Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름

요약

프로토콜 셀 문화 supernatants 함께 사용 하기 위해 작은 extracellular 소포 (EV)에 표면 epitopes를 감지 하도록 설계 된 재현 방법을 설명 합니다. 그것은 항 체를 표면 항 원 CD9, 인식 CD81 그리고 CD63, 함께 하는 비즈를 사용 하 여 특정 EV immunoprecipitation 활용. 메서드는 다운스트림 흐름 cytometry 분석에 최적화 되어 있습니다.

초록

Cytometry (FC)는 세포 표면 항 원 표시의 반 정량적 측정에 대 한 선택의 방법입니다. 최근,이 기술은 exosomes (엑 소)를 포함 하 여 말 초 혈액과 다른 체액에 extracellular 소포 (EV)의 phenotypic 분석을 위해 사용 되었습니다. EV의 작은 크기 명령 주위 검출 임계값을 갖는 전용된 기기를 사용 하 여 50-100 nm. 또는, EV FC에 의해 검출 될 수 있는 라텍스 microbeads에 바인딩할 수 있습니다. Microbeads, EV 관련 마커/클러스터 차별화 CD63, CD9, 및 CD81 인식 하는 항 체와 활용을 사용할 수 있습니다 EV 캡처. CM에서 고립 된 엑 소 ultracentrifugation에 의해 또는 사전 농축 하지 않고 분석할 수 있습니다. 이 접근은 기존의 FC 악기를 사용 하 여 EV 분석에 적합 합니다. 우리의 결과 형광 강도 의미 (MFI) 값과 EV 농도 사이의 선형 상관 관계를 보여 줍니다. 극적으로 쥡니다 통해 EV를 방해 MFI는 방법 막 파편을 검색 하지 않습니다 나타내는 감소. 우리 보고 어떤 실험실에서 쉽게 구현할 수 있는 EV 표면 항 원 분석에 대 한 정확 하 고 신뢰할 수 있는 방법.

서론

세포에는 세포 외 소포 (EV) microvesicles (MV) 및 exosomes (엑 소)를 포함 하 여 다양 한 크기의 분 비. 후자는 구분할 수 MV에서 크기와 근원의 subcellular 구획. MV (크기에 200-1000 nm)는 부모 세포에서 원형질 막에서 흘리기에 의해 해제 됩니다. 반대로, 엑 소 (30-150 nm) endosomal 막에서 발생 하 고 세포 막^1,2multivesicular 시체 (MVB) 퓨즈 때 세포 외 공간으로 해제 됩니다.

EV는 점점 사용 진단 바이오 마커 뿐만으로, 잠재적으로, 종양학, 신경학, 심장학, musculoskeletal 질환^3,,45등 많은 분야에서 치료 도구. 치료제의 체 외 배양된 세포의 세포 조절 매체 (CM)에서 소포 악용으로 EV를 사용 하 여 지속적인 연구의 대다수. 여러 문맥에서 유익한 효과 발휘 하는 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 그리고 MSC 파생 EV 심근 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해⁶ 및 뇌 부상⁷모델에서 혜택 나타났습니다. MSC 파생 EV는 또한 치료-내 화 이식-비교-호스트 질병⁸모델에서와 같이 면역 제거 치료에 악용 될 수 있는 면역 modulatory 활동 전시. 양수 내 유체 줄기 세포 (hAFS) 적극적으로 풍요롭게 CM MVs와 엑 소, heterogeneously 배포 크기 (50-1000 nm), 차별화 된 셀, 신생 혈관, 섬유 증, 억제의 확산 등의 여러 생물학적 효과 중재 하 고 cardioprotection⁴. 우리 것으로 나타났습니다 최근 EV, 그리고 엑 소 특히, 인간의 심장에서 파생 된 조상 세포 (엑 소-클릭 당)에 의해 분 비 쥐^5,9에서 심근 경색 크기를 감소 시키기.

엑 소 공유 tetraspanins (CD63, CD81, CD9) 등 중요 한 조직 적합성 복잡 한 그들의 표면에 단백질의 공통 된 종류 I (MHC-나). 단백질의이 공통 집합, 뿐만 아니라 엑 소 또한 프로듀서 셀 형식의 EV 하위 집합에 대 한 단백질 특정 포함 되어 있습니다. 그들은 많은 생물 학적 과정^5,10를 그로 인하여 규제 간 셀룰러 통신에서 중요 한 역할 때문에 엑 소 마커 파라마운트 중요성을 얻고 있다. 그들의 소형 때문에 도전 과제 EV 클래식 흐름 cytometry (FC) 남아를 사용 하 여 분석 하는 쉬운 방법을 찾는.

여기, 우리 ultracentrifugation를 통해 미리 농축된 샘플 또는 CM (그림 1)에 직접 적용할 수 있는 FC를 사용 하 여 EV 분석에 대 한 간단한 프로토콜 제시. 메서드 추가 세척 없이 정식 엑 소 관련 표면 epitopes (CD63, CD9 CD81)는 특정 항 체로 입힌 구슬을 사용 합니다. FC 분석 측정 전에 조정에 대 한 필요와 함께 기존의 cytometer를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 교류 cytometers를 사용 하 여 개별 작은 입자에 항 원 특성에 대 한 메서드는 다양 한 응용 프로그램^11,,1213에 관하여 다른 그룹에 의해 기술 되었다. 여기, 우리는 작은 입자와 엑 소, FC에 의해 캡처된 입자의 형질 다음 캡처에 대 한 기능성된 자석 구슬 사용. 이 메서드는 작은 소포 생체 외에서 어떤 셀 형식에 의해 발표의 항 원 성분의 특성을 사용할 수 있습니다, 하지만 여기 우리가 제공 적용 되는 특정 세포 배양 조건을 인간의 심장 조상 세포 (CPC)의 문화를 가장 이 세포에 의해 EV 생산을 위한 적절 한 환경.

프로토콜

1. 수집 및 바른된 미디어의 처리

1. PBS에서 0.02% 돼지 피부 젤라틴 55 cm² 페 트리 디쉬 코트.
2. 7 mL Iscove의 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM)의 하 20 보충 CPC (8000/cm²) 미리 코팅 요리에서 접시 %FBS (태아 둔감 한 혈 청)과 1% 페니실린/스 (P/S).
   참고: 기간 "클릭 당" 언급 된 인간의 explant 파생 셀에 다른¹⁴설명. CM은 특정 문화 조건에서 경작 하는 다른 세포 유형에서 수집할 수 있습니다. 장갑을 착용 하 고 생물학 후드 작동.
3. 셀에 대 한 도달 80% 합류, 문화 매체를 제거, 세척 셀 두 번 Dulbecco의 PBS (PBS) Ca-, Mg-무료 하 고 혈 청 무료 엑 소 생산 매체 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 [DMEM] 높은 포도 당, 4.5 g/mL)의 10 mL와 함께 그것을 대체.
   참고: 점차적으로 셀 세럼 무료 조건 (SF)에 맞게 문화 매체에서 혈 청 농도의 진보적인 감소로 진행 합니다. 셀에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 민감한 FBS를 포함 하는 매체를 준비 하지만 EV의 고갈. 모든 영양소와 플러스 10%-20% (v/v) FBS 보충 하는 매체를 준비 합니다. 100000 × g, 4 ° c.에 하룻밤 매체 원심 이 절차 FBS 파생 EV의 100% 제거를 보증 하지 않습니다 것을 유의 하십시오.
4. 7 일 후, 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브에 CM을 수집 합니다.
   참고: 중간 컨디셔닝 위한 시간 셀 형식에 따라 달라 집니다. 혈 청 무료 매체에 민감한 세포에 대 한 매체의 초기 볼륨을 증가 하 고 24-48 h CM 컬렉션에 대 한 시간을 줄입니다.
5. 4-10 ° c.에 20 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리기에 의해 세포 파편에서 CM을 취소 100 kDa 원심 분리기 필터 튜브에 상쾌한을 수집 합니다.
6. 집중 2000 x g 4-10 ° c.에 20 분에 관을 회전 시켜 CM 허가
   참고: 이 단계는 고속 원심 분리기 단계 작은 볼륨 튜브를 사용 하 여 수 CM의 초기 볼륨을 줄일 것입니다 하 고 작은 단백질 집계 제거에 기여할 것입니다.
7. Microcentrifuge 튜브에 집중을 수집 합니다. 4-10 ° c.에 15 분 동안 10000 x g 에서 원심 분리기
8. 상쾌한을 수집 하 고 절 2 (EV 농축). ultracentrifuge를 사용할 수 없는 경우 섹션 3 (나노 추적 분석 (NTA) 부 량)에 직접 진행 합니다.
   참고: EV 분수의 사전 농축 형광 강도 (참조 대표 결과 및 그림 4)에서 최종 읽기를 향상 시킵니다. 맑게 CM (1.8 점)에서 4 ° C에서 더 이상 다음 1-2 일 저장할 수 없습니다 또는 양자 택일로 몇 달 동안 −80 ° C에. ⁵ CM 미리 exosome 크기의 파편은 동결-해 동 과정에서 형성 하지 있도록-80 ° C에서 저장 하기 전에 어떤 세포질 파편 든 지 제거를 삭제 해야 합니다.

2. 세포 외 소포 농축 Ultracentrifuge (옵션)에 의해

1. 폴 리 카보 네이트 두꺼운 벽 ultracentrifuge 튜브에서 단계 1.8에서에서 상쾌한을 놓습니다. 채워 튜브 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x (3.2 mL)의 최대 용량에 도달할 때까지.
2. (8 x 3.2 mL, k-팩터 13) 티타늄 고정 각도 터에 샘플을 로드 합니다. 탁상 ultracentrifuge에로 터를 로드 합니다. 3 h 4-10 ° c.에 대 한 100000 x g 에서 ultracentrifuge
3. 삭제는 상쾌한 고 1 x PBS의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend.

3. 나노 추적 분석 (NTA) 정량화

1. 1 x PBS의 999 µ L에서 (어느 단계에서 2.3 또는 1.8) 샘플의 1 µ L를 희석. 거품 형성을 피하고 1 mL 주사기에 샘플을 로드 합니다. 시험 챔버의 입구 포트에 주사기를 로드 합니다.
2. 레이저를 켭니다. 캡처 버튼으로 카메라를 엽니다. 초점을 조정 합니다.
3. 3 다른 프레임 60의 기록 s 각.
4. 3 다른 인수는 소프트웨어에서 일괄 처리 옵션을 사용 하 여 분석 합니다.
   참고: NTA 기술을 사용할 수 없는 경우에, Bradford 분석 실험에 의해 단백질 정량화를 수행 (1 x 10⁸ 입자 해당 ultracentrifugation 후 총 단백질의 1-2 µ g 또는 50-60 µ g 총 단백질 정량화로 CM에 대 한 직접 수행 하는 경우 EV; 다른 단백질 오염 물질을 포함 하 고 있습니다. 표 1참조)⁵.

4. 샘플 준비

1. 캡처 구슬의 3 종류의 풀 준비 (CD9 구슬, CD63, 구슬과 CD81 비즈는 1:1:1 비율; 참조 테이블의 자료) 및 소용돌이.
   참고: 수영장은 1 달 동안 안정적인 것으로 테스트 되었습니다. 구슬의 단일 유형을 사용할 수 있습니다, 그리고 그러면 EV 부분 모집단의 탐지 하지 discriminable 구슬의 수영장. 단일 항 구슬 캡처를 사용 하 여 될 것입니다 가능한 현대 CD9, CD81, 등 CD63, tetraspanin 단백질의 존재 확인 하며 관심의 항 원 형광 항 체에 의해 감지. 대체 알데하이드-황산 라텍스 구슬 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이 구슬 MV와 EV의 흡착에 대 한 소수 성 표면을 제공합니다.
2. 둥근 바닥 튜브에 1 x 10⁸ 입자 플러스 (각 시험)에 대 한 총 10⁵ 구슬 x 1.2 해당 구슬 풀의 1 µ L에 해당 하는 볼륨의 금액을 추가 합니다.
3. 이로써 "구슬" 라고 부정적인 컨트롤 역할을 하는 EV 없이 구슬의 1 µ L을 포함 하는 튜브를 준비 합니다.
4. 1 x PBS 가진 100 µ L 볼륨을 조정 합니다. 튜브 열 믹서에 놓고 4-10 ° c.에 하룻밤 400 rpm에서 흔들
5. 다음 날에 둥근 바닥 96 잘 접시 (FC 관) 샘플을 이동 합니다.
6. 항 체 (CD9_FITC의 10 µ g/mL, 10 µ g/mL CD63_PE, 및 CD81_PE의 5 µ g/mL)를 추가 합니다.
7. 4-10 ° c.에 1 시간을 품 어
8. 각 음에 1 x PBS의 100 µ L를 추가 합니다.
9. 수집을 진행 합니다.

5입니다. 취득

1. 수집 소프트웨어를 열고 악기를 시작 (Cytometer > 시스템 시작 프로그램). 새로운 실험을 엽니다.
2. 실험적인 서식 파일을 만들 다음 접시 와 접시 추가선택 합니다. 접시에 샘플의 위치를 선택 하 고 설정으로 예제 잘키를 누릅니다.
3. 명명 규칙에 샘플 이름 (예: CPC #1_CD9FITC)를 입력 합니다. 채널 탭 열고 FITC와 PE 채널에 전환 합니다.
4. 악기에 접시를 로드 합니다.
5. 점 작 누르고 새로운 점 플롯 (P1)을 만들. 앞으로 분산형 영역을 설정 (FSC-A) 측면 분산형-지역 대 (SSC-A) 합니다.
6. 레이저는 응용 시작 초기화 를 선택 합니다. 취득 취득을 시작을 누릅니다.
7. 표시는 P1 중간 인구 규모를 조정 합니다. P1 그릴 (파편 제외) 전체 인구 주위 "구슬" 게이트 (그림 2A). 중지를 누릅니다.
8. 점 작 누르고 새로운 점 플롯 (P2)을 만들. 앞으로 FSC-. 대 분산형-높이 (FSC-H)를 설정 "구슬"에 새로운 점 작 게이트 P2에서 더 큰 인구 주위 새로운 게이트 그릴 하 고 그것의 이름을 "SINGLETS" (그림 2A).
   참고: 이 전략은 많은 구슬 집계 수집 및 분석 단계에서의 가능한 포함을 피하기 위해 설계 되었습니다.
9. 점 작 누르고 만들 두 개의 서로 다른 점 음모; SSC A 대 한 FITC와 SSC-. 대 한 PE "SINGLETS"에 새로운 점 작 게이트
10. 기록 하는 이벤트 (예: 20000)을 선택 합니다. 레코드 를 선택 하 고 실험을 시작.

6. 데이터 분석

1. 분석 소프트웨어 취득 파일을 로드 합니다.
   참고: 다음 단계는 구슬만 및 모든 불명된 한 견본을 포함 하 여 모든 샘플에 적용 해야 합니다.
2. 새로운 프로토콜을 열고 다음 단계 5에서에서 설명한 동일한 전략 점 플롯을 만들.
3. 선형 눈금에 모든 분산형 축과 모든 형광 축 눈금을 로그를 설정 합니다.
4. FITC와 PE 채널에는 형광은 (X-Gmean-MFI)를 표시 합니다.
5. X-G_의미 는 샘플의 비율 / X-G 구슬의_의미 를 물 exosome 없이 항 체.
6. 배 변경 다른 EV 준비의 MFI를 비교 합니다.

7. 세포 외 기 수 적정

참고: 섹션 7 ~ 10 입자, 항 체 농도 및 특이성의 수를 설정 하려면 수행할 수 있지만 경우 건너뛸 수 있습니다 셀 유형에서 EV 파생 되 고 항 체는 동일 하 게 유지.

1. 2.3, 2.5 10⁸ 입자 x 5 x 10⁵ 에서 배열 하는 정지의 시리즈를 1 x PBS에 단계에서 얻은 입자를 희석.
2. 각 정지에 대 한 라운드 하단 튜브에 추가할 캡처 구슬 풀의 1 µ L.
3. 4.3 단계에서 프로토콜을 따릅니다.

8. 항 체 적정

참고: 항 체의 적정은 일반적으로 각 관에 대 한 단일 항 체를 추가 하 여 수행 됩니다.

1. 모든 샘플에서 일정 EV (총 입자 또는 단백질 콘텐츠)의 수를 유지.
   참고: 적절 한 수 위의 섹션에서에서 설명한 대로 7에 경험적으로 결정 됩니다.
2. 4.1 4.5 단계에서 프로토콜을 따릅니다.
3. 공급 업체에서 권장 금액 아래와 위의 항 체 농도의 범위를 테스트 합니다. 예를 들어 제안된 테스트 당 10 µ g/mL의 농도와 항 체, 1, 2, 5, 10, 20, 50 µ g/mL 테스트. 항 체의 높은 농도 추가 "구슬 만" 샘플을 포함 합니다.
4. 1 h 4-10 ° c.에 품 어
5. 각 샘플에 대 한 1 x PBS의 100 µ L를 추가 합니다.
6. 샘플을 획득 합니다.

9. 보육 시간

1. 보육 시간 수행 하는 다른 시간 지점 (예: 1 시간, 2 시간, 그리고 5 h)에서 인수를 확인 합니다.
2. 섹션 4에서에서 시작 하는 프로토콜을 따릅니다.
3. 4-10 ° C에서 1 시간에 대 한 샘플을 품 어.
4. 샘플을 획득 합니다.
5. 3 h 4-10 ° C에서 샘플을 품 어.
6. 샘플을 획득 합니다.

10. 프로토콜 유효성 검사

1. EV 바인딩
   1. 둥근 바닥 튜브에 1 x 10⁸ 입자 또는 총 단백질의 해당 금액에 해당 하는 볼륨의 금액을 추가 합니다.
   2. 1 x PBS 가진 100 µ L 볼륨을 조정 합니다.
   3. 방해 하 여 EV 멤브레인 제조업체의 지침에 따라 (또는 열 충격 단계 적용 될 수 있다) 쥡니다. 빈도 강도 설정 합니다. 시간-과정 실험 설정 쥡니다 기간을 실험적으로 설치 될 수 있다 (즉, 0 s 30 s, 1 분, 5 분, 등.).
   4. 구슬 풀의 1 µ L를 추가 합니다.
   5. 4.4 단계에서 시작 하는 프로토콜을 따릅니다.
2. 항 체 특이성
   1. 각 형광 색소 활용 된 IgG에 대 한 1 개의 관을 준비 하 고 구슬 EV의 복잡 한 단계 4.6에서에서 설명 된 대로 추가.
      참고: 형광 색소 활용 된 Isotype 사용된 항 체의 IgG와 일치 해야 합니다.

결과

단일 얼룩에 대 한 입자의 총 수

이후 하나의 구슬 하나 이상의 입자를 바인딩할 수 있습니다, 우리 MFI 곡선의 초기 지 수 단계에 도달 총 EV (관 당 단일 항 체)의 작은 금액을 설정 하는 다른 조건을 테스트. 항 체의 고정된 농도 2.5 x 10 5 x 10⁵ 에서 배열 했다 입자의 총 수 하는 동안 사용 되었다⁸. 그림 3A, 항 체는 허용 MFI 내에서 수행 되도록 우리가 수 있는 입자의 수와 같이 1 x 10⁸ 입자/얼룩은 EV의 과잉 사용을 피하고.

항 체 적정

...

토론

기존의 FC 기술을 마커 EV의 표면에 표현 하는 가장 간단한 분석 방법에 남아 있다. 이와 관련, 가장 적합 한 프로토콜을 선택은 악기 감도 인해 한계를 방지 하 여 개별 입자의 분수에 대 한 유용한 정보를 얻을 중요 합니다. 우리 엑 소 및 다운스트림 FC 응용 프로그램에 대 한 적당 한 작은 EV 표면 항을 인식 하는 항 체와 결합 하는 자기 입자를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 우리 확인 방법을 사용 하 여 두 개의 서로 다른 세포 유형: 기본 인간의 CPC 심장 질환;에 대 한 엑 소-기반 치료 접근에 대 한 주요 셀 소스로 떠오르고 있다 그리고 HEK293 세포, 신뢰할 수 있는 세포 성장 및 소성 세포 생물학 연구에서 널리 이용 되는 불멸 하 게 셀 라인.

메서드는 ultracentrifuge 농축 EV에 적용할 수 있는 하 고, 빠른 분석을 위해 또한 생체 외에서 직접 세포 유래 CM 없이 사전 농축과 ultracentrifugation에 의해. 시작 자료 샘플을...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
IMDM	Gibco	12440061
Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100  kDa	Millipore	UFC910024
CytoFlex, 유세포 분석기 플랫폼	, Beckman Coulter	CytoFlex,
DMEM, 고포도당, HEPES, 페놀 레드	없음 Gibco	21063045
Dulbecco의 PBS(PBS) Ca- 및 Mg-free	Lonza	BE17-512F
ExoCap CD63 캡처 키트	, JSR Life Sciences,	Ex-C63-SP
ExoCap, CD81 캡처 Kit	JSR Life Sciences	Ex-C81-SP
ExoCap CD9 Capture Kit	JSR Life Sciences	Ex-C9-SP
Exosome-Depleted FBS	Thermofisher	A2720801
Exosome-depleted FBS Media Supplement	SBI	EXO-FBS-250A-1
FBS-Fetal Bovine Serum	Gibco	10270106
FITC anti-human CD9 항체	바이오레전	드 312104                    RRID: AB_2075894
유세포 분석기 분석 소프트웨어	Beckman Coulter	Kaluza
NanoSight LM10	Malvern	NanoSight LM10
NanoSight 소프트웨어	Malvern	NTA 2.3
Optima Max-XP	Beckman Coulter	393315
PE anti-human CD63 Antibody	Biolegend	353004                    RRID:AB_10897809
PE 항인간 CD81 (TAPA-1) 항체	Biolegend	349505                    RRID:AB_10642024
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15140122
써모믹서 C	Eppendorf	5382 000 015
TLA-110	Beckman Coulter	TLA-110 로터