방법 논문

포스트스테인링 방법을 통해 폴리아크릴아미드 겔에서 망고 태그RNA의 형광 시각화

DOI:

10.3791/59112

⸱

2019년 6월 21일

 ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서 우리는 RNA 망고 aptamers I, II, III, 또는 IV로 태그된 RNA를 이미지화하기 위해 민감하고, 신속하며, 차별적인 포스트 겔 염색 방법을 제시하고, 네이티브 또는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 겔을 사용한다. 표준 PAGE 젤을 실행한 후 망고 태그RNA는 TO1-Biotin으로 쉽게 염색한 다음 일반적으로 사용할 수 있는 형광 리더를 사용하여 분석할 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

네이티브 및 변성 폴리아크릴아미드 겔은 리보뉴클레오프로테인(RNP) 복합 이동성을 특성화하고 RNA 크기를 측정하기 위해 일상적으로 사용됩니다. 많은 젤 이미징 기술이 비특이적 얼룩 또는 고가의 형광공 프로브를 사용하므로 민감하고 차별적이며 경제적인 젤 이미징 방법론이 매우 바람직합니다. RNA 망고 코어 서열은 임의RNA 줄기에 의해 폐쇄될 때, 관심 있는 RNA에 간단하고 저렴하게 추가될 수 있는 작은(19-22 nt) 서열 모티프이다. 이 망고 꼬리표는 TO1-Biotin에게 불린 티아졸 오렌지 형광공 리간드에 높은 친화력 및 특이성과 결합합니다, 결합시 수천 배 더 형광이 됩니다. 여기서 우리는 망고 I, II, III 및 IV가 고감도를 가진 겔에서 RNA를 구체적으로 이미지화하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 네이티브 겔에서 RNA의 62.5 fmol과 변성 겔에서 RNA의 125 fmol만큼 적은 30 분 동안 칼륨 및 20 nM TO1-비오틴을 포함하는 이미징 버퍼에 겔을 담가 검출 할 수 있습니다. 우리는 총 세균 RNA의 복잡한 혼합물의 맥락에서 망고 태그가 달린 6S 세균 RNA를 이미징함으로써 망고 태그가 지정된 시스템의 특이성을 입증합니다.

서론

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망고는 티아졸 오렌지(TO1-Biotin, 도 1A)의 단순 유도체에 단단히 결합하는 4개의 작은 형광 RNA aptamers 세트로 구성된 RNA태깅 시스템(TO1-Biotin, 도 1A)1,2,3 . 결합시, 이 리간드의 형광은 특정 압타머에 따라 1,000-4,000배 증가한다. 망고 III에 대한 망고 시스템의 높은 밝기는 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 초과, RNA 망고 aptamers의 나노 몰 바인딩 친화도와 결합, 그것은 이미징 및 RNA의 정제 모두에 사용할 수 있습니다 단지2,4.

망고 I 5, II6및 III7의 X선 구조는 고분해능으로 결정되었으며, 세 압타머 는 모두 RNA 사중 플렉스를 사용하여 TO1-Biotin을 결합합니다 (도1B-D). 세 압타머의 컴팩트 코어는 컴팩트 어댑터 모티프를 통해 외부 RNA 서열로부터 분리됩니다. 망고 I 및 II 둘 다 임의의 RNA 양면에 그들의 망고 코어를 연결하는 유연한 GNRA 같이 루프 어댑터를 이용합니다 (그림1B,C). 대조적으로, 망고 III는 망고 IV의 구조가 현재 알려져 있지 않은 동안, 임의의 RNA 나선 (그림1D,보라색 잔류물)에 코어를 연결하는 단단한 트리플렉스 모티프를 사용합니다. 이들 각 aptamers의 리간드 결합 코어는 이러한 헬리컬 어댑터에 의해 외부 RNA 서열로부터 분리됨에 따라, 그들은 모두 단순히 다양한 RNA에 통합될 수 있는 것으로 보인다. 세균6S 조절 RNA(망고 I), 효모 스플리세오좀(망고 I) 및 인간 5S RNA, U6 RNA 및 C/D scaRNA(망고 II 및 IV)의 성분이 모두 이 방식으로 성공적으로 태그가 지정되어 2,8,많은 것을 시사합니다. 생물학적 RNA는 RNA 망고 압타머 시스템을 사용하여 태그가 지정될 수 있다.

변성 및 네이티브 젤은 일반적으로 RNA를 연구하는 데 사용됩니다. 치수화 겔은 종종 RNA 크기 또는 RNA 처리를 판단하는 데 사용되지만, 전형적으로, 북부 블롯의 경우, 예를 들어, 이미지를 생성하기 위해 몇 가지 느리고 순차적인 단계가 필요하다. RNA 시금치 및 브로콜리와 같은 다른 RNA 형광 압타머는 젤 이미징9에 성공적으로 사용되었지만 현재까지 는 망고 시스템의 높은 밝기와 친화성을 가지고 있지 않으며 상당한 관심을 가지고 있습니다. 망고의 젤 이미징 능력을 조사하기 위해. 이 연구에서는, 우리는 RNA 망고 시스템이 TO1-Biotin의 여기 그리고 방출 파장 (각각 510 nm 및 535 nm)이 대부분의 형광에 일반적인 eGFP 채널에 있는 화상 진찰을 위해 적당하기 때문에, 단순히 젤 화상 진찰에 확장될 수 있었다는 것을 궁금했습니다 겔 스캐닝 계측.

여기에 제시된 포스트 겔 염색 프로토콜은 망고 태그가 달린 RNA 분자를 네이티브 및 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 겔에서 특이하게 검출하는 신속한 방법을 제공한다. 이 염색 방법은 칼륨과 TO1-비오틴을 포함하는 완충제에 젤을 담그는 것을 포함합니다. RNA 망고 압태머는 G-사중플렉스 기반이며 칼륨은 이러한 구조를 안정화하는 데 필요하다. 최소한의 망고 인코딩 DNA 템플릿에서 전사 된 RNA를 사용하여 (프로토콜 섹션 참조), 우리는 간단하고 염색 프로토콜을 사용하여 네이티브 젤에서 RNA의 62.5 fmol과 RNA의 125 fmol을 간단하게 염색하여 간단하게 검출 할 수 있습니다. 일반적인 비특이적 핵산 얼룩과는 대조적으로(본명으로부터 SG라고 하는 물질 표참조), 우리는 총 태그가 없는 RNA의 고농도가 샘플에 존재하는 경우에도 망고 태그가 지정된 RNA를 명확하게 식별할 수 있다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 시약의 준비

  1. TO1-비오틴 포스트염색액(젤 염색용액)
    1. 1 M Na2 HPO 4의 1M의 342 mL 및 1 M NaH2 PO 4의 158 mL을 추가하여25°C에서 pH 7.2에서 1M 인산염 완충액을 확인하였다. 적절한 인산염 용액을 추가하여 50 mM에서 pH를 7.2로 조정합니다. 0.2 μm 필터를 사용하여 멸균 필터를 사용하여 용액을 실온에서 플라스틱 용기에 보관하십시오.
    2. 다음과 같이 5x 젤 염색 용액(TO1-Biotin 제외)을 준비합니다. ddH 2O의 247.5 mL, 1M KCl의 700 mL, 1 M 인산완충제(pH 7.2) 50 mL, 그리고 2.5 mL의 트웬 20을 혼합하여 1L 용액을 구성한다. 0.2 μm 필터를 사용하여 멸균 필터를 플라스틱 용기에 보관하십시오. 실온에서 보관할 수 있습니다.
      참고: MgCl2는 잠재적으로 RNA 복합체를 안정화시킬 수 있으므로 필요한 경우 이 솔루션에 추가할 수 있습니다. 이것은 형광 신호 2에 적당한 영향을미칠 것입니다.
    3. 1.1.2 단계에서 5x 젤 염색 용액을 사용하여 1x 젤 염색 용액을 만들고 사용하기 직전에 TO1-Biotin 불소 불소 (재료 표참조)로 보충하여 최종 농도20 nM으로 보충하십시오. 예를 들어, 탈이온수 80 mL에 5x 젤 염색 용액 20 mL을 추가하여 1x 젤 염색 용액 100 mL을 만들고 1 mMTO1-Biotin 스톡 2 μL을 추가합니다(디메틸포마미드로 제조).
      참고: 500 nm에서 TO1-비오틴 염료의 소멸 계수는 63,000 M-1~cm-1이며, 염색 용액1에서측정된다.
  2. 변성 페이지 (2 x 변성 젤 로딩 솔루션 및 용액 A, B, C, 황산 암모늄, 및 테트라메틸레틸렌디아민)
    1. 포르마미드 40 mL, 0.5 mm 의 0.5 ml 의 0.5 ml (EDTA, pH 8.0) 및 9.5 mL ddH2O를 혼합하여 2x 변성 겔 로딩 용액의 50 mL을 준비합니다. 용액은 실온에서 보관할 수 있습니다. 로딩 염료는 형광화상진상구를 모호하게 할 수 있으므로 이 솔루션에 첨가되지 않습니다.
    2. 다음과 같이 2x 변성 겔 로딩 염료를 준비합니다. RNA 및 DNA 올리고뉴클레오티드를 정화할 때, 브로모페놀 블루(BB)와 0.5 mL의 브로모페놀 블루(BB)와 0.5 mL의 2.5%(w/v) 자일렌 시안놀(XC)을 단계 1.2.1에 기재한 용액에 추가하고, 9.5mL 대신 ddH2O의 8.5 mL를 추가한다. 용액은 실온에서 보관할 수 있습니다.
    3. 200.2 g의 요소(분유 중량: 60.06 g/mol)를 계량하고 40% 19:1 아크릴아미드:N,N'-메틸렌네비사클라미드의 312.5 mL에 추가하여 용액 A의 100 mL을 준비합니다. 용해 될 때까지 최대 속도로 자기 교반 막대로 저어 (약 3 시간) ddH2O.를 사용하여 500 mL에 용액을 구성하십시오. 깨끗한 플라스틱 제품에 4 °C에서 보관하십시오.
    4. 400.4 g의 우레아를 계량하여 용액 B의 1 L을 준비하고 ddH2O로 1 L에 대한 용액을 구성; 우레아가 녹을 때까지 저어줍니다. 용액 B는 실온에서 보관할 수 있습니다.
    5. 다음과 같이 솔루션 C(10x 트리스-보레이트-EDTA[TBE])를 준비합니다. 트리스 베이스 432g과 붕산 220g의 무게를 측정하고, 8(여과)의 pH로 0.5M EDTA의 160mL를 추가하고 ddH2O로 4L에 대한 용액을 만들어 10x TBE의 4L을 준비합니다. 이 버퍼의 큰 주식은 젤 실행 버퍼로도 사용되기 때문에 만들어집니다.
    6. 10% 황산암모늄(APS)을 4°C에서 ddH2O. 저장소의 총 부피10 mL로 APS 1 g을 용해시킴으로써 준비한다.
    7. 테트라메틸레틸렌디아민(TEMED)을 편리하게 보관하세요. APS 용액과 함께 4°C에서 보관하십시오.
  3. 네이티브 페이지(2x 네이티브 젤 로딩 솔루션)
    1. 100% 글리세롤 25 mL, 5x 젤 염색 용액 10 mL, ddH2O 15 mL을 혼합하여 50 mL의 2x 네이티브 젤 로딩 용액을 50 mL를 준비하여 50 mL로 용액을 구성합니다.
      참고 : 변성 젤 섹션에서와 같이, 로딩 염료는이 주식에 추가 될 수 있지만, 그 추가는 잠재적으로 젤의 형광 신호를 모호하게 할 수 있으므로 피해야한다.

2. 변성 젤의 준비 및 적재

  1. 표1을 따라 적절한 비율로 변성 겔을 준비한다. 특정 겔 주조 시스템을 고려; 30 mL 젤은 일반적으로 사용됩니다. 적절한 겔 백분율은 표 2를사용하여 추정할 수 있습니다 : BB 및 XC 염료가 관심 있는 RNA보다 각각 더 빠르고 느린 운동성을 가지는 폴리아크릴아미드 백분율을 선택하여 관련 크기에서 높은 대역 분리를 보장합니다. 범위.
  2. 표 1에 따라 액약 A, B 및 C를 혼합하고 겔을 붓기 직전에 APS 및 TEMED를 첨가합니다. 깨끗한 플라스틱 제품에 솔루션을 잘 섞는다.
  3. 모든 성분이 꼼꼼하게 깨끗한지 확인 한 후 적절한 젤 주조 장치에 젤 용액을 붓습니다. 젤이 부을 때 젤이 약간 기울어지도록 장치의 한쪽면을 들어 올려 젤 자체에 끼워지는 기포를 피하십시오.
  4. 원하는 빗을 삽입하고 중합 (약 30 분)에 둡니다. 겔 웰 주위의 굴절 지수의 변화를 면밀히 관찰하여 중합을 관찰합니다. 1x 용액 C (1x TBE)를 사용하여 젤 탱크를 만들고 조심스럽게 빗을 제거하십시오. 주사기를 사용하여 시료 로딩 직전에 우물을 흡인합니다.
  5. 다음과 같이 변성 샘플을 준비합니다. 관심 있는 RNA 샘플에 2x 변성 겔 로딩 용액을 추가하여 열순환기 또는 수조를 사용하여 95°C에서 변성 겔 로딩 용액을 1x 및 열 변성으로 만듭니다.
  6. 샘플을 로딩하기 전에 터치가 식을 때까지 몇 분 간 공기를 식힙니다. 젤 로딩 팁을 사용하여 각 우물의 바닥에 층을 겹쳐서 샘플을 로드합니다.
    참고 : 둥근 팁은 1mm 두께 이상의 젤에 사용할 수 있습니다. 얇은 젤에 플랫 팁을 사용하십시오.
  7. 실온에서 변성 젤을 실행합니다. 젤 시스템의 유리 판이 깨지지 않도록 와트량이 충분히 낮습니까?
    참고 : 우리의 실험실에서, 20cm x 16cm 플레이트에 대한 28 W는이 목적을 위해 충분했다.

3. 네이티브 젤의 준비 및 로딩

  1. 표3을 참조하여 적절한 비율로 네이티브 젤을 준비합니다. 특정 젤 주조 시스템을 고려, 하지만 명심 30 mL 젤 일반적으로 사용 됩니다. 표3에 따라 1x TBE, 40% 29:1 아크릴아미드:N, N'-메틸렌네비사크릴라미드 및 글리세롤의 용액을 혼합하고, 젤을 붓기 직전에 APS와 TEMED를 첨가합니다. 단계 2.3 및 2.4에 설명된 대로 진행합니다.
  2. 관심 있는 RNA 샘플에 2x 네이티브 겔 로딩 솔루션을 추가하여 네이티브 샘플을 준비하여 용액을 1x로 만들고 완전한 RNA 폴딩을 보장하기 위해 겔을 실행하기 전에 100분 동안 실온에서 배양할 수 있도록 하십시오.
  3. 4°C 의 차가운 방에서 기본 젤을 실행하여 와트수만으로도 젤을 가열하지 않도록 합니다.
    참고 : 우리의 실험실에서, 20cm x 16cm 플레이트에 대한 14 W는이 목적을 위해 충분했다.

4. 런오프 T7 전사에 의한 RNA 제제

참고: RNA 망고 구조의 유출 전사10에 사용되는 DNA 서열은 상업적으로 주문되었다. 이 방법에서, 전사되는 서열과 T7 프로모터의 역보체(RC)를 함유하는 DNA 올리고뉴클레오티드는 T7 프로모터 상부 가닥 서열로 혼성화되고 이어서 시험관내에서 전사된다. 아래, 각 올리고뉴클레오티드에 대해, 망고 코어 서열의 RC는 대담하게 도시되고 T7 프로모터 영역의 RC는 기울임꼴로 도시된다. 일반 글꼴의 잔류물은 망고 코어가 제대로 접히도록 하는 데 필요한 임의의 상호 보완적인 헬리칼 영역에 해당합니다.

망고 I: GCA CGT ACT CTC CTC TCC GCA CCG TCC CTT CGT ACG TGC TGCTA 태그 TGA GTC GTA TTA AAG
망고 II: GCA CGT ACT CTC CTC TTC CTC CTC TCC TCT CCT CGT ACG TGCTA 태그 TGA GTC GTA TTA AAG
망고 III: GGC ACG TAC GAA TAT ACC ACA TAC CAA TCC TTC TT CGT TGC TGCTA 태그 TGA GTC GTA TTA AAG
망고 IV: GCA CGT ACT CGC CTC ATC CTC ACC ACT CCC TCG GTA CGT GCC TAT AGT 개그 TCG TAT TAA AG
T7 상단 가닥: CTT TAA TAC GAC TCA CTA 태그 G

  1. DNA 올리고뉴클레오티드의 준비 젤 정제
    1. 0.2 μmol 스케일 DNA 합성을 위해, ddH2O의 100 μL 및 2x 변성 로딩 염료의 100 μL에서 보호되지 않은 DNA 올리고뉴클레오티드를 다시 중단한다(단계 1.2.2로부터). 이 때, 1.2.2단계에서와 동일한 농도로 로딩 용액 내의 겔 로딩 염료를 포함하는 것이 바람직하다.
    2. 적절한 폴리아크릴아미드 백분율의 50 mL 예비 척도 변성 겔을 이용하여 DNA 올리고뉴클레오티드를 정제하는; 표 2를 사용하여 젤 백분율을 선택합니다. 예를 들어, 50 nt 서열에 대해 8% 겔을 사용한다. 이상적으로, 브로모페놀 블루는 올리고뉴클레오티드보다 더 빨리 실행되어야 하며, 자일렌 시안올은 느리게 실행되어야 한다.
      참고 : 우리의 실험실에서, 이러한 젤은 두께 1.5mm의 주조 스페이서와 2-2.5 cm 폭의 우물과 젤 로딩 빗을 사용하여 캐스팅되었다.
    3. 단계 2.4-2.7에 기재된 바와 같이, 준비 겔 당 4.1.2단계에서 제조된 DNA 올리고뉴클레오티드 액의 100 μL을 로드한다.
    4. 조심스럽게 젤의 외부를 건조 유리 판을 제거하고, 플라스틱 랩에 젤의 양쪽을 커버. 형광 이미징 스크린(불소로 함침된 알루미늄 지지 얇은 층 크로마토그래피 플레이트는 경제적인 해결책)에 놓고 단파장 UV 핸드 헬드 램프를 사용하여 UV 섀도우로 DNA 밴드를 시각화합니다.
    5. DNA 합성이 고품질인 경우 선명하고 잘 정의된 그림자를 관찰해야 합니다. 영구 마커를 사용하여 플라스틱 랩에 밴드를 표시합니다.
      참고: 자외선으로부터 피부와 눈을 보호하고 노출을 짧게 유지하여 핵산 시료를 손상시키지 않도록 하십시오.
    6. 깨끗한 유리 판에 젤을 놓고, 표시된 밴드를 조심스럽게 잘라내고 각 겔 조각을 300 μL의 400 μL에 놓습니다. 실온에서 회전을 사용하여 밤새 DNA를 용해시다.
    7. 깨끗한 원심분리기 튜브에서 용리액을 회수하고 2.5 상당의 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시합니다. 소용돌이를 잘 하고 튜브를 -20°C에서 30분 동안 놓는다.
    8. 4 °C에서 30 분 동안 156,000 x g에서 벤치 상부 원심 분리기에 샘플을 펠렛. 조심스럽게 상류를 제거하고 ddH2O. 분광광도계를 사용하여 DNA 올리고뉴클레오티드 농도를 정확하게 결정하십시오. 샘플을 -20°C에서 편리하게 10 μM 스톡으로 보관하십시오.
  2. RNA 샘플의 전사 및 젤 정제
    1. 40 mM의 최종 농도로 구성된 액체 NTP 주식을 혼합하여 5x 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP) 주식을 준비 (GTP, 11,400 M-1~cm-1),25 mMSM 사이티딘 트리포스페이트 (CTP, 7,600 M-1~1 cm-1),25mM 아데노신 삼인산 (ATP, 5,000 M-1~cm-1),및 10 mM 우리딘 트리포스페이트 (UTP, 10,000 M-1~cm-1); 260 nm의 모든 소멸 계수.
      참고 : 액체 또는 분말 주식은 상업적으로 얻을 수 있습니다. 분말에서 1 차 주식을 준비하는 경우, 조심스럽게 1 M NaOH를 사용하여, 7.9의 최종 pH로 pH를 조정합니다. 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에 육수를 알리쿼트하고 -20°C에 보관한다.
    2. 10x T7 전사 완충제 스톡 100 mL을 1M Tris-HCl의 25.6 mL, 1 M Tris-HCl의 14.4mL, 1 M MgCl 2의 26 mL, 10% 트리톤 X-100의 10 mL, 및 0.637 g의 스페르미딘을 혼합하여 준비한다. ddH2O를 추가하여 100 mL의 최종 볼륨에 주식을 구성합니다.
      참고: 1x 용액의 7.9의 최종 pH는 교정된 pH 미터를 사용하여 확인되어야 합니다. 10x는 멸균 여과되어 -20°C에서 적당한 크기의 aliquots에 보관해야 합니다.
    3. 다음과 같이 전사를 수행합니다.
      1. 다음 시약을 추가하여 10x T7 전사 완충제 스톡 및 ddH2O(단계 4.2.2부터), 10mMMM의 디티오트레이톨(DTT), 1 μM T7 상부 가닥 서열을 사용하여 1x T7 전사 완충제의 최종 농도를 구성한다(섹션 4 참고 서열), 1 μM 겔 정제 망고 DNA 서열 (단계 2.1), 및 T7 RNA 폴리머라제 효소 (1 U/μL).
      2. 소용돌이, 스핀다운, 용액을 37°C에서 2시간 동안 또는 흐리게 될 때까지 배양하고 튜브 의 바닥에 백색 침전물 형태가 형성된다. 50 μL 전사는 겔 정제 후 ~ 50 μM RNA의 50 μL을 초래한다. 동일한 부피의 2배 변성 염료를 첨가하고 젤 정제가 준비될 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
    4. 겔-DNA에 대한 RNA 샘플을 치대체하는 4.1.2\u20124.1.8 단계에 의해 DNA 올리고뉴클레오티드 겔 정제 부에 기재된 바와 같이 생성된 RNA를 정제한다.
      참고: RNA는 RNase 분해에 매우 민감하므로 모든 단계에서 장갑과 깨끗한 실험실 코트를 항상 착용하십시오. 모든 시료를 RNase 오염으로부터 보호하기 위해 일회용 플라스틱 제품에 준비및 보관하고 사용하기 전에 뜨거운 비누와 물로 조심스럽게 유리 판을 세척하고 ddH 2O로 철저히 헹구고 유리 제품을 건조시고 유리 제품을 건조시고 스퀴즈 병에서 적용 된 에탄올의 도움.
    5. 최종 RNA 샘플의 1 μL을 사용하고 액적 기반 분광광도계를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 결정합니다. 가장 가까운 이웃 방법에 의해 결정된 소멸 계수를 사용하여, RNA 농도를 계산하고 편의를 위해 ddH2O로 시료 농도를 10 μM으로 조정한다. RNA 샘플을 -20°C에 저장합니다.
  3. 대장균 총 원유 핵산 추출
    참고: 다음 프로토콜이 예입니다. 이 프로토콜은 대장균의플라스미드로부터 내인성 발현 된 망고 I-태그 6S RNA를 사용하며, 이 플라스미드로부터의 유도는 상세4.
    1. 본 연구의 목적을 위해, pEcoli-RNA 망고 및 pEcoli-T1 플라스미드 둘 다에 대한 유도 된 세포의 500 mL을 준비하십시오 (세포는 1의 OD600nm에서 유도됩니다). 펠렛 세포를 사용하기 전에 -80°C에 보관하였다.
    2. 다음과 같이 RNA 추출을 수행합니다.
      1. 유도된 pEcoli 세포 펠릿의 0.5 mL를 취하고 평형 페놀 500 μL을 첨가합니다. 이어서, 시료를 소용돌이; 용액은 유백색이 될 것입니다. 최대 속도로 원심분리기를 2분 간 사용하여 레이어를 분리합니다.
      2. 약간 노란색이 될 상단 층을 추출하고 페놀, 원심 분리 및 총 5 배 (또는 불투명 한 흰색인 중간 층까지) 동일한 부피를 추가하여 4.3.2.1 단계를 반복하십시오.
      3. 페놀 추출 수성 부피를 클로로포름, 소용돌이, 원심분리기의 동일한 부피에 2분 동안 추가합니다.
      4. 수성 층을 추출하고 300 mM의 최종 농도에 NaCl을 추가합니다. 생성된 핵산을 2.5 등가의 에탄올, 와류, 스핀다운, 및 -20°C에서 30분 이상 침전시킴으로써 침전한다.
      5. 벤치 상부 원심분리기에서 15.6 x 1,000 x g에서 30분 동안 4°C에서 펠릿을 조심스럽게 제거하고 ddH2O의 100 μL에서 펠릿을 다시 놓습니다.
      6. 참조된 프로토콜11에따라 이 절차에 DNase I 소화 단계를 추가하여 총 RNA를 얻었다.
        참고 : 펠릿이 ddH2O에 완전히 용해 될 때까지 소용돌이.

5. 포스트 젤 염색

  1. 1.1.3단계의 레시피에 따라 1x 젤 염색 용액을 준비하고 젤에 편안하게 맞을 수 있을 만큼 넓은 깨끗한 유리 용기에 추가하십시오.
    참고 : 스냅 맞춤 뚜껑이있는 Borosilicate 유리 용기는이 목적을 잘 제공합니다.
  2. 용기에 충분한 1x 젤 염색 용액을 추가하여 젤이 용액으로 완전히 덮여 있고 궤도 회전자 위에 놓일 때 젤 의 상단에 액체가 슬로슈됩니다.
    참고: 용기는 젤을 충분히 넣을 수 있을 만큼 커야 이동이 간수하고 용기에 충분한 버퍼가 있어 젤을 완전히 덮을 수 있습니다.
  3. 네이티브 또는 치화 겔이 실행을 완료하면 (섹션 2 또는 3, 각각), 장치에서 젤을 제거하고 우물을 잘라. 분석의 후반부 방향에 대한 겔의 모서리를 제거하는 것이 유용할 수 있다.
  4. 5.2단계에서 제조된 1x겔 염색용액에 겔을 조심스럽게 옮김을 옮김.
    참고: 젤은 깨지기 쉽고 깨지기 쉽기 때문에 젤을 옮길 때주의하십시오. 젤을 오염시키지 않도록 항상 염색 용기에 뚜껑을 보관하십시오.
  5. 실온에서 30 분 동안 100rpm의 속도로 궤도 회전자위에 젤을 놓습니다.
    참고: 젤이 다시 접히지 않도록 하십시오. 그렇지 않으면 RNA가 겔에서 확산되어 젤의 다른 부분을 라벨로 지정할 수 있습니다.

6. 젤에 있는 화상 진찰 망고 태그 RNA

  1. 이미징 버퍼를 신중하게 디펜더합니다. 젤을 물로 빠르게 헹구고 충분한 액체가 남아 있어 젤을 용기에 약간 이동상태로 유지합니다.
  2. 젤을 이미저에 조심스럽게 옮김을 옮김. 조심스럽게 젤의 측면을 집어 와 이미저 트레이에 배치하여 전송; 또는, 젤을 트레이에 천천히 부을 수 있다. 젤 아래에 거품이 없고 젤 아래에 여분의 액체가 없는지 확인하십시오. 겔 위에 압연된 파이펫은 여분의 액체를 제거하는 데 유용할 수 있습니다.
    참고: 종이 타월을 사용하여 여분의 액체를 흡수하십시오.
  3. 겔 이미지를 가지고, 여기 파장 510 nm와 방출 파장 535 nm 사이의 형광을 관찰 (예를 들어, 520 nm 파장 형광 설정에서 녹색 빛 은 이미저에). 설정이 기기에서 완전히 최적화되어 있는지 확인하고 사용된 기기의 지침을 주의 깊게 따르십시오.

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결과

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짧은 망고 태그RNA는 프로토콜 섹션에 기재된 바와 같이 제조되었다. 변성 조건에서 형광이 젤에 있는 우레아의 존재 때문에 관찰하기 위하여 가장 어려울 것이라는 점을 가정하는, 우리는 먼저 핵산 denaturant로 작용하는 우레아에 망고 aptamers의 저항을 공부했습니다. 우리는 망고 aptamers가 대략 1 M (그림 2A)의 우레아농도까지 변성에 실질적으로 저항한다는 것을 것을을 발견했습니다. 변성 겔에 겔 염색 용액을 첨가하기 전에, 겔내의 우레아의 최종 농도는 6M. 이 농도를 1M로 감소시키기에 충분한 염색 용액을 첨가하면, 따라서, 4개의 압타머 모두에 대해 완전한 망고 형광을 보장하기에 최적이될 것이다. 실제로, 염색 프로토콜은 이 완전히 최적의 결과보다 적게 달성되었지만, 더 많은 염색 용액을 사용하거나 염색 중에 한 번 솔루션을 변경하는 간단한 편의에 의해 필요한 경우 이를 간단히 해결할 수 있습니다.

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토론

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망고 형광 태그의 중요한 장점은 단일 태그를 여러 가지 방법으로 사용할 수 있다는 것입니다. 이러한 aptamers의 높은 밝기와 친화력은 세포 시각화2뿐만 아니라 시험관 내 RNA 또는 RNP 정제4에도유용하게 만듭니다. 따라서 젤 이미징은 망고 태그의 다기능성을 간편하게 확장합니다. 망고 겔 화상 진찰 감도는 북부 얼룩14의 그것 보다는 약간 더 작습니다 그러나 RNA 견본의 60-120 fmol를 쉽게 검출할 수 있습니다, 길고 지루한 막 전송 및 탐사 단계를 필요로 하지 않고. 이는 겔15의작은 RNA에 대해 이전에 발견된 혼성화 기반 의 프로빙 효율과 비교할 수 있다. 다른 형광 aptamer 방법론 - 특히, RNA 시금치 - 더 큰 감도와 특이성을 가지고있지만9, 아무도 현재 동시에 단일 RNA 태그를 할...

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공개 사항

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망고 형광 시스템에 대한 특허출원 중입니다.

감사의 글

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저자들은 라즈반 코조카루와 아미르 압돌라자데의 기술적 지원과 원고를 증명해 준 레나 돌고시나에게 감사를 표한다. 이 프로젝트에 대한 기금은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)가 P.J.U.에 보조금을 운영함으로써 제공되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.8mm 두께의 빗 14 웰 30 mL PAGE 젤LabRepCo11956042
101-1000 µ 엘  팁Fisher02-707-511
20-200 µ L 낮은 유지  팁Fisher Scientific02-717-143
아크릴 아미드 : N, N'- 메틸렌 비스 아크릴 아미드 (40 % 19 : 1)생물 시약BP1406-1급성
독성 아크릴 아미드 : N, N'- 메틸렌 비스아크릴 아미드 (40 % 29 : 1)FisherBP1408-1급성 독성
한천아나케미아02116-380
알루미늄 백업 TLC 플레이트Sigma-Aldrich
Amersham Imager 600GE Healthcare Lifesciences29083461
과황산암모늄Biorad161-0700유해한
BL21 세포NEBC2527H
붕산ACPB-2940
브로모페놀 블루 나트륨 염시그마B8026-25G
ChloloformACPC3300
디티오트레이톨시그마 알드리치 알코올D0632-5G
DNase IThermoFisherEN0525
EDTA 디소듐 솔ACPE-4320
에탄올커뮤리얼 
플랫 젤 로딩 팁CostarCS004854
Formamide 99 %Alfa AesarA11076
스페이서 및 빗 세트LabRepCo41077017
유리 접시 플라스틱 뚜껑Pyrex1122963젤 조각에 맞을만큼 충분히 커야합니다
세롤Anachemia43567-540
HCl아나케미아464140468
ImageQuanTLGE Healthcare Lifesciences29000605
IPTGInvitrogen15529-019
KClACPP-2940
MgCl2Caledron4903-01
MgSO4Sigma-AldrichM3409
NaClACPS-2830
NaOHBDHBDH9292
궤도 회전 장치실험실 라인
페놀Invitrogen15513-039
라운드 젤 로딩 팁CostarCS004853
인산 나트륨 이염기성칼레드 론8120-1
인산 나트륨 일 염기성칼레드 론8180-01
SYBRGoldThermoFisherS11494
T7 RNA 중합효소ABME041
TEMEDSigma-AldrichT7024-50 ml
TO1-3PEG-비오틴 형광단ABMG955
트리스 베이스FisherBP152-500
트립톤FisherBP1421-500
트윈-20시그마P9496-100
요소피셔U15-3
크실렌 시아놀시그마X4126-10G
효모 추출물BioshopYEX401.500
1164840001트 P016EAAN 글리

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
  2. Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656(2018).
  3. Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
  4. Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
  5. Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807(2017).
  6. Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
  7. Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
  8. Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
  9. Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
  10. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  11. A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB. , Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
  13. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
  14. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
  15. Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).

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