3. 시퀀스 T7EI 분석 결과에서 분열 밴드 하는 클론에 대상 사이트입니다.
    1. 증폭 단계 7.2.1–7.2.4에 따르면 수정된 genomic 소재 시.
    2. 다음 복제 반응 설정: PCR 제품, 소금 솔루션의 1 µ L, 이동 벡터의 1 µ L의 4 µ L ( 재료의 표참조).
    3. Pipetting으로 부드럽게 혼합 하 고 적어도 5 분 동안 실 온에서 품 어.
    4. 화학적으로 유능한 대장균 반응 혼합의 3 µ L 변환 (예: TOP10 또는 Stbl3) 세포 ( 보조 파일 1참조). 50 μ g/mL 대와 파운드 한 천 배지에서 변형 된 세균성 세포 확산.
    5. 다음 날, 접종 파운드 액체 미디어 포함 50 μ g/mL 대 이상 10 식민지.
    6. 세균성 문화는 탁, 격리는 miniprep를 사용 하 여 플라스 미드 키트 ( 재료의 표참조) 하 고 앞으로 표준 M13 또는 M13 역방향 뇌관을 사용 하 여 시퀀스.
  4. 서쪽 오 점 (일컬어 immunoblot) (실험을 편집 하는 게놈 frameshift 돌연변이 통해 단백질 코딩 유전자에 밖으로 두드리는 포함) 하는 경우 부재 또는 타겟된 단백질의 존재를 결정을 수행 합니다. 보조 파일 1을참조 하십시오.
    참고: 원하는 게놈 수정 들고 복제를 식별 하는 다른 실험을 수행할 수 있습니다. 예를 들어 phenotypic 분석 결과 세포 행동에 특정 변화를 일으키는 것으로 알려져은 특정 유전자를 노크 하는 경우 수행할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

실험, 관심 소재 시 복제 될 필요가 타겟팅 sgRNA 표현 CRISPR 플라스 미드를 편집 하는 게놈을 수행 합니다. 첫째, 플라스 미드는 그것을 선형화 하는 제한 효소 (일반적으로 타입 IIs 효소)로 소화 된다. 완전 하 고 부분 소화 사이 구별 하는 소화 되지 않은 플라스 미드와 함께 1 %agarose 젤에 소화 제품을 확인 하는 것이 좋습니다. 소화 되지 않은 플라스 미드는 supercoiled, 그들은 선형화 (참조 그림 7는) 보다 더 빠르게 실행 하는 경향이. 둘째, 해야는 sgRNA에 대 한 두 개의 oligonucleotides을 단련 컷된 플라스 미드에 출혈. oligonucleotides CRISPR 플라스 미드 등뼈로 성공적으로 복제 된 경우 확인 하려면 식민지 PCR ( 그림 7b참조) 수행 됩니다. 긍정적인 복제품은 플라스 미드 추출 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

CRISPR-Cas 시스템 엔지니어 유전자 및 식물 및 동물의 transcriptomes 강력 하 고 혁신적인 기술입니다. 많은 세균성 종의 게놈 및 transcriptome 목적44엔지니어링에 대 한 적응 수 있습니다 CRISPR Cas 시스템을 포함 하도록 발견 되었습니다. 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 Cas9 endonuclease은 배포할 성공적으로 인간 세포21,22,,2324, 다른 박테리아에서 효소를 첫 번째 효소 종, 표 1에 표시 된을 포함 하 여 또한 인간의16,26

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자 경쟁 없는 금융 관심.

감사의 글

M.H.T.는 과학 기술 및 연구의 공동 위원회 사무실 그랜트 (1431AFG103)에 대 한 기관에 의해 지원 됩니다, 국가 의료 연구 위원회 (OFIRG/0017/2016) 부여, 국립 연구 재단 보조금 (NRF2013-THE001-046, NRF2013-THE001-093)는 교육부의 교육 1 단계 그랜트 (RG50/17 (S)), 난 양 기술 대학교, 난 양 기술 대학교에서 국제 유전자 공학 기계 (iGEM) 경쟁에 대 한 자금에서 시작 권한을 부여 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK)NEBM0201
새우 알칼리성 인산가수분해효소(rSAP)NEBM0371
트리스-아세테이트-EDTA(TAE) 완충액, 50X1염기BUF-3000-50X4L사용 전에 1X로 희석합니다. 1X 용액에는 40mM 트리스, 20mM 아세트산 및 1mM EDTA가 포함되어 있습니다.
Tris-EDTA (TE) 버퍼, 10X1st BaseBUF-3020-10X4L사용하기 전에 1X로 희석하십시오. 1X 용액에는 10mM Tris(pH 8.0)와 1mM EDTA가 포함되어 있습니다.
BbsINEBR0539
BsmBINEBR0580
T4 DNA LigaseNEBM0202400,000 units/ml
빠른 결찰 키트NEBM2200T4 DNA Ligase의 대안.
Rapid DNA 결찰 키트Thermo ScientificK1423T4 DNA 리가제의 대안.
무딘 제로 블런트 TOPO PCR 클로닝 키트Thermo Scientific451245염 용액은 키트에 TOPO 벡터와 함께 제공됩니다.
NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 마스터 믹스NEBE2621LGibson 어셈블리용 키트.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.ColiThermo ScientificC737303
LB Broth (Lennox), 분말Sigma AldrichL3022ddH20 및 한
천(Lennox)이 있는 LB BrothSigma AldrichL2897ddH20 재구성 및 SOC 매체 사용 전 오토클레이브
-2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 L LB Broth
Ampicillin(나트륨)Gold BiotechnologyA-301
REDiant 2X PCR Mastermix1st BaseBIO-5185
Agarose1st BaseBIO-1000
T7 Endonuclease INEBM0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep KitFavorgenFAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), 고혈당하이클론SH30081.014.5g/L 포도당, L-글루타민 없음, HEPES 및 피루브산 나트륨
L-글루타민, 200mMGibco25030
페니실린-스트렙토마이신, 10, 000U/mLGibco15140
0.25% 트립신-EDTA, 1XGibco25200
소 태아 혈청HycloneSV30160FBS는 56 oC에서 30분 동안 사용하기 전에 열을 비활성화합니다
인산염 완충 식염수, 1XGibco20012
jetPRIME transfection 시약Polyplus Transfection114-75
QuickExtract DNA 추출 솔루션, 1.0진원지LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA KitBiolineBIO-52067QuickExtract
Q5 고충실도 DNA 중합효소NEBM0491
데옥시뉴클레오티드(dNTP) 용액 혼합물NEBN0447
6X DNA 로딩 염료Thermo ScientificR061110mM Tris-HCl(pH 7.6) 0.03% 브로모페놀 블루, 0.03% 자일렌 시아놀 FF, 60% 글리세롤, 60mM EDTA
프로테아제 억제제 칵테일, Set3Merck
니트로 셀룰로오스 막, 0.2µ mBio-Rad1620112
Tris-glycine-SDS 완충액, 10XBio-Rad1610772사용 전에 1X로 희석하십시오. 1x 용액에는 25mM 트리스, 192mM 글리신 및 0.1% SDS가 포함되어 있습니다.
트리스-글리신 완충액, 10X1염기BUF-2020사용 전에 1X로 희석하십시오. 1x 용액에는 25mM 트리스와 192mM 글리신이 포함되어 있습니다.
Ponceau S 솔루션Sigma AldrichP7170
TBS, 20X1st baseBUF-3030사용 전에 1X로 희석하십시오. 1x 용액에는 25mM Tris-HCl(pH 7.5) 및 150mM NaCl이 포함되어 있습니다.
Tween 20Sigma AldrichP9416
Skim Milk for immunoassayNacalai Tesque31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRPAdvanstaK12043
항체 β-actin (C4)Santa Cruz Biotechnologysc-47778로트 번호: C0916
MiSeq systemIlluminaSY-410-1003
NanoDrop 분광 광도계Thermo ScientificND-2000
큐비트 형광계Thermo ScientificQ33226
EVOS FL 세포 이미징 시스템Thermo ScientificAMF4300
CRISPR 플라스미드: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)Addgene48138단일 벡터 시스템: gRNA는 동일한 플라스미드에서 발현됩니다.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpAAddgene61591Single vector system: gRNA는 동일한 plasmid에서 발현됩니다.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7Addgene108379Dual vector system: gRNA는 다른 plasmid에서 발현됩니다.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9Addgene42230Single vector system: gRNA는 동일한 plasmid에서 발현됩니다.
CRISPR plasmid: hCas9Addgene41815Dual vector system: gRNA는 다른 plasmid에서 발현됩니다.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)Addgene71814Single vector system: gRNA는 동일한 plasmid에서 발현됩니다.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)Addgene72247Dual vector system: gRNA는 다른 plasmid에서 발현됩니다.
사용 전 오토클레이브, 분말 - 중 20 mM 포도당, USP Grade . 의 대안 539134

참고문헌

  1. Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
  2. Arnould, S., et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).
  3. Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin. Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).
  4. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
  5. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  6. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).
  7. Zhang, F., et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).
  8. Boch, J., et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
  9. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501(2009).
  10. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Nishimasu, H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 156 (5), 935-949 (2014).
  14. Yamano, T., et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 165 (4), 949-962 (2016).
  15. Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. PLoS One. 7 (4), e35888(2012).
  16. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  17. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  18. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  19. Kleinstiver, B. P., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).
  20. Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
  21. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  22. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  23. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471(2013).
  24. Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
  25. Wang, Y., et al. Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells. Genome Biology. 19 (1), 62(2018).
  26. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  27. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  28. Kim, E., et al. In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications. 8, 14500(2017).
  29. Edraki, A., et al. A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing. Molecular Cell. , (2018).
  30. Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances. 4 (10), (2018).
  31. Muller, M., et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).
  32. Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
  33. Boratyn, G. M., et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).
  34. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  35. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  36. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  37. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  38. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  39. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
  40. Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications. 7, 12463(2016).
  41. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  42. Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology. 18 (1), 35(2017).
  43. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  44. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  45. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nature Communications. 8 (1), 2024(2017).
  46. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766(2014).
  47. Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
  48. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

CRISPR Cas9T7PCRDNA

관련 논문