방법 논문

멕시코 Cavefish에서 유전자 기능 조작

DOI:

10.3791/59093

⸱

2019년 4월 22일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative, Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College, Florida Atlantic University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

진화 모델 시스템 Astyanax mexicanus유전자의 조작 방법을 설명합니다. 세 가지 다른 기술 설명: 중재 하는 Tol2 transgenesis, CRISPR/Cas9, 및 morpholinos를 사용 하 여 식의 최저 사용 하 여 게놈의 타겟된 조작. 이 도구는 기본 표면 및 동굴 주거 형태 사이의 변형 유전자의 직접 조사를 용이 해야.

초록

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동굴 동물 진화 메커니즘 및 기본 변경 눈 변성, 獸, 수 면 감소, hyperphagia, 및 감각 처리를 포함 하 여 수많은 복잡 한 특색에 유전 기초 조사를 위한 경쟁력 있는 시스템을 제공 합니다. 세계 각국에서 cavefish의 종 다른 동굴 시스템 간의 공유 환경 압력 때문에 형태학과 행동 특성의 수렴 진화를 표시합니다. 다양 한 동굴 종 실험실 조정에서 공부 되었습니다 했다. 시력, 눈 먼 형태와 멕시코 tetra Astyanax mexicanus, 밑에 복잡 한 특성의 진화 생물학과 분자 프로세스에 대 한 독특한 통찰력을 제공 하고있다 그리고 신흥 모델 시스템으로 잘 태세입니다. 다양 한 생물 학적 과정의 진화를 규제 하는 후보 유전자 A. mexicanus에 확인 되었습니다, 하는 동안 개별 유전자에 대 한 역할의 유효성을 검사 하는 기능 제한 되었습니다. Transgenesis 및 유전자 편집 기술을의 적용이 중요 한 장애를 극복 하 고 복잡 한 특성의 진화를 기본 메커니즘을 조사 가능성이 있다. 여기, A. mexicanus에서 유전자 발현을 조작 하기 위한 다른 방법을 설명 합니다. Morpholinos, Tol2 transgenesis의 사용을 포함 하는 접근 하 고 유전자 편집 시스템, 제 브라에서 일반적으로 사용 되 고 다른 물고기 모형, A. mexicanus에서 유전자 기능을 조작 하. 이러한 프로토콜 초과 사육 절차에 대 한 자세한 설명, 수정 된 계란, 주사, 그리고 유전자 변형된 동물의 선택의 컬렉션을 포함합니다. 이 방법론 접근 A. mexicanus에서 다양 한 특성의 진화를 기본 유전과 신경 메커니즘의 조사에 대 한 수 있습니다.

서론

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다윈의 종의 기원1, 이후 과학자 들은 어떻게 특성 정의 된 환경 및 생태 압력, 동굴 생물2덕분에 진화론 모양에 대 한 깊은 통찰력을 얻고 있다. 멕시코 tetra, A. mexicanus, 강 멕시코와 남부 텍사스 살고 눈된 조상 '표면' 인구와 파생된 동굴 변경해 거주 시에라 델 Abra의 적어도 29 지리적으로 고립 된 인구 구성 및 북동 멕시코3의 다른 지역입니다. A. mexicanus, 바꾸 인된 산소 소비, depigmentation, 눈를 포함 하 여 그리고 유와 구하고 행동4,,56, 변경에 확인 된 동굴 관련 된 특성의 수 7,,89. A. mexicanus 선물 잘 정의 된 진화 역사, 생태 환경, 상세한 특성화 및의 존재로 인해 수렴 진화의 메커니즘을 독립적으로 조사를 위한 강력한 모델 진화 동굴 인구10,11. 많은 눈의 손실을 포함 한 cavefish에, 손실 자, 먹이, 훈련의 손실 증가, 침략, 및 스트레스 응답을 감소, 감소 독립 기원, 자주 활용을 통해 여러 번 진화 하는 동굴에서 파생 된 특성은 다른 유전 통로 사이 동굴8,12,13,,1415. 이 반복은 A. mexicanus 시스템의 강력한 측면 이다 진화와 비슷한 고기를 생성 하 어떻게 유전자 시스템의 보다 일반적인 질문에 대 한 통찰력을 불안정 수 있습니다 제공할 수 있습니다.

유전자 기능의 기계 조사에 대 한 유전자 기술의 응용 ( A. mexicanus를 포함 하 여) 많은 물고기 종에 제한 되어는 제 브라의 최근 발전 제공 기준 물고기에서 유전자 기술 개발 16,17,18,19,20. 수많은 도구는에서 널리 이용 되 zebrafish 유전자 발현, 조작 하 고 이러한 절차의 구현 표준화 오래 있다. 예를 들어 단일 셀 단계에서 morpholino oligos (MOs)의 주입은 선택적으로 RNA를 차단 하 고 개발21,22동안 간단한 임시 창에 대 한 번역을 방지. 또한, 유전자 편집 방법, 정기적으로 클러스터 된 같이 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) / CRISPR-관련 단백질 9 (Cas9) 및 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nuclease (TALEN), 정의 된 삭제의 세대에 대 한 허용 또는, 경우에 따라 게놈19,20,,2324에서 재결합을 통해 삽입. Transgenesis 셀 형식을 특정 방식으로 안정적인 유전자 발현 또는 기능을 조작 하는 데 사용 됩니다. Tol2 시스템은 transposase coinjecting에 의해 유전자 변형 동물을 생성 하기 위해 효과적으로 사용 transgene25,26를 포함 하는 Tol2 DNA 플라스 미드와 mRNA. Tol2 시스템 생성 유전자 변형 construct17의 안정적인 생식 삽입 하 메 다카의 Tol2 transposase를 사용 합니다. Tol2 제 닉 생성 coinjecting Tol2 transposase17 Tol2 통합 사이트 및 mRNA에 의해 형벌 transgene를 포함 하는 플라스 미드 포함 됩니다. 이 시스템 zebrafish에 유전자 변형 라인의 배열을 생성 하는 데 사용 되었습니다 및 사용 시 클 리드, 송사리, stickleback를 포함 하 여 추가 긴급 모델 시스템을 최근 확장 했다 그리고, 최근에, 멕시코 cavefish27, 28,29,30.

cavefish 특성이 진화의 elucidating 메커니즘에 대 한 매혹적인 생물 학적 시스템은, 진화 모델로 서의 전체 능력은 하지 되었습니다 완전히 무력화. 이것은 부분적으로 유전자를 조작 하는 무 능력 때문 이었고 휴대 기능 직접31. 양적 특성 loci (QTL) 연구를 사용 하 여 복잡 한 특성을 조절 하는 후보 유전자 확인 되었습니다 하지만이 후보 유전자의 유효성 검사는 어려운32,33,34되었습니다. 최근, morpholinos, CRISPR 및 TALEN 시스템 및 Tol2를 사용 하 여를 사용 하 여 편집 하는 유전자를 사용 하 여 일시적인 최저-중재 transgenesis 유전으로 기본 특성35,36,37의 수를 조사 하는 데 사용 되었습니다 ,38. 구현 및 이러한 기술의 표준화의 생물 학적 특성, 유전자 기능, 정의 된 세포 인구의 라벨의 조작을 포함 한 분자 및 신경 토대를 심문 하는 조작에 대 한 수 고 식 기능 기자입니다. 반면 유전자 또는 세포 기능 하 유전 이러한 도구를 성공적으로 구현 응급 모델 시스템에서 입증 되었습니다, 상세한 프로토콜은 여전히 A. mexicanus부족.

A. mexicanus 변화 하는 환경에 대 한 응답에서 진화의 메커니즘에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 하 고 다양 한 특성을 조절 하는 새로운 유전자를 식별 하는 기회. 요인의 수는 A. mexicanus 는 쉽게 큰 무리 크기는 실험실에서 물고기를 유지 하는 기능을 포함 하 여 설립된 유전자 모델에서 현재 사용할 수 있는 설립된 게놈 도구를 적용 하기 위한 매우 온순한 모델 제안 투명성, 시퀀스 된 게놈 및 정의 된 행동 분석39. 여기, 우리는 morpholinos, transgenesis, A. mexicanus의 표면 및 동굴 인구에서 유전자 편집의 사용에 대 한 방법론을 설명 합니다. A. mexicanus 에서 이러한 도구의 광범위 한 응용 프로그램의 발달, 생리, 및 행동 차이 cavefish 및 표면 물고기의 진화를 기본 분자 과정에 기계 조사에 대 한 수 있습니다.

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프로토콜

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1. Morpholino 올리고 디자인

참고: A. mexicanus 시퀀스 합 게놈 브라우저 (https://www.ensembl.org)에서 뿐만 아니라 국가 중심의 생명 공학 정보 (NCBI) 유전자와 NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 통해 사용할 수 있습니다. 두 표면 및 동굴 주거 형태에 사용 하기 위해 morpholino를 디자인할 때 그것은이 단계에서이 유전 지역 morpholinos에 대 한 대상으로 피할 수 있다 그래서 변경해 사이 어떤 유전 변이 식별 하는 중요 한. 효과 없는 바인딩 morpholino 대상 사이트 내에서 어떤 다형성 변이 발생할 수 있습니다. 디자인과 유사한 zebrafish, 다른 물고기 시스템 이전 A. mexicanus21,36,40. 에서 효과적으로 작동 하도록 표시 되었습니다.

  1. 번역 차단 morpholinos의 디자인
    참고: 번역 차단 morpholinos 생 시작 사이트에 바인딩하여 번역을 차단 하 고 입체 hinderance 통해 mRNA 순서를 바인딩에서 변환 기계 장치를 방해.
    1. ATG 시작 사이트와 시작 하는 대상 유전자의 코딩 영역을 식별 합니다.
    2. 대상 시퀀스의 첫 번째 25 기초 쌍 복사 및 붙여넣기 하 여 시퀀스에에서 기록 텍스트 편집기 또는 실험실 노트북.
    3. 온라인 소프트웨어 (예: http://reverse-complement.com) 또는 수동 번역을 사용 하 여, 대상 시퀀스의 반전 보수 생성할. 텍스트 편집기 또는 실험실 노트북에 결과 역방향 보수를 저장 합니다.
    4. 역방향 보완 시퀀스 morpholino morpholino oligonucleotides 생성 하는 회사에서 주문. 회사 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
  2. 스플라이스 차단 morpholinos의 디자인
    참고: 스플라이스 차단 morpholinos 차단 접합 하 고, 따라서, 성숙한 mRNA 분자의 형성을 방지. 연쇄 반응 (PCR)을 통해 최저의 유효성 검사를 원할 때이 최저 시작 사이트는 잘 정의 된 때 또는 더 최적의 접근에 대 한 대체 방법의 제공 한다. (ATG 차단 MOs) 이상 결합 차단 morpholinos의이 혜택은 그 엑손 제외 또는 intron 포함 역전사 (RT)으로 쉽게 평가 될 수 있다-PCR 및 크기 차이 젤에 시각. RT-PCR 및 젤 전기 이동 법 morpholino 효능 행해져야 한다 결정 표준 실험실 절차를 사용 하 여.
    1. 대상 유전자의 사전 mRNA 순서를 식별 합니다. NCBI 또는 합 intron-엑손 경계33결정을 통해 A. mexicanus 게놈에서 사용할 수 있는 정보를 활용 합니다.
    2. 엑손-intron (스플라이스 기증자) 또는 intron-엑손 경계 (스플라이스 수락자) 사이트 intron 포함 또는 exon 제외 대상.
      참고: spliceosome는 일반적으로 5' 스플라이스 사이트에서 intron 고 3' (U2 대상) intronic 스플라이스 사이트에서 "" AG 시퀀스에서 "서울 특별시" 시퀀스 (U1 대상) 대상. 정상적인 조건 하에서 spliceosome U1 및 U2 subunits이 대상 사이트를 적절 한 접합에 대 한 사전 mRNA 순서에 바인딩합니다. 그러나, 이러한 대상 시퀀스 중 하나는 morpholino에 의해 차단 된 경우는 spliceosome 이동 합니다 다음 사용 가능한 U1 또는 u 2 사이트에, mRNA 순서에서 intron 제외 또는 exon를 일으키는. 이것은 기획/최적화, 대상 유전자21의 특성에 따라 포함 됩니다. 일반적으로, 다음 사용 가능한 u 1 사이트는 exon 절단을 일으키는 원인이 되는 결합을 리디렉션합니다 내부 U1 사이트 차단. 스플라이스를 리디렉션할 다른 사이트가 있기 때문에 또는 intron 포함을 하면 첫 번째 또는 마지막 스플라이스 연결을 차단 합니다. 시퀀스 소프트웨어를 사용 하 여 다양 한 예외 포함 대의 효과 예측 하기. 예측 가능성 frameshifts 또는 조 정지 codons, mRNA 붕괴에 대 한 더 효과적인 대상 사이트를 나타내는 나타낼 수 있습니다.
    3. 대상 사이트를 식별 하는 일단 텍스트 편집기 또는 연구소도 서에 그것의 순서를 기록 합니다. 대상 사이트는 25 기초 쌍 (bp) 긴 다는 것을 확인 하십시오.
    4. 온라인 소프트웨어 (예: http://reverse-complement.com) 또는 수동 번역을 사용 하 여, 대상 시퀀스의 반전 보수 생성할. 텍스트 편집기 또는 연구소도 서에 그것의 순서를 기록 합니다.
    5. 역방향 보완 시퀀스 morpholino morpholino oligonucleotides 생성 하는 회사에서 주문. 샘플 회사 테이블의 자료 를 참조 하십시오.

2입니다. 주입에 대 한 Morpholinos

참고: 여러 농도 또는 양의 모 주입 주사를 최적 농도 설정 하기 위해 수행 필요 합니다. 일반적인 주사 수량은 400-800 페이지 모의 Morpholino 최저의 효과 최대 6 일 postinjection에 대 한 유지 수 있습니다.

  1. 재고 morpholino 얻을. 재고 morpholino 동결 건조 된 도착합니다. 원하는 사진 농도 (예를 들어, 4 mM)에서 사용 하 여 살 균 H2O 사전으로 그것을 하이드 레이트. -20 °C에서 사용까지 저장 합니다.

3. CRISPR gRNA 디자인, 생체 외에서 전사, 및 준비

  1. CRISPR gRNA 디자인
    참고: gRNAs 생성 되었다 이전 출판된 연구를 사용 하 여 Varshney 외.40 와 Wierson 외.41.
    1. 게놈 브라우저를 사용 하 여 관심사의 유전자의 코딩 영역을 식별 합니다. 20 bp 뉴클레오티드 대상 시퀀싱으로 시작 하는 GG에 대 한 검색 하 여 내는 exon gRNA 대상 시퀀스를 식별 하 고 팸 시퀀스 (NGG) 뒤 게놈 시퀀스를 사용 하 여. 시작 (ATG) 타겟이 될 것입니다 후 유전자의 지역.
      참고: 지금까지 유전자, 중 하나 또는 모두'G의 원하는 exon에 5' 끝에 GG와 대상 시퀀스를 찾을 수 없는 경우에 s 5'는 시퀀스의 끝에서 첫 번째 및 두 번째 뉴클레오티드에 대 한 교체하실 수 있습니다. 그러나, 두 개의 G's 이들은 T7 전사에 필요한 만큼 올리고에 통합 되어야 합니다.
    2. 디자인과 유전자 특정 oligonucleotide 주문 (올리고 a: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'). T7 발기인 순서 (빨간색)와 anneal 두 번째 oligonucleotide (파란색)을 하는 데 사용 하는 중첩 시퀀스 사이의 팸 시퀀스 없이 유전자 특정 20 bp gRNA 대상 시퀀스 (굵게 표시)을 추가 합니다. Anneal 및 증폭 (단계 3.2.1 참조)이이 올리고 A 두 번째 올리고 (올리고 b: 5'-GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTT AACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3') 필 사를 위해 사용 하는 gRNA 템플릿을 생성 하.
      참고: 올리고 B 모든 반응에 대해 동일 하 고 1x만 주문 필요.
  2. gRNA 준비 및 녹음 방송
    1. Anneal 고는 oligos를 증폭. 수율을 증가 하기 위하여는 gRNA 증폭 다음 뇌관을 포함: 5'-TAATACGACTCACTATA-3' (T7 뇌관) 및 5'-GATCCGCACCGACTCGGTG-3' (3' gRNA 뇌관). Thermococcus kodakaraensis (로그인) 중 합 효소를 사용 하 여 PCR을 수행 합니다.
      참고: 두 뇌관 올리고 A에 올리고 B 10 주기 것이 좋습니다 좋은 수확량을 위해. 자세한 프로토콜 Wierson 외41에서 찾을 수 있습니다.
    2. GRNA 상용 생체 외 녹음 장비 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 녹음 제조 업체'을 수정 이렇게 s 프로토콜 Klaassen 외.42에 의해 출판.
    3. 침전, 세척, 그리고 Klaassen 외.42에 의해 설명 된 대로 gRNA resuspend.
      참고: 있는 gRNA RNase 무료 물 저하를 방지 하기 위해 resuspended 해야 합니다.
    4. 분 광 광도 계를 사용 하 여 결정 될 수 있는 gRNA의 농도 기록 합니다. Agarose 젤에 2 µ L을 실행 하 여 RNA의 품질을 평가 합니다. 동결/동결 해제를 피하기 위해-80 °C까지 주사 직전에 그것을 저장 하는 aliquot RNA
  3. Cas9 준비 및 녹음 방송
    1. Cas9 mRNA 상용 생체 외 녹음 장비 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 복사할 수 있습니다 앞에서 설명한43. Nls-Cas9-nls 버전43을 사용 합니다.
    2. gRNA의 농도 기록 하 고는 agarose 젤에 2 µ L을 실행 하 여 그 품질을 평가. Aliquot RNA 분해를 여러 freeze-thaw 주기를 통해 발생-80 °c.에 aliquots를 저장 하지 않으려면

4. Tol2 구문, Tol2 transposase, 및 transgenesis의 준비

  1. 주입에 대 한 Tol2 transgene 구조를 준비 합니다.
    참고: 우리가 성공적으로 출판/사용할 수 zebrafish 활용 그리고 메 다카 A. mexicanus에서 생성. 이러한 구조는 순서 상 동의 높은 수준 때문에 A. mexicanus에서 완벽 하 게 기능 가능성이 (AddGene 저장소를 참조 하십시오 그리고 Zebrafish 정보 네트워크 [ZFIN] 데이터베이스를 사용할 수 있는 구문에 대 한). Zebrafish 발기인 조각에서 사용 될 때 예상된 조직에서 transgenes 표현 했다 A. mexicanus.
    1. Tol2 구조를 취득 하거나 생성 하 플라스 미드와 조직 특정 발기인, 원하는 transgene Tol2 팔 (관 외.44참조). 접수, 플라스 미드를 확인 하기 위해 구문 순서.
    2. midiprep'제조 업체에 따라 구문에 대 한 수행의 지침. Elute RNase 무료 H2O에서에서 최종 플라스 미드는 분 광 광도와 농도 결정, 100-농도 희석 300 ng /μL, 및 약 수 및 스토어-20 °c.에 구문
  2. Tol2 transposase 플라스 미드, 소화 그리고 mRNA 합성.
    1. Tol2 mRNA45를 생성 하기 위한 템플릿으로 Tol2 transposase 플라스 미드 (Pc-zT2TP)의 복사본을 가져옵니다.
    2. Midiprep Pc-zT2TP'제조 업체에 따르면 s 지침을 생성 합니다. RNase 무료 물 또는 버퍼 (~ 50 μ)의 낮은 볼륨에 elute. -20 °c.에 aliquots 저장
    3. 제한 효소를 사용 하 여 Tol2 플라스 미드를 소화.
      1. 표 1을 사용 하 여 원형 Pc-zT2TP 플라스 미드의 10 µ g에 제한 다이제스트를 수행 합니다.
      2. 분할 2-50 μ 반응으로 반응 하 고 37 °C에서 열 cycler에서 하룻밤 반응을 품 어.
      3. 다음 날, 65 °C 20 분 동안가 열 하 여 효소 비활성화.
      4. 상업적으로 이용 가능한 PCR 정화 키트 ( 재료의 표참조) 제조 업체' 지침 당을 사용 하 여 다이제스트 직후 선형화 플라스 미드 정화. RNase 무료 H2O의 15 μ에서 플라스 미드 elute 고는 분 광 광도 계를 사용 하 여 제품의 농도 결정 합니다.
      5. 소화 플라스 미드의 1 μ를 실행 하 고 1.5 %agarose 포경된 플라스 미드의 1 μ 선형화 플라스 미드 확인 하 젤.
    4. Tol2 mRNA의 생체 외 녹음을 수행 합니다.
      1. 전사에 대 한 템플릿으로 선형화 Pc-zT2TP 플라스 미드의 1 µ g를 사용 합니다. '제조 업체에 따라 생체 외 녹음 방송에 대 한 s 지침 ( 재료의 표참조) 표 2에 설명 된 대로.
      2. S 지침 37 °C에서'제조 업체 당 열 cycler에서 품 어.
      3. 37 °C에서'제조 업체 당 열 cycler에서 품 어, DNase의 1 µ L을 추가 s 지침.
      4. 리튬 염화 물 강 수 전사 키트 프로토콜 당 수행 합니다. RNase 무료 H2o. ~ 20-30 μ에 RNA 펠 릿 resuspend
      5. 분 광 광도 계를 사용 하 여 제품의 농도 결정 하 고 RNA 품질을 기록 합니다.
      6. ~ 100-300 ng / µ L을 약 수 제품을 희석을 피하기 위해 반복된 동결-해 동 5-10 μ 샘플으로. -80 °C에서 사용까지 그들을 저장 합니다.
        참고: 1-를 확인 하는 얼룩/밴드 젤 전기 이동 법에 대 한 정화 Tol2 mRNA의 2 µ L.

5입니다. microinjections

  1. 주사에 대 한 일반적인 도구 준비
    참고:이 섹션의 절차에서는 Kowalko 외.46에 의해 상세히에서 설명 되었습니다 그리고 사소한 수정 개요는 여기에 제시.
    1. 쏟아지는 따뜻한 3% agarose 100ml 페 트리 접시에 생선 시스템 물에 용 해 하 여 주입 접시를 생성 합니다. 신중 하 게 우물 물고기 계란에 대 한 수 있도록 갓 부 agarose 계란 사출 금형 장소. 금형의 측면에 45° 각도에서 천 하 고, 다음, 천천히 agarose;으로 그것을 낮은합니다 각도에서 몰드를 천천히 낮추는 공기 금형 아래 갇혀 점점 피할 수 있습니다. 부드럽게는 agarose 경화 되 면 금형을 제거 합니다. 번호판, 봉인, 4 °C 최대 1 주일에 저장 수 있습니다.
    2. 당겨 바늘 주입'제조 업체에 따라 전극/바늘 끌어당기는 사람에 대 한 붕 규 산 유리 모 세관에서 s 지침. 이 프로토콜 당 피 펫 끌어당기는; 달라 집니다. 그러나, 샘플 바늘 당기 프로그램 표 3에서 찾을 수 있습니다.
      참고: 최적화 바늘은 주사, 바늘 너무 긴 것 이다 구 부 보다는 깔끔하게 계란을 관통 하는 중요 하다.
    3. 오프닝은 계란에 대 한 충분히 큰 그래서 표준 유리 펫을 끊어서 계란 전송에 대 한 큰 구멍 유리 펫을 확인 합니다. 분 젠 버너를 사용 하 여 부드러운 때까지 불꽃에 깨진된 펫의 끝을 노출 하 여 유리의 깨진된 끝 폴란드어.
  2. 번 식 설정
    참고: A. mexicanus번 식에 사용 되는 많은 다른 프로토콜 있습니다. 자세한 프로토콜에 대 한 Borowsky39를 참조 하십시오. 번 식 설치 주사 전에 1 주 시작 합니다.
    1. 하루에 1, 2 ~ 3 명의 여성 및 3 ~ 4 남성에에서 배치 24 ± 1 °c.에 유지 단일 10 갤런 탱크
    2. 7, 1-일에 ~ 3 배 하루에 먹이 증가. 라이브 음식, 검은 벌레와 소금물 새우 등을 포함 하는 다이어트를 확인 하십시오.
    3. 6 일에 27 °C. 실험실 탱크 온도가 다를 수 있습니다;로 설정 단일 탱크 히터 추가 따라서,이 2-3 °C 상대 일반 탱크 온도를 증가 될 것입니다.
    4. 하루 7, 사출 밤의 저녁 (zeitgeber [ZT] 9-11)는 저녁에 철저 하 게 물에 젖은 스폰지와 탱크를 청소 하 고 어떤 과잉 음식 든 지 또는 좋은 메쉬 그물을 사용 하 여 파편 또는 싸이 펀을 제거 합니다.
    5. 7 일의 밤에 ZT15에 표면 물고기 계란에 대 한 검사 시작 하 고 계속 해 서 ZT18까지 30 분 마다 15-를 확인 합니다. Cavefish, ZT17에 계란에 대 한 검사를 시작 하 고 계속 해 서 ZT20까지 30 분 마다 15-를 확인.
      참고: 시간 기반 14시 10분 h 빛: 다크 주기 zeitgeber 시간을 사용 하 여. 번 식 시간 추정 되며 개별 실험실 정확한 시간을 결정 해야 합니다. 그것은 곧 후 발표/단일 셀 단계에서 그들을 투입 하기 위하여 수정 된 달걀을 수집에 중요 한.
  3. 단일 셀 단계 계란의 컬렉션
    1. 번 식으로 예상 된다 밤 탱크 매 15-30 분 및 탱크의 바닥에 계란에 대 한 모니터를 검사 합니다. 계란 나타납니다 반투명, 직경에 있는 대략 1 밀리미터를 측정.
    2. 좋은 메쉬 물고기 그물을 사용 하 여 계란을 수집 하 고 신선한 생선 시스템 물으로 채워진 유리 그릇에 그들을 전송. 계란 계란 1 셀 단계에 되는지 확인을 현미경으로 검사 합니다.
    3. 유리 펫을 사용 하 여 단일 셀 계란 주입 격판덮개 전송. 유리 펫은이 단계에서 처럼 계란 플라스틱에 충실 합니다.
    4. 섹션 5.1 agarose 주입 접시의 우물에 계란을 풀어 신중 하 게는 피 펫을 사용 하 여. 계란의 최대 수 (실 온)에서 prewarmed 주입 접시의 행 채우기 (30-40 행, 당 및 5 행까지). 전체 행 주사 동안 이동에서 계란을 계속 도움이 됩니다. 계란 주사의 성능까지 작은 양의 물고기 시스템 물 주입 접시에 충분 한지 체크 해를 유지.
  4. 피코-주입 설치 및 일반 사출 최적화 지침
    1. 백필 중 젤 로드 피 펫을 사용 하 여 주사 바늘 팁 모 세관 또는 표준 micropipette 팁을 사용 하 고 2-4 µ L bolus 끝에 추가 안쪽에 맞는. 일단 바늘 가득 집게를 사용 하 여 주사 바늘에서 초과 길이 트림.
    2. Microinjections picoliter microinjector에 연결 하는 micromanipulator에 바늘을 사용 하 여 수행 합니다.
    3. 0.03 주입 시간 설정 및 ~0.0 psi에 밖으로 압력. 사출 압력 달라 집니다 따라 바늘 사이의 작은 차이와 최적화 ~1.0 nL 주입 bolus를 달성 하기 위해.
      참고: 사출 압력은 종종 ~ 10-30 psi의 범위에서.
    4. 미네랄 오일에 주입 된 bolus를 측정 하 여 사출 bolus 표준화 ~ 1-를 달성 하기 위해 슬라이드 마이크로 미터와 1.5 nL 주입 볼륨 크기. Bolus 볼륨을 늘리거나 사출 압력 (psi)를 조정 합니다.
    5. 연구소 조직을 사용 하 여 계란의 맨의 물을 그립니다.
      참고: Astyanax 계란 chorion 약간 강하다는 zebrafish 달걀 보다 관통 하는. 우리는 계란의 상단에서 물을 그리기 도움이 촉진 달걀으로 바늘 침투 찾으십시오. 플레이트 최적화 한 접시에 200 ~ 계란에 대 한 수 있습니다.
    6. 바늘, 각 계란을 관통 하 고 노 른 자에 직접 주입 하는 micromanipulator를 사용 합니다. 노른자위에 위치, 일단 넣기 버튼 또는 주입 발 페달을 눌러 계란을 주입.
      참고: 전체 접시 ~ 15 분 내에서 주입 수 있습니다. 단일 셀 무대 ~ 40 분 지속 됩니다.
  5. Morpholinos의 주입
    참고: morpholino 최저 독성을 유발 하지 않고 필요한 양의 유전자 대상; 당 최적화가 필요 합니다. 그러나, 400의 농도 세 시작 하는 좋은 장소입니다.
    1. 계란 당 morpholino의 400 페이지를 주입 됩니다 있도록 morpholino를 준비. Morpholino 얼음에 녹여 주입 솔루션 (원하는 농도)에서 morpholino, RNase 무료 H2O 또는 Danieau'의 구성 s 솔루션 및 페 놀 레드 (마지막 볼륨의 10%). 예를 들어, 표 4를 참조 하십시오.
    2. 1 주입 태아 당 nL.
  6. CRISPR 주사
    1. GRNA의 25 세에 총 Cas9 mRNA의 300 pg 태아 당 주입 됩니다 있도록 RNA를 준비. 샘플 CRISPR/Cas9 주입 혼합 표 5를 참조 하십시오.
    2. 2 주사 gRNA/Cas9의 nL 태아 태아에 직접 당 mRNA.
  7. Tol2 transposase 및 transgenesis에 대 한 Tol2을가지고 있는 플라스 미드의 주입
    1. 해 동 transposase mRNA와 얼음에 플라스 미드 Tol2. (25 ng / µ L)에서 결합 Cas9 mRNA, 원하는 Tol2 구문 (25 ng /μL), 및 RNase 무료 물에 페 놀 레드 (마지막 볼륨의≤10%). 샘플 Tol2 transgenesis 주입 혼합, 표 6참조.
    2. 주입 솔루션 및 mRNA의 저하를 방지 하는 얼음에 바늘을 유지. 1 주입 태아 당 볼륨에서 nL.

6. 양육 및 심사 물고기 주입

  1. 주입 된 생선 농업
    1. 계란은 주입 후 즉시 전송 그들 유리 그릇 (10 x 5 cm) ~ 200 mL 물고기 시스템 물로 가득. 계란은 쉽게 주입 접시 가득 그릇에 담거 서 씻어 서 물고기 물과 달걀을 피 펫을 rinsing.
    2. 그릇 당 50 ~-80 주입된 태아를 놓고 22-24 °c.에 리어
    3. 주입 된 물고기 2 그릇 청소 죽은 태아를 제거 하 여 매일 물 ~ 20%를 변경할 하루 x.
    4. 추가 양육 이전 게시 프로토콜39에 따라 수행 됩니다.
  2. Morpholino 주입 개인의 심사
    1. 고기에 대 한 화면을 stereomicroscope에서 동물을 시각화. Morpholinos의 효과 ~ 5 일 postinjection21을 유지 수 있습니다.
    2. 4 일 postinjection에서 행동 고기를 측정 합니다.
  3. CRISPR indels에 대 한 심사
    1. 대상 사이트 genomic DNA를 증폭 하기 위하여 뇌관을 디자인 합니다. 대상 PCR 제품이 약 100-뇌관 디자인 125 bp.
      참고: 예를 들어 oca2 로커 스에 대 한 gRNA 대상 사이트를 둘러싼 지역 증폭 되었다 앞으로 뇌관 5'-CTCCTCTGTCAGGCTGTGC-3를 사용 하 여 '와 역방향 뇌관 5'-GAAGGGGATGTTGTCTATGAGC-3'의 PCR 제품 길이 대 한 혈압.
    2. 배아를 희생 또는 기관 동물 프로토콜에 따라 클립 성인 물고기 지 느 러 미.
    3. PCR 튜브 배아 또는 해 부 지 느 러 미를 수집 하 고 DNA를 추출 하 고 유전자 특정 뇌관 엄마 외.35에서 찾을 수 있습니다 PCRs. 샘플 PCR 프로토콜을 수행.
    4. 5 실행 mutagenesis에 대 한 평가를 µ L 70 V 3 h. 야생-타입 (nonmutagenized) DNA에서 3 %agarose 젤에 PCR 제품의 독특한 밴드 PCR 제품에서 발생 합니다. 돌연변이 DNA 젤에 더럽혀진 밴드에서 발생 합니다.
    5. 돌연변이 체 대립 유전자의 순서를 확인 하려면 TA'제조 업체에 따라 PCR 제품을 복제 s 지침 선택 식민지, 및 miniprep 문화. 시퀀싱에 대 한 결과 DNA를 보냅니다.
    6. 설정 하 고 돌연변이 체 대립 유전자를 전송 하는 물고기의 라인을 유지, 야생-타입, 생선과 화면 5-는 자손의 다음 단계 6.3.1-6.3.6 유전자의 돌연변이 체 대립 유전자를 수행 하는 경우 확인 하려면 10 배아를 성인 주입 된 물고기를 교차.
      참고: 동일한 F0 설립자 물고기에서 다른 F1 개인 다른 돌연변이 수행할 수 있습니다. 돌연변이 라인 예측 프레임은 대립 유전자를 생산 하는 돌연변이를 시퀀싱 되 있는지 확인 합니다.
    7. 더럽혀진 밴드 분석 결과 (단계 6.3.1-6.3.6)를 사용 하 여 PCR에 의해 또는 돌연변이 야생-타입 밴드 (그림 2C) 증폭 것 이다 대립 유전자 특정 PCR 뇌관 설계 하 여 돌연변이 체 대립 유전자를 운반 하는 물고기를 식별.
    8. 물고기의 라인 설립 되 면, homozygose 돌연변이 체 대립 유전자를 열성 고기에 대 한 테스트.
  4. 유전자 변형 긍정적인 개인에 대 한 심사
    참고: 형광 메이커를 포함 하는 구문을 사용 하 여 유전자 변형 긍정적인 개인에 대 한 심사를 간소화 하도록 것이 좋습니다. 그러나, 표준 PCR 검사 방법을 사용할 수 있습니다 전송에 대 한 화면으로.
    1. 빠르면 2 일 postinjection, 범위를 해 부하는 epifluorescence와 F0 물고기에서 조직 관련 형광 단백질을 시각화 합니다.
      참고: F0 애벌레에 식은 모자이크, 그리고 긍정적인 개인 다양 한 식 고기를 할 수 있습니다.
    2. 창립자 물고기 F0 으로 긍정적인 개인을 유지.
    3. F0s 도달 성숙, backcross 같은 인구/연구소 주식에서 파생 하는 nontransgenic 개인 창립 물고기. 화면 F1 아들 아 단계 6.2에서에서 설명한 대로 동일한 프로토콜을 사용 하 여
      참고: F1 애벌레에 식 유니폼 이며 F1 형제 간의 일관성을 보장 합니다.
    4. Tol2 통합 사이트 중재 이며 통합 설립자 마다 다를 수 있습니다, 선택 F1 형제 파생 된 단일 F0 설립자 고 긍정적인 표현 F1 형제 F2s 생성을 견디며. 이 자손 안정적인 라인에 대 한 기초가 될 것입니다.

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결과

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동굴 주거 A. mexicanus 의 여러 인구 감소 수 면과 깨어/활동 그들의 표면-주거 conspecifics14상대적 증가 보여줍니다. Hypocretin/orexin (HCRT)는 깨어 증가, 높은 보존된 neuropeptide 이며 HCRT 통로에서 착오 발생 narcolepsy 인간과 다른 포유류47,48에. 우리는 이전 그 동굴을 증명 하고있다 A. mexicanus 이 펩 티이 드의 증가 식 cavefish38수 면의 손실을 기초 수 있습니다 제안 하는 HCRT 펩 티 드의 식을 증가 했다. Hcrt 식의 모 최저 직접 중재 cavefish 수 면의 손실 증가 hcrt 식의 효과 조사 하기 위한 강력한 접근 방식을 제공 합니다.

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토론

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여기, 우리는 morpholinos, CRISPR/Cas9 유전자 편집, transgenesis 방법론을 사용 하 여 유전자 기능을 조작 하기 위한 방법론을 제공 합니다. 유전자 기술의 부와 제 브라에서 이러한 시스템의 최적화 이러한 도구를 쉽게52와 A. mexicanus 에 이전 하면 가능성이 있습니다. 최근 연구 결과 A. mexicanus를 이러한 방식을 사용 하지만 그들은이 시스템30,,3642 에 다양 한 형태학, 발달, 및 행동 특성 조사에 충분히 남아 , 53.

Morpholinos는 최저 유전자 표현의 zebrafish 연구에 널리 사용 되어 왔습니다. 접근 손쉬...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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저자는 유전형에 oca2 돌연변이 물고기 그림2 이미징 그녀의 지원에 대 한 Sunishka Thakur 감사 합니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (NSF) 수상 1656574 A.C.K., NSF 상을 조 앤을 A.C.K., 1754321 및 국립 보건원 (NIH) 수상 R21NS105071 A.C.K. 및 E.R.D.에 의해 지원 되었다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Fish breeding & egging supplies
Fine mesh fish netPenn PlaxBN4
어항 히터Aqueon100106108
Egg 트랩맞춤형NA계란을 보호하기 위해 탱크 바닥에 놓을 플라스틱 화격자 디자인 및 생성
유리 피펫 Fisher Scientific13-678-20C
피펫 전구Fisher Scientific03-448-21
Agarose Fisher ScientificBP160-500
난형적응형 과학 도구TU-1
Morpholino 용품
Control MorpholinoGene Tools, LLC표준 제어 olio
사용자 정의 MorpholinoGene Tools, LLCNA
페놀 레드시그마 AldrichP0290-100ML
CRISPR 공급
Cas9 플라스미드AddGene46757
GoTaq DNA 중합효소PromegaM3001
KOD 핫 스타트 TaqEMD Millipore71-842-3
프라이머통합 DNA 기술맞춤형
T7 메가스크립트 키트Ambion/ThermofisherAM1333
miRNeasy 키트Qiagen217004
mMessage mMachine T3 키트Ambion/ThermofisherAM1348
MinElute 키트Qiagen28204
Tol2 형질전환 공급
pCS-zT2TP 플라스미드Kawakami et al., 2004선임 저자
CutSmart BufferNew England BiolabsB7204
NotI-HF 제한 효소New England BiolabsR3189
PCR 정제 키트Qiagen28104
SP6 mMessenger KitAmbion/ThermofisherAM1340
Microinjection supplies
Glass Capillary TubesSutter InstrumentsBF100-58-10
피펫 풀러Sutter InstrumentsP-97
Picoinjector워너 인스트루먼트PLI-100A
마이크로 매니퓰레이터월드 정밀 머신M3301R
마이크로 매니퓰레이터 스탠드월드 정밀 머신M10
마이크로매니퓰레이터 베이스월드 정밀 기기강판 베이스, 10 lbs
의 요청

참고문헌

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