발암 물질 유발 Murine 방광 종양의 자기 공명 영상 평가

방광 암은 다섯 번째 가장 일반적인 암 전반적으로, 약 80000 새로운 사례 및 미국 2017¹에서에서 16000 죽음에 대 한 책임. 약 30 년 후 방광 암²의 조직의 치료에 상당한 진보가 없이, 최근 안티-PD-1과 반대로 PD L1 검사점 억제제 시험 고급 환자에서 흥미진진 하 고 때때로 튼튼한 응답 증명 urothelial 암^3,,45. 그러나, 환자의 단지 대략 20%는 이러한 치료에 대 한 객관적인 응답을 표시 하 고 추가 연구 immunotherapy 방광 암 환자에서의 효과적인 사용을 확장 하는 데 필요한.

Murine 방광 암 모델 소설 치료^6,7의 전 임상 평가 있는 중요 한 도구입니다. 때 다른 치료에 쥐 randomizing 종양 크기를 제어 하기 위해 종양 부담 평가 및 치료 그룹 간의 제어 수 해야 합니다. 이전 연구는 사용 초음파 또는 생물 발광 orthotopic 셀 라인 기반 방광 암 모델^8,9,,1011. 그러나, 두 기술을 몇 가지 단점을 제시. 초음파 측정 운영자의 능력에 의해 좌우 될 수 있다 하 고 3 차원 기능 및 높은 공간 해상도 부족. 생물 발광 방법만 종양 세포의 반 정량적 인 평가 제공할 수 있습니다 및 방광 해부학 및 형태학의 시각화에 대 한 허용 하지 않습니다. 또한, 생물 발광 라인 기반 모델, 털이 없는 쥐 또는 백색 외 투를 가진 쥐에 발광 유전자를 표현 하는 셀만 사용할 수 있습니다.

다른 한편으로, 정확한 시각화를 가능 하 게 조직 대비의 광범위 한 범위와 종양 짐의 양적 평가 전시, 고해상도 해 부 이미지의 수집에서 고유한 융통성을 제공 하는 자기 공명 영상 (MRI), 발광 특성을 표현 하는 필요 없이 미스터 이미지 적절 한 분석 파이프라인 보다 쉽게 재현할 수 있으며 방광의 3 차원 시각화를 보장. MRI의 가장 큰 한계는 검사 및 높은 처리량 분석을 제한 하는 관련 된 높은 비용에 필요한 시간의 길이. 그러나, 몇몇 연구는 미스터 시퀀스 효과적으로 감지 하 고 모니터링 셀 라인 기반 방광 종양; 하는 데 사용할 수 있는 높은-품질 진단 이미지를 제공할 수 있습니다. 따라서, 그들은 높은 처리량 분석^9,12사용할 수 있습니다.

여기, 우리는 안정적이 고 효율적으로 쥐에 발암 물질 유발 방광 종양의 특성을 비-침략 적 미스터 기반 방법 설명. 이 위해 우리를 사용 하 여 빠른 이미징 기술로 안정 상태 선행 씨 (진실한 FISP), 높은 품질 및 높은 공간 해상도 (~ 100 미크론) 제공 하는 동안 짧은 스캐닝 세션을 보장 하 탐지 및 방광의 측정에 대 한 종양¹³. 또한,이 비-침략 적 MRI 분석 결과의 정확성을 확인, 병 적 확인 종양 단계 뿐만 아니라 MRI 파생 된 매개 변수 및 방광 무게 비보 전 사이의 상관 관계를 설명 합니다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 노스웨스턴 대학에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. BBN와 종양의 유도

1. 각 최소 6 주 오래 된 남성 C57/BL6 마우스를 얻을.
   참고: 남성 쥐 보다 신속 하 고 일관 되 게 여성 쥐^14,15보다 방광 암 개발.
2. 식 수에 0.05%의 복용량 N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) 아민 (BBN)을 추가 합니다. 불투명 용기에 저장 하 고 광고 libitum 마우스¹⁶을 식 수로 제공.
   참고: 발암 물질¹⁷떨어집니다 BBN 솔루션 분명 컨테이너에 저장.
3. 두 번 주당 0.05 %BBN 물을 변경 합니다.
4. 혈 뇨, 회사 방광 및 대 중을 포함 하 여 방광 종양과 관련 된 고민의 흔적을 검사 하 여 동물을 모니터링 합니다. 마우스 두 번 주당 또는 현지 IACUC 지침에 따라 검사 합니다.
5. 종양 노출¹⁸16 고 24 주 사이 개발을 기대 합니다.

2. MRI 설치

1. 살 균 염 분의 피하 주사를 수행 (0.1-0.2 mL 25-27 G 바늘과 1 mL 주사기를 사용 하 여) MRI 방광 충전 물을 촉진 하기 전에 10 분.
2. 100% O₂ 와 isoflurane (2%-4% 필요에 따라)의 가스 혼합물으로 각 마우스 anesthetize 진행 하기 전에 철수 반사 (발가락 핀치)을 테스트 하 여 마 취의 적절 한 평면을 확인 합니다. 메 마른 눈 연 고는 동물에 적용 됩니다.
3. 흡입된 isoflurane (0.5%-3%)의 납품을 위한 nosecone와 복 이미징 홀더를 마우스를 전송 합니다.
4. 체온과 호흡 생리 기록 컴퓨터에 연결 된 직장 온도 프로브를 사용 하 여 모니터링 합니다.
   참고: 정상 체온 (36-37 ° C) 동물 미스터 홀더에 내장 된 반복 뜨거운 물 회로 사용 하 여 유지 됩니다. 온도 직장 센서를 통해 측정 하 고 전용된 생리 적 모니터링 소프트웨어를 사용 하 여 생리 적 모니터링 컴퓨터에 기록. 같은 시스템은 공기 베개 흉 곽 및 3-리드 심전도 전극을 통해 배치를 통해 측정 호흡 및 심전도 신호를 기록 하는 데 사용 됩니다. 호흡 신호도 MRI 수집 트리거링 및 호흡 모션와 관련 된 아티팩트를 줄이기 위해 사용 됩니다.

3. MRI 이미지 수집

1. 여기에 대 한 구적 몸 코일을 사용 합니다.
2. 신호 관심 영역에서의 최적화 된 검색을 사용 하도록 스캔 되는 마우스의 더 낮은 복 부에 4 채널 수신기 코일을 배치 합니다.
3. 트라이-축 집합이 전체 마우스 시체의 이미지를 얻으려고 통합된 이미징 소프트웨어를 통해 자동 조정을 시작 합니다. 이 참조 이미지의 집합에서 (이 경우에는 방광 지역)에 대 한 관심의 영역을 식별 합니다.
4. 방사능 프레임의 참조를 사용 하 여 축, 코로나, 그리고 화살 비행기 따라 직교 슬라이스 이미지의 3 세트를 취득 합니다.
5. 미스터 매개 변수가 시퀀스 (통합된 이미징 소프트웨어의 기능 중 하나로 포함) 이미징 진실한 FISP 활용: TR 900 = 밀리초, 테 2 ms, FA = = 70, 14 평균.
   참고:이 매개 변수이 집합에 T1/T2 가중치를 포함 하 여 높은 진단 품질을 가진 빠른 영상에 대 한 수 있습니다 < 마우스 마다 10 분.
6. 공간 해상도 슬라이스 두께 통합된 이미징 플랫폼의 그래픽 인터페이스를 통해 사용자가 선택한 형상 매개 변수에 의해 결정 됩니다. 조각의 시리즈 0.148 m m-평면 해상도 0.5 m m 두께의 전체 방광에 걸쳐 발생합니다.

4. 미스터 이미지 분석

1. 0.5 m m 두께의 조각, 비행기에 해상도 전체 방광을 덮고 0.148 m m의 집합을 식별 합니다.
2. 의료 이미지 분석 소프트웨어 분석 형식에 해당 이미지 폴더를 선택 하 여 내보냅니다.
3. 생성 된 이미지를 통해 스크롤 및 방광 벽의 루멘 시각화 수 있는 방광의 중간점에서 슬라이스를 식별 하 여 정량 분석에 대 한 방광의 센터에서 "대표 축 보기"를 선택 합니다.
   참고: 센터 조각 최대 직경을 선택한 것 이어야 한다.
4. 신중 하 게 윤곽을 그리 다 관심 (ROI) 영역 (즐_밖으로) 방광의 외부 가장자리 주위에 방광의 (즐에서_에) 내부 루멘 경계를 수동으로 추적 하 여 ( 그림 2에 도식 하 고 대표적인 그림 참조) 선택 된 대표 축 보기.
5. 방광 벽의 면적을 계산 하기 위해 외부 가장자리에서 내부 루멘을 뺍니다.
   구_벽 즐_밖으로 -즐에_에 =
   참고: 없는 종양으로 제어 방광의 표면적 방광 종양과 그 보다 작은으로 예상 된다.

5. 안락사와 방광의 해 부

1. BBN 노출의 20 주 후 현지 IACUC 지침에 따라 표준 운영 절차를 사용 하 여 마우스를 안락사.
2. 70% 에탄올과 절 개 지역을 청소 후를 잡고 집게와 복 벽 피부를 리프트.
3. 중간 절 개 음모 관절에서 칼 프로세스를 확인 합니다.
4. 급격히 집게로 파악 하 고가 위 incising에 의해 복 막 구멍을 incise.
5. 중간 낮은 복 부에 있는 방광을 식별 합니다.
6. 식별 하 고 배꼽 및 복 벽에 연결 하는 방광의 돔 메디아 탯 줄 인 대를 잘라.
7. 포 셉 countertraction를 제공 하 여 해 부 구조, 정액 소포, 직장, 및 지방 질을 포함 하 여 주변에서 방광과 방광의 돔 파악.
8. Ureters는 방광을 입력을 식별 하 고 방광 가까이 위로 잘라.
9. Cephalad 리프팅 방광, 요도가 위로 잘라 고 방광을 제거 합니다.
10. 즉시 PBS와 rinsing 후 방광의 무게.

6. 더 방광 조직 검사

1. 실 온 (RT)에서 36-48 h에 대 한 10% 중립 버퍼링된 말린 방광 조직을 수정 했다.
2. 파라핀 구획에서 조직의 포함, 다음 시험에 대 한 슬라이드를 잘라내어 hematoxylin와 오신 현미경 검사에 대 한 슬라이드를 얼룩^19,20위에서 설명한 대로.
3. 낮은 마우스 방광의 현미경 검사 수행 (2.5 x 및 10 x)와 높은 (20 x와 40 x) 확대, 거시적인 병 변, 증식, 암 제자리에서갑, 젖꼭지 종양, 및 침략 신생¹⁹ 에 대 한 검토 ^{, 21}.

(그림 1) 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 방광 종양 C57/B6 남성 생쥐에서 유도 했다. MRI 16 주에 수행 하 고 쥐 20 주에 안락사 되었다. Ex vivo 방광 (BW)에 대 한 가중치 각 마우스 기록 되었다. 슬라이드는 hematoxylin와 오신, 스테인드 했다 그리고 모든 조직학 슬라이드 종양 단계를 검토 했다.

미스터를 사용 하 여 종양 부담 분석, 방광 벽 내부 루멘 (즐에서에) 방광 벽 외부 루멘 (즐밖으로) (구벽) 방광 벽의 두께 계산 하에서 공제 되었다 (그림 2). 대표 진실한 FISP 미스터 이미지, 방광 벽 3 차원 복원 및 컨트롤 마우스 (즉, 종양)의 pathologic 이미지에에서 표시 됩니다 그림 3A-F, 그리고 큰 종양을 가진 쥐 그림 3G-L에 표시 됩니다.

MRI에서 파생 된 매개 변수 즐벽 상관 약하게 비보 전 BW (rs = 0.37, p = 0.009; 그림 4)입니다. MRI 파생 즐벽 매개 변수 및 BW 데이터의 검사 종양 단계와 연결을 보여 줍니다 (Kruskal-월리스 테스트 MRI p = 0.0003, 그림 5A; BW p = 0.0006; 그림 5B), 근육을 침략 방광 암 및 근육 침 윤 성 방광 암으로 병 리를 stratifying 때 연결 물론 (맨-휘트니 U 테스트 MRI p = 0.0002, 그림 5C; BW p < 0.0001, 그림 5D). 그림 5E즐벽 및 근육 침 습성 방광 암을 확인 하기 위해 BW의 성능은 보여 줍니다. 구벽 (AUC) 곡선 아래 면적 (AUC = 0.81, 95% CI 0.68-093) BW에 대 한 AUC 통계 비슷합니다 (AUC = 0.89, 95% CI 0.80-0.98, p = 0.30).

그림 1: BBN와 방광 종양 유도 및 MRI와 안락사의 타이밍에 대 한 스키마. BBN은 관리 광고 libitum 식 수에 0.05%의 농도에. 마우스는 16 주에 MRI를 받 다. 쥐 20 주에 안락사는 고 각의 방광 immunohistochemistry와 검사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 구벽 및 해당 윤곽선으로 대표 씨 이미지 방법의 도식 그래픽 묘사. MRI 이미지의 강도 사용 하 여 방광의 외부 벽은 확인 하 고 개요 (즐밖으로) 빨간색으로 그려 했다. Hyperintense 방광 루멘 (즐에서에), 녹색에서 설명 했다 그리고 해당 방광 루멘 지역 했다. 이 두 양의 빼기 나왔고 해당 그래픽 이미지에서 밝은 회색 디스크 하 구벽 매개 변수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 대표 진실한 FISP 미스터 이미지, 방광 벽 3 차원 복원 및 컨트롤 마우스 (즉, 종양)의 pathologic 이미지 (A-F)와 큰 종양 (G-L)를 가진 쥐. 아니 종양과 마우스의 (A) 대표 씨 이미지. (B) 방광 벽 지역 (구벽), 빨간색, 설명의 세분화 (BLA에서에서) 방광 루멘 (즐밖으로) 외부 방광 벽 사이의 영역으로 정의 됩니다. (C) 즐벽 방광을 통해 모든 슬라이스를 정의 하 여 생성 된 컨트롤 마우스에서 방광 벽의 3 차원 렌더링입니다. 녹색 화살표는 2 차원 이미지를 3 차원 렌더링 변환에 방광을 설명 합니다. (D) 컨트롤 마우스에서 즐벽 의 컷 아웃의 3 차원 렌더링입니다. (E) 낮은 전력 (2.5 x)와 같은 마우스 방광의 (F) 고 출력 (10 배) 이미지. 큰 종양을 가진 쥐의 (G) 대표 씨 이미지. (H) 방광 벽 지역 (구벽), 빨간색, 설명의 세분화 (BLA에서에서) 방광 루멘 (즐밖으로) 외부 방광 벽 사이의 영역으로 정의 됩니다. (I) 3 차원 렌더링 큰 종양을 가진 쥐의 방광 벽의. 큰 종양, 방광을 통해 모든 조각에서 즐벽 을 정의 하 여 생성 된 마우스의 방광의 컷 아웃 (J) 3 차원 렌더링. 녹색 화살표는 2 차원 이미지를 3 차원 렌더링 변환에 방광을 설명 합니다. (K) 낮은 전력 (2.5 x)와 같은 마우스 방광의 (L) 고 출력 (10 배) 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: MRI 파생 즐벽 사이 마지막 방광 무게 Spearman 상관. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: 비교 pathologic 무대와 MRI 파생 된 매개 변수 47 쥐에서 구벽 의. (A) 모든 pathologic 단계와 MRI 즐벽 (Kruskal-월리스 테스트)의 비교. (B) 모든 pathologic 단계와 방광 무게 (Kruskal-월리스 테스트)의 비교. (C) 비-근육-침략 적 방광 암 (단계 ≤T1)와 MRI 즐벽 (맨-휘트니 U 테스트) 근육 침 윤 성 방광 암 (단계 ≥T2)의 비교. (D) 근육을 당신의 방광 암 (단계 ≤T1)과 근육 침 윤 성 방광 암 (단계 ≥T2) 방광 무게 (맨-휘트니 U 테스트)와 비교. MRI에서 파생 된 방광 지역 및 최종 방광 근육 침 윤 성 방광 암 (단계 ≥T2) 결정에 무게의 (E) ROC 곡선입니다. 나열 된 p-값은 두 AUCs의 차이입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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