여기, 우리 감자 식물을 변환 하는 데 두 프로토콜을 제시. Agrobacterium tumefaciens 변환 Agrobacterium rhizogenes 야생 타입 촬영 자체 전파 될 수 있는 유전자 변형 털 뿌리를 생성 하는 동안 완전 한 유전자 변형 식물에 지도 한다. 우리는 다음 변환 된 뿌리에 얼룩이 지 거 스 여 발기인 활동 감지.
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방법 논문
Agrobacterium tumefaciens 및 Agrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 Suberin 유전자의 발기인 활동
이 논문에서
요약
초록
Agrobacterium sp. 그것이 능력을 전송 하 고 식물의 게놈으로 통합 하는 그것의 자신의 T-DNA 유전자 변형 식물을 얻기 위해 가장 널리 사용 되는 방법 중 하나입니다. 여기, 선물이 감자 (푸른 풀밭 tuberosum) 식물 유전자 수정 두 변환 시스템. A. tumefaciens 변환에서 잎에 감염 하 고 변환 된 셀이 선택 된 새로운 완전 한 변환된 공장 18 주에 phytohormones를 사용 하 여 다시 생성 됩니다. A. rhizogenes 변환, 줄기에 바늘으로 박테리아를 주입 하 여 감염 하 고 새로운 등장된 변환된 털 뿌리는 빨간색 형광 마커를 사용 하 여 검색 한 변형 비 뿌리 제거 됩니다. 5-6 주, 결과 공장에서는 완전 개발된 변형된 털 뿌리는 야생 타입 촬영의 합성입니다. 바이오 매스를 증가, 변형 된 털이 뿌리는 excised 고 자체 전파 될 수 있습니다. 우리는 그것이 suberin 생 합성 유전자 발기인에 의해 주도 거 스 취재 원 유전자를 표현 하는 뿌리를 모두 Agrobacterium-중재 변환 방법 적용. 거 스 얼룩 절차 제공 되 고 발기인 유도의 셀 지역화를 수 있습니다. 두 방법에서 변형 된 감자 뿌리 거 스 GUS 활동 suberized endodermis와 exodermis, 그리고 또한, A. rhizogenes 변형 뿌리에 얼룩이 지기 옆 뿌리 출현에 감지 했다 보여주었다. 이 결과 A. rhizogenes 뿌리에 표현 되는 유전자 연구를 빨리 대체 도구가 될 수 있습니다 것이 좋습니다.
서론
경제 관심, 이외에도 유전자 변형 식물의 발생 유전자의 궁극적인 기능을 설명 하 고 이해 식물 생리학 및 개발 연구에 그것의 자신의 관련성을 있다. 가장 널리 사용 되는 방법 식물 DNA 삽입은 Agrobacterium-변화를 중재. Agrobacterium tumefaciens 그 종양 유도 (Ti) 플라스 미드의 행동에 의해 많은 식물 종의 감염된 조직에 크라운 혹을 생성할 수 있다. 플라스 미드는 식물 게놈에 통합 될 것 이다 조직 dedifferentiation1,2를 유도 하는 유전자의 세트와 함께 T-DNA 영역을 포함 합니다. 이 유전자는 transgene로 T DNA 내에서 교환 특정 공장 수정 피하 phenotypic 효력3의 생성을 허용 했다. Transgene T DNA로 복제를 촉진 하기 위하여 T-DNA 영역 Ti 플라스 미드의 유전자의 나머지 부분 동안 이진 플라스 미드 라는 독립적인 플라스 미드에 excised 되어 있다 (T DNA 전송 및 삽입 메커니즘을 수 있는 독성 유전자) 되었습니다 도우미 플라스 미드에 배치. 식물 생명 공학 연구에 대 한 A. tumefaciens
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프로토콜
A. rhizogenes 변환 프로토콜 적응 되었고 경적 외.7 에서 수정 되었고 유전자 테스트 S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. 데지레). A. tumefaciens 변환 프로토콜은 적응 배너 외.22 에서 수정 하 고 테스트 genotypes 했다 S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. 데지레) 및 미 tuberosum ssp. andigena. 두 절차의 주요 단계는 각각 그림 1과 그림 2에요약 됩니다.
참고: 전송 생체 외에서 수행 하는 절차의 모든 단계에서, 그렇게 하 고 가능한 경우, 접시 또는 냄비, 식물 시 들고 및 오염 방지 하기 위해 공기 노출 최소화를 유지 합니다. 모든 공장 외피 캐비닛의 어두운 20 ° C와 67 µmol m-1의 -1의 24 ° C 빛/12 h 12 h의 조건에서 수행 되었다. 층 류 후드에서 무 균 조건에서 모든 박테리아 조작 및....
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결과
Agrobacterium rhizogenes -감자 전이 중재
이 원고에 A. rhizogenes 와 변환된 루트를 설정 하는 단계별 절차를 제공 됩니다. 그림 1 는 전부 (완전 개발된 털 뿌리를 얻기에 A. rhizogenes 의 주입)에서 약 5-6 주 소요 절차의 개요를 제공 합니다. 다음, 식물 합성 (야생 타입 촬영, 유전자 변형 루트) 또는 유전자 변형 털이 루트 클론 excised 고 자율적으로 2% 자당으로 보충 하는 단단한 Gamborg B5 매체에 성장 수로 공부 될 수 있다. 또는, 털 뿌리 수 대규모 전파 액체 Gamborg b 5 미디어를 사용 하 여. 제시 하는 절차 S.......
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토론
감자, 안정 되어 있는 완전 한 유전자 변형 식물을 얻기 위해 가장 일반적인 시스템 변환 사용 하 여 organogenesis 외 인 phytohormones를 사용 하 여 필요한 Agrobacterium tumefaciens 종자로. Agrobacterium 기반 프로토콜 비 T DNA 벡터 시퀀스25통합 가능성이 있다, 하지만이 방법론 이며 쉬운 아직 덜 비싼 감자 식물을 변환 하는 데 사용할 수 있습니다. 지난 년 동안, A. rhizogenes에 관심-중재 변환 A. tumefaciens를 사용 하 여 보다 짧은 기간에 유전자 변형 뿌리를 허용에 대 한 연구자의 관심을가지고 있다. A. rhizogenes 는 아직도 phytohormone auxin 제어 및 시 토 키 닌 생 합성을 위한 효소를 암호화 하는 유전자의 집합을 전달 하는 유도 하는 루트 (Ri) 플라스 미드를 유지 하 고
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공개 사항
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
감사의 글
이 작품 정부의 드 Innovación y 많은 (AGL2009-13745, PB FPI 부여), 정부의 드 Economía y Competitividad 페더 (AGL2012-36725, AGL2015-67495-c 2-1-R), 자금 및 지로 나의 대학 (박사 학위 부여 SF, 그랜트를 지원 했다 SING11/1). A. rhizogenes , A. tumefaciens 긴장을 제공 하는 저자는 박사 디트로이트 Broer (토지 이용, 대학 로스 토크, 로스 토크, 독일 연구소) 및 박사 Salomé 프라 트 (센트로 나시오날 드 Biotecnología, 마드리드, 스페인)에 게 감사 각각, 및 박사 Marçal 순간 및 도움말 및 A. rhizogenes 변환 실험 시작에서 받은 지원에 대 한 박사 안 나 플 라 센 시아 (툴루즈 III 폴 Sabatier 대학-CNRS, 식물 연구 실험실 (LRSV), Castanet 돌 루 잔, 프랑스)입니다. 저자는 실험실 작업을 수행 하 고 돌보는 식물, Ferran Fontdecaba 및 지원 칼라 산체스의 일부 실험 하 고 있던 동안에 그녀의 귀중 한 도움에 감사 사라 고메스 (Departament de Biologia, UdG, 지로 나) 그들의 최종 학위 프로젝트입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세톤 | Panreac | 1.310.071.21 < | |
| p>아세토시링곤 < | p>아크로스 | 115540050 | |
| 수족관 펌프 | Prodac | MP350 | |
| Autoclave | Ragpa Strelimatic | ||
| 세균 한천 | Lab Conda | 1800 | |
| BAP | Duchefa | B0904 | |
| 쇠고기 추출물 | Lab Conda | < p>1700 | |
| 식물 성장 캐비닛 | Nuaire < | p> < | |
| p>카르베니실린 | Duchefa | C0109 | |
| Cefotaxime 나트륨 | Duchefa | C0111 | |
| DMSO | Merck | 1029310161 | |
| Ecotron infors | HT | 29378 | |
| 에탄올 | Merck | 1,009,831,011 < | |
| p>Falcon tube | Control tecnica | CFT011500 | |
| 페리시아네이트 | > 시그마 | 101001081 | |
| 페로시아네이트 | 시그마 < | p>100979088 | |
| 플라스크(직경 8.06cm, 높이 11.3cm) 및 체외 배양용 플라스틱 뚜껑 | Apiglass | ref16 | |
| GA3 < | p>Sigma | G7645 | |
| Gamborg B5 media | Duchefa | G0210 | |
| Gelrite < | p>Duchefa | < p>G1101 | |
| 글루코사 | 시그마 < | p>G5767 | |
| Kanamycin < | p>Sigma | K1377 | |
| Leukopor 테이프 | BSN Leukopor < | p>BDF47467 | |
| Lupe | Wild-Heerbrugg | M420 | |
| Magnetic shaker | Agimatic < | p>7000243 | |
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NaH2PO4 | Sigma < | p>58282 | |
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| Parafilm | < p>Anorsa | PRFL-001-001 | |
| 펩톤 | Lab Conda < | p>1616 | |
| 페트리 접시 (90 x 14) | Anorsa | 200200 < | |
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| 식물 한천 | Duchefa | P1001 < | |
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| 사각 플레이트(120 x 120) | Deltalab | < p>200204 | |
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| 설탕 < | p>Panreac | 131621 | |
| 수술용 칼날 | Swann-Morton | 201 | |
| 수술용 바늘 | NIPRO | 015/0204 | |
| Triptone < | p>Lab Conda | 1612 < | |
| p>Triton | Serva | 37240 | |
| Unimax 1010 shaker | Heidolph | > | |
| 진공 | Dinko | ||
| x-GlcA(5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt ancountus) | Biosynth < | p>B-7398 | |
| 효모 추출물 | Lab Conda | 1702.00.00 | |
| Zeatin riboside | Sigma | > 1001042850 |
참고문헌
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA's journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant facto....
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