치경 대 식 세포 식 균 작용 및 생쥐에서 박테리아 클리어런스

요약

여기 우리 보고 murine 치경 대 식 세포와 폐에서 세균성 클리어런스 phagocytic 기능을 분석 하는 일반적인 방법. 이러한 방법을 연구 fluorescein isothiocyanate 구슬의 생체 외에서 먹어서 및 녹 농 균 녹색 형광 단백질의 vivo에서 먹어서. 우리는 또한 쥐에 피 녹 농 균 을 삭제 하는 방법을 설명 합니다.

초록

치경 세포 (AMs)는 폐의 폐 포 공간 경비. AMs에 의해 먹어서 침입 병원 체, 죽은 세포 또는 외국 입자의 제거에 대 한 방어에 중요 한 역할을 한다 그리고 염증 반응과 조직 리 모델링의 해상도, 처리의 다양 한 표면 수용 체에 의해 중재 AMs입니다. 여기, 우리는 패턴 인식 수용 체-, 보완 수용 체 및 Fc 감마 수용 체-중재를 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실험 및 실험적인 전략을 사용 하 여 AMs의 phagocytic 기능 분석에 대 한 방법을 보고합니다 식 균 작용입니다. 마지막으로, 설정 하 고 세균성 클리어런스 vivo에서 평가 하기 위해 쥐에 피 녹 농 균 폐 렴 모델을 특성화 하는 방법을 다루겠습니다. 이 분석 실험 오전 기능을 평가 하는 가장 일반적인 방법을 대표 하 고 또한 대 식 세포 기능 및 다른 기관에서 세균 정리를 공부 하는 데 사용 수 있습니다.

서론

AMs는 휴식 단계와 중 인정을 통해 타고 난 면역 반응의 주요 선수와 흡입된 병원 체와 외국 입자^1,2의 국제화에는 폐 포에서 주요 거주 식 세포. 그것은 알려졌다 그래서 오전 먹어서 결핍 호흡에 종종 결과 AMs P. 녹 농 균 및 Klebsiella 폐 렴^3,4, 등 많은 폐 병원 균의 급속 한 정리를 위한 필수적입니다. 감염, 급성 폐 렴과 같은 더 높은 사망률과 병 적 속도 일으킬.

AMs는 또한 cytokines 및 발산 TNF-α, IL 1β, 생산 발산 하 여 염증 성 호 중구, monocytes, 모집 치경 환경의 다른 세포와는 누화 등을 생산 하 여 폐에 타고 난 선 동적인 응답을 시작 하 고 적응 면역 세포 폐⁵에. 예를 들어 IL 1β AMs 제작한⁶상피 세포 호 중구 chemokine CXCL8의 릴리스를 도움이 됩니다. 또한, AMs apoptotic polymorphonuclear 백혈구 (PMNs)의 먹어서 주변 조직, 조직 손상의 결과로, 장기 염증 PMNs에서 세포내 효소의 지속적인된 유출에는 리드의 실패에 기여 ^{7 , 8 , 9}.

AMs에 의해 식 균 작용은 AMs의 패턴 인식 수용 체 (호흡기)에 의해 또는 AMs의 수용 체 면역 이펙터와 opsonized 병원 체의 바인딩에 의해 병원 체 표면에 병원 체 관련 된 분자 패턴의 직접 인식 하 여 중재 ¹⁰. 후자의 경우, AMs 그들의 Fcγ 수용 체 (FcγR)를 통해 면역 글로불린 (IgG)와 opsonized 목표를 인식할 수 또는 병원 체 코팅 보수 조각, C3b 및 C3bi, 그들의 보완의 수용 체를 통해 (CR)¹¹. 보충 수용 체 중 면역 글로불린의 superfamily (CRIg)의 CR은 선택적으로 조직 세포¹², 나타나며 최근 발견에 피 녹 농 균 폐 렴의 맥락에서 오전 먹어서 CRIg의 역할 강조 ¹³.

많은 원래 연구 메서드를 사용 하 여 대 식 세포 기능^14,15의 분자 메커니즘을 설명 하기 위해 대 식 세포 식 균 작용을 평가. 그러나, vivo에서 먹어서 같은 방법 식 균 작용의 정확한 정량화를 해야합니다. 여기, 우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 먹어서 fluorescein isothiocyanate (FITC)를 사용 하 여에 대 한 상세한 방법론 요약-유리 구슬과 피 농 균 녹색 형광 단백질 (GFP), 각각. 또한, 우리 PRR, CR 및 FcγR 중재 먹어서 가운데 차별화 하는 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 피 농 균 폐 렴에 대해 마우스에 세균 정리 하는 방법을 보고 합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 동부 버지니아 의과대학의의 지침을 따릅니다.

1. 형광 구슬 먹어서

1. 안락사는 마우스 (C57BL/6J, 6 주 오래 된, 여성) 동물의 윤리 안락사에 대 한 IACUC 프로토콜에 의하여 CO₂ 질에 의해.
2. 종이 수건으로 커버 해 부 보드에 아랫 배 위로 마우스를 놓는다. Spread-eagle 그것의 사지와 그것의 발을 파악 하 고 그것의 기도 바로 배치 되도록 다시 머리를 앞 니 및 수준에서 문자열 연결.
3. 마우스의 목, 가슴, 그리고 배꼽 소독 하 고 모피는 도구에 집착 하는 것을 방지 하려면 70% 에탄올과 젖은.
4. 일반 집게를 사용 하 여, 신체의 중심선에 피부를 당겨 하 고 목 구멍의 상단에 중심선을 수술가 위로 잘라.
5. 표준 수술가 위의 무뚝뚝한 끝을 사용 하 여 신중 하 게 멀리 근육과 결합 조직을 목 구멍에 이동 하 고 봄이 위 (microscissors)를 사용 하 여 기도 노출.
6. 연골의 반지는 집게와 창과, 신중 하 게 기도의 심 실 얼굴에 microscissors를 사용 하 여 작은 절 개 (~1.5 m m), 고 기도 18 G 캐 뉼 러를 삽입.
7. 부드럽게 게 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 한 번에 1 mL의 3 mL. 때마다 부드럽게 주사기와 폐, 다시 reinfuse로 액체를 철수 연속에서 3 배. BALF 수집 후 안락사를 위해 자 궁 경부 전위를 수행 합니다. 튜브, 10 분, 1000 x g에서 원심 분리기를 수집된 PBS (~2.8 mL), bronchoalveolar 게 액체 (BALF)는 전송 및 펠 릿을 수집. 튜브 및 파편을 세척 하 고 수송과 치경 대 식 세포를 수집 10 분 1000 x g 에서 원심 분리기를 신선한 PBS의 1 mL를 추가 합니다.
8. 37 ° c 습도 분위기에서 유리 하단 접시에 2 일 동안 10 %nonheat 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 같은 미디어 문화 기본 치경 세포 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 2 mL에 펠 릿 resuspend.
9. 오래 된 미디어를 발음, PBS의 1 mL와 함께 그것을 씻어 하 고 신선한 미디어의 2 개 mL를 추가. FITC 구슬 (carboxylated 라텍스 구슬, 직경에서 2 µ m, 50 구슬/셀)을 추가 하 고 37 ° c 습도 분위기에서 1 시간에 품 어.
10. 씻어 광범위 하 게 PBS (1 mL 5 세척의 총에 대 한 한 번에) extracellular 비즈 제거 하. 무작위로 100 셀을 이미지 하 고 세포내 구슬 가진 셀의 개수 (488 nm).
    참고: Phagocytic 인덱스는 섭취 구슬; 대 식 세포의 총 수로 나눈 수 phagocytic 세포의 비율이 적어도 하나의 구슬 세포¹⁶의 총 수로 나눈 값을 섭취 하는 대 식 세포의 수입니다.
    1. 또는, 구슬 1 시간 배양 후 3 mL의 PBS로 세포 세척 하 고 cytometry 먹어서의 정량화에 대 한에 대 한 처리 키를 누릅니다. 마찬가지로, 흠 없는 셀 또는 컨트롤 셀 구슬 없이 AMs를 처리 합니다. 계산 비율 양성 하 고 소프트웨어에서 이러한 옵션을 선택 하 여 흐름 cytometry 소프트웨어를 사용 하 여 형광 강도 의미.

2. FcγR 및 CR 중재 먹어서

1. Opsonization를 위해 토끼 안티-SRBC-IgM의 50 µ L 또는 안티-SRBC-IgG 실내 온도¹¹시 30 분에 대 한 토끼의 50 µ L 2 x 10⁸ 양 적혈구 (SRBCs)를 품 어.
2. IgM 코팅 SRBCs에 C3b 그리고 C3bi 보완 파편을 해결 하기 위해 37 ° C에서 30 분 동안 C5-불충분 한 (C5D) 인간의 혈 청의 50 µ L로 IgM opsonized SRBCs를 품 어.
3. Murine 대 식 세포 (수소-S 셀) 씨앗 (10, 000 셀/잘) 96 잘 접시에서와 하룻밤 ~ 70%의 합류를 품 어. 1 x 10⁷/mL의 100 µ L opsonized SRBCs MH-S 셀의 각 음을 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어 워시 언바운드 SRBCs 매우 신속 하 게 (~ 1 분) 100 µ L 염화 염화-칼륨 (ACK) 세포의 용 해 버퍼의와.
4. 0.1 %SDS 세포를 lyse 고 2, 7-diaminofluorene (DAF) 과산화 수소 3% 및 6 M 우 레 아의 50 µ L를 추가 합니다. 620에서 헤모글로빈 촉매 fluorene 블루 형성의 흡 광도 측정 nm.
5. SRBCs의 알려진된 번호와 620 nm 흡 광도 값에서 표준 곡선을 사용 하 여 SRBCs의 수를 결정 합니다. 마찬가지로, 프로세스 MH-S 셀 부정적인 컨트롤로 사용 하 여 nonopsonized SRBCs와 인 큐베이 팅.

3. PRR 중재 먹어서

1. 1.1-1.9 고립과 마우스 기본 치경 대 식 세포의 경작에 대 한 단계를 수행.
2. 2 일 후, 미디어를 제거 하 고 씻어 1 mL의 PBS, 셀 알 렉 사 Fluor-488-활용 zymosan A bioparticles (100 입자/요리)를 포함 하는 신선한 미디어의 500 µ L을 추가.
3. 1 h 37 ° c.에 품 어 얼음 처럼 차가운 PBS의 500 µ L을 추가 하 여는 식 균 작용을 중지 합니다.
4. PBS (5 세척의 총에 대 한 한 번에 1 mL)으로 광범위 하 게 세포를 씻어. 실 온에서 10 분 동안 4 %paraformaldehyde 셀을 수정 합니다.
5. PBS (5 세척의 총에 대 한 한 번에 1 mL)으로 광범위 하 게 세포를 세척 하 고 PBS의 500 µ L에는 셀을 계속.
6. 미분 간섭 명암 및 488에서 형광 채널 셀 이미지 nm. AMs zymosan A bioparticles를 포함 하 고 먹어서의 비율을 결정.

4. 폐 포 대 식 세포에 의해 Vivo에서 먹어서

참고: 영양 한 천 배지에서 P. 농 균 GFP를 Inoculate 하 고 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어. 다음 날, 단일 식민지 영양 국물의 2 개 mL를 접종 하 고 하룻밤 37 ° C에서 박테리아를 성장.

1. 다음 날, anesthetize 100 mg/kg 케 타 민 고 10 mg/kg xylazine의 복 관리와 쥐. 발가락 핀치에 응답의 부족을 통해 적절 한 anesthetization를 확인 합니다.
2. 마우스 플랫 보드에 고무 밴드와 함께 위 앞 니에 걸쳐을 복 부 표면 및 연단 위 semirecumbent (45 °) 위치에 놓습니다. 혀를 철회 곡선된 겸 자 사용 하 여, 부분적으로. Intratracheally는 microsprayer를 사용 하 여 50 µ L (5 x 10⁶ 식민지 형성 단위 [CFU])¹⁷ 피 농 균 GFP의 마 취 쥐의 폐로를 관리 합니다.
3. 감염의 1 시간 후 단계 1.1-1.7.
4. PBS의 셀 cytocentrifuge resuspend 유리 슬라이드에 그들 (1000 x g, 실 온에서 1 분).
5. 제조업체의 지침에 따라 치경 대 식 세포, 호 중구, 림프 구, 대 한 cytospin 슬라이드를 얼룩 차동.
6. 무작위로 100 AMs를 선택 하 고 세포내 박테리아를 포함 하는 AMs를 계산 하 고, 식 균 작용의 비율을 결정.

5. Vivo에서 박테리아 클리어런스를 사용 하 여 피 녹 농 균

1. P. 농 균 격리 한 접시에 피 녹 농 균 을 접종 하 고 하룻밤 37 ° C에서 접시를 품 어. 단일 식민지 lysogeny 국물 (파운드)의 2 개 mL를 접종 하 고 하룻밤 37 ° C에서 박테리아를 성장. CFU, 다음 수식을 사용 하 여 계산 합니다.
   
   CFU/mL = (희석 요인 x 식민지의 수) / 문화 판의 볼륨.
   
   희석을 원하는 CFU/mL PBS 가진 문화.
2. 재판 1, intratracheally 마 취 야생-타입 (WT)로 ~2.5 x 10⁵ CFU/mL 피 녹 농 균 의 sublethal 복용량을 주사와 TRIM72^코 마우스, 4.2 단계에서 제시 된 대로. 6 일 동안 매일 몸 무게를 측정 합니다.
3. 시험 2, 재판 1에서 살아남 고 4 일 동안 몸 무게를 측정 하는 쥐로 피 녹 농 균 (5 x 10⁵ CFU/mL)의 두 번째 복용량을 주사.
4. 마우스의 다른 세트를 사용 하 여 시험 3에서 P. 녹 농 균 의 치명적인 복용량 (3 x 10⁷ CFU/mL)으로 WT와 TRIM72^코 쥐를 주입 하 고 주입의 2 일 이내 사망률을 기록 합니다. 동물의 상당한 몸 무게 감량 같은 심한 스트레스, 돌출, 거식 증, 또는 호흡 곤란 참석 의사에 의해 사정 될 것 이다. Untreatable 동물 즉시 희생 될 것입니다.
5. 죽음 또는 안락사 주사 후 2 일에 후, 전체 폐 조직 피크 감염에서 폐 세균의 정량화에 대 한 수집 합니다.
6. 테스트 하려면 폐 세균 부담, 폐 조직에 정상적인 염 분의 200 µ L을 추가 하 고 완전히 박테리아를 파괴 하지 않고 폐 조직 방해는 전자 균질 화기에 이전 테스트 설정을 사용 하 여 그들을 균질. 폐 사진 직렬 희석에 녹 절연 한 천 배지에 lysate의 1 mL 및 플레이트 100 µ L 폐 homogenate의 총 볼륨을 조정 합니다.
7. 24 h에 대 한 37 ° C에서 번호판을 품 어과 전체 폐 당 CFU 결정 세균성 식민지.

6. 통계 분석

1. 학생의 t를 사용 하 여-두 그룹 간의 차이의 통계적 의미를 확인 하려면 테스트. 때 차이 통계적 고려 p < 0.05. 모든 데이터는 평균 (SEM)의 ± 표준 오차를 의미 하는 대로 표시 됩니다.

결과

우리는 먼저 마우스에 의해 식 균 작용을 분석 하는 실험을 수행 기본 AMs. 모든 분석을 통해 우리는 AMs WT 및 TRIM72^코 쥐에서 고립 된 비교. 그림 1A같이 형광 현미경 검사 법 기본 AMs 외피의 1 시간 후 발생 하는 마우스를 먹어서 FITC 유리 구슬의 공개. 그림 1 B cytometry에 의해 식 균 작용의 분석을 보여줍니다. 식 균 작용의 부 량 측정 현미경 고 cytometry 각각 그림 1C 와D 그림 1표시 됩니다. 그림 2...

토론

가스 교환 기능을 수행 하는 동안 폐 지속적으로 외국 입자, 병원 체, 및 알레르기 증상을 직면 한다. AMs는 그들의 주요 기능, 즉 먹어서 덕택으로 방어의 첫 번째 줄을 제공합니다. AMs는 또한 다른 면역 세포는 병원 체를 파괴와 염증의 해상도 함께 조정. 여기, 우리가 구체적으로 AMs 마우스 폐에서 분리 하 여 식 균 작용을 평가 하기 위한 방법을 설명 합니다. 이 원고에 프로토콜 먹어서 vivo에서 그리고 생체 외에서, 또한 다른 기관에서 세균 정리 대 식 세포 기능을 공부 하 고 사용할 수 있는 상세한 연구를 설명 합니다.

설명된 체 외 먹어서 혈 청 치료 FITC 구슬 잠복기의 간단한 아이디어에 의존 하거나 opsonized 먹어서 시작 교양된 AMs와 SRBCs. 이 방법은 광범위 한 세척의 단계와 백그라운드를 줄이기 위해 nonphagocytized Rbc의 세포를 포함 합니다. 하지 준수 AMs를 분리 하려면 주의 해야 합니다. ACK 세포 솔루션 관련 세척 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
18-G 바늘	Nipro Medical	CI + 1832-2C	분자 생물학 등급
2,7-디아미노 플루오렌 (DAF)	시그마 - 알드리치	D17106	분자 생물학 등급
70 % 에탄올	Decon Labs Inc.	18C27B	분석 등급
96-웰 플레이트	Corning	3603	세포 생물학 등급
ACK 용해 버퍼	Life Technologies	A10492	분자 생물학 등급
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle	Thermofisher Scientific	Z23373	분자 생물학 등급
C5 결핍 혈청	Sigma-Aldrich	C1163	생화학 시약
원심분리기	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Issue 11
DMEM 세포 배양 매체	Gibco	11995-065	세포 생물학 등급
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	세포 생물학 등급
흐름 Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
겸자	Dumont	0508-SS/45-PS-1	실험실 동물 해부에 적합
FITC-카르복실화 라텍스 비드	Sigma-Aldrich	L4530	세포 생물학 등급
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	적합 에 대한  세포 감염 분석
유리 바닥 접시	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	세포 생물학 등급
고압 주사기	Penn-Century	FMJ-250	실험실 동물 사용에 적합
균질화기	Omni International	TH-01
과산화수소	Sigma-Aldrich	H1009	분석 등급
도립 형광 현미경	Olympus	IX73
케타민 Hydrochloride	Hospira	CA-2904	제약 등급
Shandon Kwik-Diff 염색	Thermofisher Scientific	9990700	세포 생물학 등급
LB 한천	Fisher Scientific	BP1425	분자 생물학 등급
LB 국물	Fisher Scientific	BP1427	분자 생물학 등급
MicroSprayer 에어로졸라이저	Penn-Century	IA-1C	실험실 동물 사용에 적합
파라포름알데히드	Sigma-Aldrich	P6148	시약 등급
PBS	Gibco	20012-027	세포 생물학 등급
토끼 항-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	면역 분석
토끼 항-SRBC-IgM에 적합	Cedarline Laboratories	CL9000-M	면역 분석에 적합
가위	Miltex	5-2	실험실 동물 해부
에 적합 작은 동물 후두경	Penn-Century	LS-2	실험실 동물 사용에 적합
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	BioRad	1610301	분석 등급
Spring Scissors (Med)	Fine Science Tools	15012-12	실험실 동물 해부
스프링 가위 (작은)	미세 과학 도구에	91500-09	실험실 동물 해부
양 적혈구 (SRBC)에 적합	MP Biomedicals	55876	세척, 보존 SRBC
Urea	Sigma-Aldrich	U5378	분자 생물학 등급
Xylazine	Akorn Animal Health	59399-110-20	제약 등급

적합