프로토콜 셀 문화 supernatants 함께 사용 하기 위해 작은 extracellular 소포 (EV)에 표면 epitopes를 감지 하도록 설계 된 재현 방법을 설명 합니다. 그것은 항 체를 표면 항 원 CD9, 인식 CD81 그리고 CD63, 함께 하는 비즈를 사용 하 여 특정 EV immunoprecipitation 활용. 메서드는 다운스트림 흐름 cytometry 분석에 최적화 되어 있습니다.
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방법 논문
Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Cytometry (FC)는 세포 표면 항 원 표시의 반 정량적 측정에 대 한 선택의 방법입니다. 최근,이 기술은 exosomes (엑 소)를 포함 하 여 말 초 혈액과 다른 체액에 extracellular 소포 (EV)의 phenotypic 분석을 위해 사용 되었습니다. EV의 작은 크기 명령 주위 검출 임계값을 갖는 전용된 기기를 사용 하 여 50-100 nm. 또는, EV FC에 의해 검출 될 수 있는 라텍스 microbeads에 바인딩할 수 있습니다. Microbeads, EV 관련 마커/클러스터 차별화 CD63, CD9, 및 CD81 인식 하는 항 체와 활용을 사용할 수 있습니다 EV 캡처. CM에서 고립 된 엑 소 ultracentrifugation에 의해 또는 사전 농축 하지 않고 분석할 수 있습니다. 이 접근은 기존의 FC 악기를 사용 하 여 EV 분석에 적합 합니다. 우리의 결과 형광 강도 의미 (MFI) 값과 EV 농도 사이의 선형 상관 관계를 보여 줍니다. 극적으로 쥡니다 통해 EV를 방해 MFI는 방법 막 파편을 검색 하지 않습니다 나타내는 감소. 우리 보고 어떤 실험실에서 쉽게 구현할 수 있는 EV 표면 항 원 분석에 대 한 정확 하 고 신뢰할 수 있는 방법.
서론
세포에는 세포 외 소포 (EV) microvesicles (MV) 및 exosomes (엑 소)를 포함 하 여 다양 한 크기의 분 비. 후자는 구분할 수 MV에서 크기와 근원의 subcellular 구획. MV (크기에 200-1000 nm)는 부모 세포에서 원형질 막에서 흘리기에 의해 해제 됩니다. 반대로, 엑 소 (30-150 nm) endosomal 막에서 발생 하 고 세포 막1,2multivesicular 시체 (MVB) 퓨즈 때 세포 외 공간으로 해제 됩니다.
EV는 점점 사용 진단 바이오 마커 뿐만으로, 잠재적으로, 종양학, 신경학, 심장학, musculoskeletal 질환3,,45등 많은 분야에서 치료 도구. 치료제의 체 외 배양된 세포의 세포 조절 매체 (CM)에서 소포 악용으로 EV를 사용 하 여 지속적인 연구의 대다수. 여러 문맥에서 유익한 효과 발휘 하는 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 그리고 MSC 파생 EV 심근 국 소 빈 혈 또는 reperfusi....
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프로토콜
1. 수집 및 바른된 미디어의 처리
- PBS에서 0.02% 돼지 피부 젤라틴 55 cm2 페 트리 디쉬 코트.
- 7 mL Iscove의 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM)의 하 20 보충 CPC (8000/cm2) 미리 코팅 요리에서 접시 %FBS (태아 둔감 한 혈 청)과 1% 페니실린/스 (P/S).
참고: 기간 "클릭 당" 언급 된 인간의 explant 파생 셀에 다른14설명. CM은 특정 문화 조건에서 경작 하는 다른 세포 유형에서 수집할 수 있습니다. 장갑을 착용 하 고 생물학 후드 작동. - 셀에 대 한 도달 80% 합류, 문화 매체를 제거, 세척 셀 두 번 Dulbecco의 PBS (PBS) Ca-, Mg-무료 하 고 혈 청 무료 엑 소 생산 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 [DMEM] 높은 포도 당, 4.5 g/mL)의 10 mL와 함께 그것을 대체.
참고: 점차적으로 셀 세럼 무료 조건 (SF)에 맞게 문화 매체에서 혈 청 농도의 진보적인 감소로 진행 합니다. 셀에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 민감한 FBS를 포함 하는 매체를 준비 하지만 EV의 고갈. 모든 영....
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결과
단일 얼룩에 대 한 입자의 총 수
이후 하나의 구슬 하나 이상의 입자를 바인딩할 수 있습니다, 우리 MFI 곡선의 초기 지 수 단계에 도달 총 EV (관 당 단일 항 체)의 작은 금액을 설정 하는 다른 조건을 테스트. 항 체의 고정된 농도 2.5 x 10 5 x 105 에서 배열 했다 입자의 총 수 하는 동안 사용 되었다8. 그림 3A, 항 체는 허용 MFI 내에서 수행 되도록 우리가 수 있는 입자의 수와 같이 1 x 108 입자/얼룩은 EV의 과잉 사용을 피하고.
항 체 적정
.......액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
기존의 FC 기술을 마커 EV의 표면에 표현 하는 가장 간단한 분석 방법에 남아 있다. 이와 관련, 가장 적합 한 프로토콜을 선택은 악기 감도 인해 한계를 방지 하 여 개별 입자의 분수에 대 한 유용한 정보를 얻을 중요 합니다. 우리 엑 소 및 다운스트림 FC 응용 프로그램에 대 한 적당 한 작은 EV 표면 항을 인식 하는 항 체와 결합 하는 자기 입자를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 우리 확인 방법을 사용 하 여 두 개의 서로 다른 세포 유형: 기본 인간의 CPC 심장 질환;에 대 한 엑 소-기반 치료 접근에 대 한 주요 셀 소스로 떠오르고 있다 그리고 HEK293 세포, 신뢰할 수 있는 세포 성장 및 소성 세포 생물학 연구에서 널리 이용 되는 불멸 하 게 셀 라인.
메서드는 ultracentrifuge 농축 EV에 적용할 수 있는 하 고, 빠른 분석을 위해 또한 생체 외에서 직접 세포 유래 CM 없이 사전 농축과 ultracentrifugation에 의해. 시작 자료 샘플을.......
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공개 사항
아무것도 선언입니다.
감사의 글
앨라배마는 헬무트 호르 텐 재단 및 Velux 재단, 취리히 (스위스)의 연구 보조금에 의해 지원 되었다. G.V. 스위스 국립 과학 재단, 세실리아-오 거 스타, 루가 노, 재단과 SHK 재단에 Herz-und Kreislaufkrankheiten (스위스)의 연구 보조금에 의해 지원 되었다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, 유세포 분석기 플랫폼 | , Beckman Coulter | CytoFlex, | |
| DMEM, 고포도당, HEPES, 페놀 레드 | 없음 Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco의 PBS(PBS) Ca- 및 Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 캡처 키트 | , JSR Life Sciences, | Ex-C63-SP | |
| ExoCap, CD81 캡처 Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 항체 | 바이오레전 | 드 312104 RRID: AB_2075894 | |
| 유세포 분석기 분석 소프트웨어 | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight 소프트웨어 | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE 항인간 CD81 (TAPA-1) 항체 | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15140122 | |
| 써모믹서 C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 로터 |
참고문헌
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15(2011).
- Yadav....
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재인쇄 및 허가
