Method Article

부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스의 고급 동맥 경 화성 병 변에서 세포 성분의 정량 분석

DOI:

10.3791/59139

⸱

February 20th, 2019

 ,  ,  , 
1Heart, Lung, Blood and Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia, 4Division of Cardiology, University of Pittsburgh School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리 세포 단계의 murine 동맥 경 화성 병 변 포함 하 여 동물 해 부, 조직 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥의 분석의 체계적인 방법을 구성 하는 표준화 된 프로토콜을 제안 atheroprone에서 부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동맥 경화 남아 죽음은 전세계의 주요 원인이 고, 유망한 치료 목표를 설명 수많은 임상 연구에도 불구 하 고 소설 개입 하기 어려운 남아 있다. 이것은 가능성이 인해, 부분적으로, 설립된 질병 보다는 오히려 유전 조작 또는 아 테 롬 개발에 약물 치료의 효과 조사 하는 임상 예방 모델에 대 한 신뢰. 또한, 이러한 연구의 결과 종종 혼동 표면 병 변 분석의 사용 및 병 변 세포 인구 특성의 부족 때문에. 이러한 변환 장애물을 극복 하기 위해, 우리는 immunofluorescent 얼룩이 지 고 confocal 현미경 검사 법에 의해 단일 세포 수준에서 세포 구성에서 변경의 조사를 고용 하는 개입 모델에 증가 신뢰를 제안 합니다. 이 위해, 우리는 murine 개입 모델 동물 해 부, 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥 병 변의 정량화에 대 한 체계적인 접근을 포함 하 여 상 상속 치료 에이전트를 테스트 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 더하여, 단계의 동맥 경 화성 병 변 내의 세포의 phenotypic 다양성으로 인해 셀 전용, 유도할 수 있는 혈통 추적 마우스 시스템 및 어떻게이 편견된 특성에 대 한 활용할 수 있는 사용의 중요성 설명 동맥 경 화성 병 변 세포의 인구 함께, 이러한 전략 혈관 생물학 더 정확 하 게 치료 개입 모델 동맥 경 화성 질환 분석을 지원할 수 있다 하 고 잘하면 임상 시험에 성공의 높은 속도으로 번역할 것 이다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동맥 경화 병 적 상태와 사망률 전세계 기본 관상 동맥 질환, 말 초 동맥 질환 및 뇌졸중의 대부분의 주요 원인입니다. 단계의 관상 동맥 경화는 심근 위반 회계 세계 인구 사망률1,2의 거의 16%를 포함 하 여 심각한 합병증으로 이어질 수 있습니다. 때문에 공중 보건에 미치는 파괴적인 영향, 상당한 노력이 했다 비 발한 치료 전략 개발로 동맥 경화 진행을 운전 메커니즘을 해독. 그러나, 심장 혈관 질환에 대 한 임상 시험의 승인 가능성 (LOA) 속도 (단 대 8.7% 단계) 다른 임상 분야와 비교할 때 낮은 중3입니다. 이 설명 될 수 있는 부분에 많은 방 벽에 의해 그 롬 포즈 효율적인 신약 개발 거의 유비 쿼터 스 자연, 침묵-임상 진행 및 중요 한 질병이 포함. 또한, 전 임상 동물 연구의 차선 디자인 또한 임상 번역에 성공의 부족에 대 한 차지 수 있습니다. 특히, 우리는 개입 연구 가능한 치료 전략의 효능을 조사 하기 위해 구현 해야 하는 것을 믿는다. 또한, 병 변 분석 단계의 동맥 경 화성 병 변 세포 구성의 고급 특성을 포함 하 여 운명 매핑 및 형질에 대 한 표준화 된 절차를 수행 하는 중요 한 필요가 있다.

아 테 롬 연구의 대부분은 동맥 경화 예방 약물 치료 나 유전자 조작 (녹아웃 또는 노크-) 질병 개시 및 진행 하기 전에 건강 한 젊은 쥐에서 구성 된 모델에 초점. 이러한 연구는 유전자 및 아 테 롬 개발에 역할을 하는 신호 분자의 많은 수를 발견 했다. 그러나, 이러한 목표의 대부분 인간의 효율적인 치료를 번역 하지 못했습니다. 사실, 고급 동맥 경 화성 병 변 노인 환자에 게 건강 한 젊은 쥐에는 치료 효과 추정 하는 것이 어렵습니다. 등, 구현 가능성이 전 임상 실험 진행중 개입 연구의 관련성 및 새로운 효능 치료의 더 정확한 묘사를 제공 한다. 아이디어는 프로-염증 성 사이토카인 인터 루 킨-1β (IL 1β)을 억제 하는 예방4,,56 또는 개입 전략7을 사용 하는 경우의 현저 하 게 분기 효과 의해 지원 됩니다. 예방 및 개입 연구의 차이점 제안 다른 세포질 과정 동맥 경화 증 개발의 여러 단계에서 발생 하 고 예방 연구 가능성이 있다는 사실을 강조 임상 시나리오를 모델링 하는 데 부족 한 적절 하 게.

미국 심장 협회는 최근 과학 문을 자세히 적절 한 실험 설계, 절차 표준화, 분석, 및 동물 아 테 롬 연구8의 보고에 대 한 권장 사항을 출판. 그것은 혜택 및 필드에 사용 되는 주된 기술의 한계를 강조 표시 합니다. 예를 들어 en 얼굴 수단 IV는 대동맥의 얼룩 종종 첫 번째 읽기로 수행 됩니다. En 얼굴 수단 IV의 지질 증 착 얼룩 글로벌 패 부담에 대 한 평가 적당 한 방법 이지만, 고급 단계의 병 변 초기 단계 지방 조 흔 병 변을 구별할 수 아니다. 이와 같이, en 얼굴 얼룩의 해석 종종 모호 하 고 피상적인9입니다. 조심 분석 조직의 횡단면 형태 론 적 매개 변수 그릇, 병 변, 고 루멘 크기와 병 변 안정성의 지표의 정량화를 사용 하 여 실험의 효과의 더 정확한 이해를 제공 합니다.

마지막으로, 인간의 histopathology 연구 세포 구성 부드러운 근육 세포 (SMC)에 병 변 가난한와 풍부한 세포10, 파열을 더 따르게 되 고, 병 변 크기 보다 파열의 더 나은 예언자는 제안 했다 11. 이러한 관측 마커 고전적인 셀 식별에 사용에 대 한 얼룩에 근거 했다 (즉, SMC 및 LGALS3 또는 세포에 대 한 CD68 ACTA2). 그러나, 이러한 마커 표현의 여러 계보 SMC, 골수성 세포12, 내 피 세포 등의 동맥 경 화성 병 변에서가 소성 때문에 단일 셀 형식에 엄격 하 게 제한 되지 않습니다. 특히, 동맥 경 화성 병 변 내 SMC의 명확한 식별 사실상 불가능 했다 지난 10 년간까지 dedifferentiate 및 그들의 계보 특정 마커 유전자 (프로세스 라고 참다 이러한 셀의 속성 때문에 phenotypic 스위칭) 부상 또는 질병 혈관13에. SMC 식별에서이 제한 혈통 추적7,14,15,,1617,18, 의 개발에 의해 피할 되었습니다. 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. 영구적으로 Cre recombinase SMC 특정 발기인에 의해 구동의 식의 조합을 사용 하 여 동맥 경화의 진행 하는 동안 그들의 운명 및 phenotypic 발전을 추적 하는 SMC와 그들의 자손을 라벨로 구성 됩니다 (즉, Myh117,15,17,18,19,20,21,,2223 , 24, Acta225,26 , SM22α14,16)와 기자 (형광 단백질, β-galactosidase) [검토 Bentzon와 Majesky의 활성화 201827]입니다. 첫 번째 연구 채용 embryogenesis 설정 외부 SMC 혈통 추적 중 하나에서 Speer 외.14 는 SMC 수 변조 그들의 표현 형 및 transdifferentiate chondrogenic 세포로 혈관 석 회화 하는 동안 사용 하 여 증거를 제공 SM22α Cre R26R LacZ 혈통 추적 모델. 그 질병의 설정에서 어떤 주어진된 비 SMC 표현 SM22α 기자에 의해 표시 된 것이 이러한 연구 개척 SMC 혈통 추적, 비록 그들은 부분적으로 애매 했다. 이 제한 사항은 개발 및 사용의 tamoxifen을 유도할 수 있는 Cre ERT/LoxP 셀 라벨의 일시적인 제어 허용에 의해 무시 되었습니다. 셀 라벨 tamoxifen 전달 중 독점적으로 발생 하 고 다른 종류의 세포에 Cre 활성화 추적을 피하고 셀 형식 관련 발기인 Cre ERT 식 tamoxifen 노출 시간에 운전을 표현 하는 셀을 제한 될 것 이다는 질병의 진행의 설정입니다. 동맥 경화, tamoxifen을 유도할 수 있는 Myh11-Cre/ERT2 transgene 형광 기자 (eYFP7,15,,1718 연관에 SMC의 혈통 추적에 대 한 , 21, mTmG19,25, 클론 확장 연구 색종이20,,2223 ) 놀라운 효율성과 SMC 라벨에 특이성을 입증 했다 고 최근 연구에서 동맥 경 화성 병 변에서 운명 지도 SMC 인구에 사용 되었습니다. 중요 한 것은, 이러한 연구는 계시 했다: 1) SMC의 80% 이내 고급 동맥 경 화성 병 변 할 표현 하지 어떤 기존의 SMC 마커 (ACTA2, MYH11) immunohistological 분석에 사용 하 고 따라서 것가지고 되었습니다 오인 혈통 추적 없이 17; 다른 종류의 세포 대 식 세포 마커 또는 중간 엽 줄기 세포 마커16,,1719;를 포함 하 여 마커를 표현 하는 2) SMC의 하위 집합 그리고 3) SMC 투자 oligoclonal 확장 동맥 경 화성 병 변 채울 및 SMC 클론 phenotypically 다른 인구20,23전환가 소성 유지. 요약, 그것은 이제 분명 부드러운 근육 세포 동맥 경 화성 병 변에서 놀라운 phenotypic 다양성을 제시 하 고 그들의 phenotypic 전환의 성격에 따라 병 변 병에 유익한 또는 해로운 역할을 가질 수 있습니다. 이러한 발견 단계의 동맥 경화에 athero 홍보 phenotypic 전환 SMC 대상에 대 한 놀라운 새로운 치료 애비뉴를 나타냅니다.

여기, 우리는 분석 단계의 murine 동맥 경 화성 병 변을 포함 하 여 동물 해 부, 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥 병 변의 정량화에 대 한 체계적인 방법에 대 한 표준화 된 프로토콜을 제안 합니다. SMC 운명과 표현 형에 인터 루 킨-1β 억제의 효과 확인 하려면 우리는 SMC 혈통 ApoE-/- 생쥐는 안티-IL1β 항 체의 IgG 제어 isotype 일치 주간 주사를 받기 전에 18 주 동안 서쪽 규정식 먹이 추적을 사용 합니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동물 사육, 처리 및 절차는 버지니아의 대학 및 피츠버그 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 되었다.

1입니다. 세대 SMC 혈통 추적 마우스의

  1. Myh11-Cre/ERT2 남성28 번 식 (잭슨 실험실; #019079) R26R-EYFP 여성와 (잭슨 실험실; #006148)를 Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+ + 남성.
  2. 번 식 Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+ + ApoE-/- 여성 쥐와 남성 (잭슨 실험실, #002052). 자손을 교차 하 고 유전형 Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP에 의해 선택+ + ApoE-/- 남자와 R26R-EYFP+ + 최종 종 축으로 ApoE-/- 여성 쥐. 꼬리를 클립 하 고 유전형 littermates에서 수행. 모든 남성 쥐 해야 Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+ + ApoE-/- 실험 쥐 (그림 1A)로 사용 될 수 있다.
    참고: 유전형 프로토콜 잭슨 실험실 웹사이트에서 찾을 수 있습니다. Myh11 Cre/ERT2 transgene은 암컷의 사용을 제외 하는 Y 염색체에 있습니다. 다른 계보 추적 시스템을 사용할 수 있습니다, 하지만이 시스템은 가장 신뢰할 수 있는 혈통 추적 전략 운명 지도 SMC 동맥 경화에 데이트.

2. 부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스 식이 요법과 치료

  1. 남성 Myh11-Cre/ERT2+ R26R-EYFP+ + ApoE-/- 생쥐를 영구적으로 Myh11 나이의 8 주 6 1 mg tamoxifen 주사의 시리즈를 받을+ SMC YFP와 그들의 운명 (그림 1 을 추적 하 A)입니다.
    1. 55 ° c.에 열 땅콩 기름
    2. 10 mg/mL에서 솔루션을 준비 하 고 55 ° C에서 tamoxifen의 완전 한 해체까지 품 어를 미리가 열된 땅콩 기름에 tamoxifen을 추가 합니다.
    3. 2 주 동안 10 주사의 시리즈에 대 한 tamoxifen 솔루션 10 mg/mL의 0.1 mL와 함께 복 주사를 수행 합니다.
      참고: Tamoxifen는 생물 이며, 관리와 처리 해야 합니다.
  2. Tamoxifen와 마지막 주입 후 5 ~ 7 일 고급 동맥 경 화성 병 변의 개발에 대 한 허용을 18 주 동안 높은 지방 다이어트 (예를 들어, 서양 다이어트 42% 지방에서 kcal, 0.2% 총 콜레스테롤)와 차 우 다이어트를 대체 하 지속적으로 대동맥 아치, 대동맥 루트, brachiocephalic 동맥 및 복 부 대동맥을 포함 하 여 여러 혈관 침대에서 발전 한다.
  3. 높은 지방 다이어트를 먹이의 18 주, 원하는 기간 (그림 1B)에 대 한 치료 적 개입을 시작 합니다.
    참고: 예를 들어, 우리는 안티-IL1β 항 체 또는 isotype 일치 IgG 제어 높은 지방 다이어트의 18와 26 주 사이 주간 복 주사를 수행.
  4. 8 ~ 16 h 이전에 수확 하는 플라즈마 콜레스테롤과 트리 글리세라이드에 대 한 정확한 판독을 수행 하는 조직에 대 한 빠른 마우스 식품을 제거 합니다.

3. Brachiocephalic 동맥 (BCA)의 수확

  1. 동물 안락사는 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) 요구 사항 및 규정을 따라야 합니다. Approximatively 5 분 CO2 질 식에 의해 실험 쥐를 안락사 고 발가락 핀치에 의해 죽음을 확인 합니다.
  2. 마우스 무게 및 혈액을 수집 합니다.
    1. 마우스 무게
    2. 마우스의 복 부 측 스프레이 70% 에탄올
    3. 1 mL 주사기는 심 실에 흉의 왼쪽에서 연결 25g 바늘을 삽입 하 여 심장 펑크를 수행 합니다. 혈액의 0.1 ~ 1 mL은 수집할 수 있습니다.
    4. 주사기를 홍 조에 의해 EDTA 진공 튜브에 혈액을 전송 하 고 로커 또는 10-15 분에 대 한 회전에 튜브를 놓습니다.
    5. 1.5 mL 튜브 및 원심 분리기 g 에 4 ° c.에서 10 분 250 x에 대 한 혈액을 전송 신중 하 게는 피 펫 및 적절 한 팁, 최고의 플라즈마 단계를 철회 하 고 새 튜브를 전송. 콜레스테롤 및 트리 글리세라이드를 측정 하기 전에-20 ° C에서 저장 합니다.
      참고: 전체 혈액 혈 구 수와 cytokines 또는 면역 셀 프로 파일링을 포함 하 여 다른 혈액 구성 요소를 포함 하 여 추가 연구에 대 한 사용할 수 있습니다.
  3. 확인 사용 하 여 중간 복 부 피부에 approximatively 2cm의 절 개가 위 및 복 부 구멍을 노출 피부를 당겨. 조직에 손상 없이 흉 골까지 복을 잘라. 흉부, 심장 및 폐 손상 되지 않도록 주의 되 고 통해 중간 겨드랑이 라인에서 두 컷을 확인 합니다.
  4. 핀셋으로 흉 골을 들어올리고 부분적으로 마음을 폭로 하는 다이어 프 램을 잘라 합니다. 마음에 쉽게 액세스할 수 없는 경우 잘라 거리 만큼 오른쪽 아 트리 움 도달 하는 흉 곽.
  5. 중력 관류 시스템 (그림 2A) 마우스 perfuse 관류 액체의 압력은 평균 murine 혈압 (그림 2B)는 중력 관류 시스템을 설치 합니다. 이 시스템 관류에 일관성과 모두 선박 형태 및 플러시 붉은 혈액 세포를 유지 합니다.
    참고: 참고로 C57Bl6 마우스는 physiologic 혈압 120 mmHg (평균 수축 기 혈압)과 70 mmHg (평균 확장기 혈압)29,30사이. 평균 수축 기 및 확장기 혈압 마우스 유전 배경으로 달라질 수 있습니다.
    1. 연결 하는 23 또는 25 G 나비 바늘 중력 관류 시스템을 튜브에서 공기를 추방 하는 바늘을 통해 염 인산 염 버퍼 (PBS)를 실행. 좌 심 실에 바늘을 삽입 하 고 자리에 바늘을 확보. 아이리스가 위를 사용 하 여 오른쪽 아 트리 움 또는 오름차순 대동맥에 작은 절 개 (< 2 m m)를 확인 합니다.
    2. Perfuse 5 mL PBS의 4 %Paraformaldehyde (PFA) 솔루션의 다음 10 mL와 함께 다음 5 mL PBS의. PBS와 4 %PFA 솔루션을 사용 하 여 주위 온도에.
    3. (예: 간, 폐, 비장)의 조직 수집 하 고 4 %PFA 솔루션에 그들을 배치.
  6. BCA 노출
    1. 피부 침 샘을 제거 하 여 목 부분을 청소.
    2. 가 위를 사용 하 여 위를 통해 흉 골의 중간 선 아래 한 컷을 수행 합니다. 가 위 흉 골 아래 밀접 하 게 위치한 맥 관 구조를 손상을 방지 하려면 흉 골의 뒤쪽 가까이 있어 주의 해야 합니다. 완전히 흉을 열고 집게와 흉 곽의 양쪽을 당겨. 년은 부분적으로 표시 되어야 합니다.
    3. 당기는 근육과 결합 조직 및 오른쪽 경 동맥, brachiocephalic 동맥 subclavian 분기 대동맥 아치를 청소 하 고 주위 결합 조직 및 지방 (그림의 절연까지 정밀한 핀셋으로 지방을 제거 하 여 정리 2C).
  7. BCA를 제거
    1. 집게를 사용 하 여 그것의 분기 아래 오른쪽 경 동맥을 겸 자 (그림 2D) 위에 초기 컷을 확인.
    2. 아직도 들고 경, 확인 하 동맥을 통해 두 번째 컷. 마지막 두 컷 통해 대동맥 아치, brachiocephalic 동맥 (그림 2D)의 양쪽에 있습니다.
    3. 다른 혈관 조직 (예: 복 부 대동맥, 대동맥 루트를 포함 하는 심장의 우수한 부분)의 수집 합니다.
    4. 하룻밤 실 온에서 4 %PFA 솔루션에서 다른 조직과 BCA를 놓습니다.
      참고: 고정 시간 유지 되어야 한다 연구에 걸쳐 일관성.

4. 조직 처리 및 단면

  1. 4 %PFA 레이블이 조직 카세트(그림 3)에서 조직을 제거 합니다. 조직을 위해 카세트에서 사용 거품 패드의 방향 및 처리 단계 (그림 3B) 카세트에서 유지 합니다. 카세트를 닫고 (72 h에 24)를 처리 하는 조직까지 70% 에탄올에 몰두 합니다.
    1. 다른 조직과 프로세스 BCA 조직학 및 immunofluorescent (진공 침투와 프로세서를 사용 하 여 일상적인 하룻밤 프로시저의 예제) 다음과 같이 얼룩에 대 한 수집: 10% 중립 버퍼링 주변 온도 (2 x)에서 30 분 동안 말린 75% 30 ° C (1x), 90% 에탄올 30 ° C (1x), 95% 에탄올 30 ° C (1x), 100% 에탄올 30 ° C (3 배), 60 분에 30 ° C (3 배), 크 실 렌 그리고 파라핀 왁 스 62 ° C (3 배)에서 80 분에서 60 분에서 60 분에서 60 분에서 60 분의 에탄올
  2. BCA, 블록 면 (그림 3C)에 가까운 대동맥 아치 포함 됩니다.
  3. 로타리 톰 (10 µ m 두께)에 포함 된 조직에 도달할 때까지 파라핀 블록을 통해 잘라.
  4. 조직 표시 되 면 위치를 결정 하는 현미경 아래 섹션을 검사 합니다. 대동맥 아치 여전히 표시 하는 경우 각 간격에 섹션을 검사 한 번에 10 10 µ m 섹션까지 제거 합니다.
  5. 대동맥 아치를 통해 구분 되는, brachiocephalic 동맥 표시 됩니다 때 완전히 톰 블레이드 수직 조직 위치를 블록의 방향을 조정 합니다.
  6. 섹션 두께 10 µ m의 BCA를 잘라. 그 시점에서, 모든 섹션 슬라이드 당 3 개의 섹션으로 순차적으로 수집 됩니다. Subclavian 분기 (그림 3D)에 도달할 때까지 수집 합니다.
    참고: 다음 z-스택 confocal 이미지 수집 및 단일 셀 계산 10 µ m의 섹션 두께에 BCA을 중요 하다. 이 두께 단일 핵과 세포질 협회 또는 막 얼룩 비록 횡단면의 깊이의 엄격 하 고 비 cofounding 평가 허용할 것 이다.

5. immunofluorescent 얼룩

참고: 동맥 경 화성 병 변의 완전 한 특성 형태학 매개 변수 평가 및 플 라크 안정성 또는 불안정성 및 현재 프로토콜의 초점 되지 것입니다 세포 구성의 인덱스를 포함 합니다. 병 변의 형태, 콜라겐, 내용과 intraplaque 출혈 분석할 수 있습니다 Movat7,17, PicroSirius 레드 7,31, Ter119 착 7,18, 각각. 여기, 우리 병 변 세포 구성을 분석을 위한 프로토콜을 설명 합니다.

  1. 실 온 화학 후드 아래에서 다음 솔루션에 슬라이드를 품 어: 5 분 (2 배), 5 분 (2 x)에 대 한 100% 에탄올, 5 분 (2 x)에 대 한 95% 에탄올, 5 분 (2 배), 그리고 이온된 H2O에 대 한 70% 에탄올에 대 한 크 실 렌 (diH2O) 5 분 (2 배).
  2. Antigen 검색 솔루션 제조 업체의 지침에 따라 슬라이드를 품 어.
    1. 구 연산 산 항 unmasking 솔루션을 기반으로 ( 재료의 표참조), 희석 3 mL 320 mL diH2오 장소에에서 솔루션의 준비 항 원 검색 솔루션 위로 얼룩 저수지와 채우기 슬라이드.
    2. 도 열 되도록 빈 슬라이드 슬라이드 선반에 있는 빈 슬롯을 채우십시오. 증발 없이 종 항 원 검색 솔루션 수 있도록 뚜껑 컨테이너 커버.
    3. 약 675-700 와트에 20 분 동안 전자 레인지에 슬라이드를 열. 검사 정기적으로 슬라이드와 diH2O 섹션 같은 남아 바꾸기 증발 액체 침수 unmasking 솔루션에 항상.
    4. 실 온에서 1 h에 대 한 솔루션을 슬라이드 수 있습니다.
  3. PBS의 1 L에 물고기 피부 젤라틴 (FSG)의 6 g을 녹. PBS/FSG 버퍼 세척으로 사용 됩니다. PBS/FSG의 정상적인 혈 청을 10%의 차단 솔루션을 준비 합니다.
    참고: 물고기 피부 젤라틴 블로킹 버퍼의 준비에 사용 됩니다. FSG 포함 하지 않는다 포유류 항 체와 cross-react 수 있는 혈 청 단백질 배경 잡음을 최소화. 그러나, 다른 차단 옵션 FSG 생 biotin을 포함 biotin 탐지 시스템 선호 해야 한다. 정상 혈 청 사용의 유형은 사용 하는 이차 항 체를 기반으로 합니다. 당나귀 2 차 항 체를 사용 하면 정상적인 말 혈 청 및 항 체 희석에 대 한 선택 되어야 합니다.
  4. 실 온에서 5 분에 대 한 PBS에 슬라이드를 품 어. 소수 성 펜으로 동그라미 조직 섹션입니다. 블로킹 버퍼 PBS/FSG/정상 혈 청 실 온에서 1 h에 대 한 섹션을 커버. 조직에서 차단 하는 동안이 단계 동안 PBS/FSG/정상 혈 청에서 항 체를 기본 솔루션을 준비 합니다.
  5. 1 차 항 체에 습도 챔버에 4 ° C에서 하룻밤 PBS/FSG/정상 혈 청 희석으로 품 어. 슬라이드 당 한 섹션 1 차적인 항 체 특이성에 대 한 제어를 기본 항 체로 같은 농도에서 IgG 제어 항 체의 믹스와 함께 알을 품을 한다.
  6. 실 온에서 다음과 같이 슬라이드를 세척: PBS/FSG 5 분 (배), 5 분 (1x) 다음 PBS.
  7. 핵에 실 온에서 1 h에 대 한 PBS/FSG/정상 혈 청 희석 counterstaining에 fluorophore 활용 된 이차 항 체 ( 재료의 표참조)와 diamidino-2-phenylindole (DAPI) 품 어. 빛에서 슬라이드를 보호 합니다.
  8. 5.6 단계에서 설명한 대로 슬라이드를 씻어.
  9. 형광에 대 한 적합 한 설치 미디어를 사용 하 여 슬라이드 마운트 ( 재료의 표참조).

6. confocal 현미경 검사 법

참고: confocal 현미경 및 z-스택 수집의 사용은 단일 셀 계산 하는 것이 중요 합니다.

  1. 연구 전반에 걸쳐 사용 하는 수집 매개 변수 설정: 이미지 해상도 (1024 x 1024 또는 2048 x 2048 픽셀); 광학 경로 선택; 2 차 항 체의 결합의 함수는 채널의 수 스캐닝 속도 (스캐닝 속도 권장: 7-8); 그리고 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 채널입니다.
  2. 섹션 주 항 체와 IgG 제어 스테인드를 사용 하 여, 검출기 감도, 레이저 파워 및 각 개별 채널에 대 한 오프셋을 설정 합니다. IgG 컨트롤 배경 신호를 최소화 하는 데 사용 됩니다.
  3. Z-스택 수집에 대 한 위쪽과 아래쪽 위치를 설정 합니다. 두께 스택 취득의 수를 미리 지정할. 이러한 매개 변수는 연구에 걸쳐 일관성이 유지 됩니다.
    참고: 1 µ m 두께의 8 ~ 10 스택을 이미징이 좋습니다. 스택 연구를 통해 몇 군데의 수에서 숙박.
  4. 이미지 조직 섹션 1 차 항 체와 DIC를 포함 한 모든 채널에 대 한 IgG 제어 스테인드.
  5. 레이블을 눈금 막대 단일 셀 계산 하는 동안 이미지 보정을 위한 적어도 하나의 이미지.

7. 단일 셀 계산

  1. 설치 하 고 ImageJ를 엽니다. 필요한 경우 섹션에서 플러그인 을 다운로드 다운로드 > 입/출력 는 ImageJ의 이미지 파일을 웹사이트 생성 confocal 현미경에 의해 생성 된 이미지의 형식에 따라.
  2. ImageJ에서 이미지 파일을 엽니다.
  3. 참고 눈금 6.6에서 생성 된 이미지를 사용 하 여 막대와 이미지 보정.
  4. 관심 있는 단일 셀 계산 수행 됩니다 DIC 채널 (그림 4)를 사용 하 여 영역을 나타냅니다.
    참고: 한 지역은 한 번에 구분 된 될 수 있습니다. 실험적인 질문에 따라, 단일 셀 계산 수행할 수 있습니다 전체 병 변의 영역에서 ( 7.3.1참조) 병 변의 sublocation에. 예를 들어 그것의 세포질 구성 이기 때문에 병 변 성향 파열의 중요 한 인덱스 섬유 모자 영역의 조사 특히 관계가 ( 7.3.2참조).
    1. DIC 이미지에 루멘 테두리 (그림 4A, 흰색 화살표)와 내부 탄력 있는 lamina (그림 4A, 노란색 화살표) 표시를 따라 병 변 위치를 나타냅니다.
    2. 섬유 모자 영역의 분석을 위해 루멘에서 30 µ m의 먼 국경 확인 하 고 테두리 ( 그림 4B-D)를 추적 합니다.
      참고: 섬유 모자 지역 고전적인 ACTA2 + 셀과 콜라겐 underlaying 루멘 (그림 4B)에 농축 하는 지역으로 정의 됩니다. ACTA2 + 셀과 콜라겐에 농축 병 변 안정성에 중요 한 역할을 한다. 이전 연구는 ACTA2 + 셀 풍부한 섬유질 모자 영역 평균 SMC 혈통에 루멘에서 30 µ m 두께 결정 ApoE-/- 추적 마우스 18 26 주 (그림 4C) 높은 지방 다이어트를 먹이. 따라서, 유전자 조작 이나 섬유질 모자 지역 세포 구성에 약리 치료의 효과의 세심 한 특성은 매우 적합 합니다.
  5. 채널 도구 패널을 엽니다 (이미지 > 색상 > 채널 도구)와 다른 의사 색 얼룩 채널 (그림 5A; 상자 1).
  6. 색상 채널을 병합 (이미지 > 색상 > 색상 병합) (그림 5A; 상자 2). 모든 채널에서 동일한 이미지 (그림 5B)에 표시 되어야 합니다. 켜고 채널 도구 패널 (그림 5A; 상자 1)를 사용 하 여 개별 색상 채널을 설정 합니다.
  7. 계산 도구를 설정 합니다.
    1. 도구 모음에서 계산 아이콘에 오른쪽 클릭 (그림 5C, 상자 1) 고 다 지점 도구를 선택 합니다.
    2. (그림 5C; 상자 2) 도구 패널을 열고 동일한 아이콘에 더블 클릭.
    3. 종류와 셀을 계산 하는 데 사용 하는 항목의 크기를 선택 합니다.
    4. 모두 표시를 선택 합니다.
  8. 켜고 채널 도구 패널에만 DAPI 채널 카운터 채널 0 (그림 5C; 상자 3)을 선택 합니다. 태그는 개별 핵에 클릭 합니다 (예를 들어, 노란색 그림 5C D에 점). Z-스택 모든 핵 관심 영역에 스테인드를 스크롤하십시오. 이벤트의 수는 도구 패널 (그림 5C; 상자 4)에서 카운터 채널 아래 표시 됩니다.
  9. 다른 얼룩 채널 설정 (예: eYFP 얼룩이 지기). 카운터 채널 1을 선택 합니다. 셀은 DAPI과 얼룩이 지기 사이 colocalization를 클릭 합니다. 세포질 얼룩에 대 한 얼룩과 선택 셀 주변 핵의 전체 깊이에 핵 (여러 z-스택 확인).
  10. 조합 얼룩 및 관심의 세포 인구를 새로운 카운터 채널 선택 수정 하 여 반복 합니다. 모든 도트 색상 다른 세포 인구를 (그림 5D)를 나타냅니다. 결과는 DAPI의 총 수 또는 지역 영역에는 셀의 수를 셀 수로 표현할 수 있습니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myh11-Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe-/- 생쥐는 높은 지방 다이어트를 먹이 되 고 전에 나이의 6의 그리고 8 주 사이 tamoxifen을 주입 했다. 높은 지방 다이어트를 먹이의 18 주에 8 쥐의 2 개 그룹 마우스 단일 클로 널 안티-일리노이-1β 항 체 또는 isotype 일치 IgG 컨트롤 8 주 (그림 1)710 mg/kg에서 매주 치료 했다. 마우스 희생 되었고 4% PFA PBS 솔루션 끼얹는다. Brachiocephalic 동맥 해 부, 처리 되었고 (그림 2 및 그림 3) 위에서 설명한 대로 구분.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수십 년간의 연구 및 동맥 경화를 공부 하 고 기술 발전에 불구 하 고 필드 임상 치료34,35과학적인 발견을 번역의 실망 스러운 역사를가지고 있습니다. 이 현상 동물 모델, 실험적인 디자인, 그리고 병 변 분석에 불일치에 의해 부분적으로 설명 될 수 있습니다. 여기는 우리 혈통 추적 마우스7를 사용 하 여 고급 동맥 경 화성 병 변에서 세포 구성 분석 하는 데 사용 하는 실험적인 파이프라인에 설명 합니다. 세포 운명 매핑 및 형질, 세심 한 조사를 위해이 방법을 사용 하면 잠재적인 메커니즘에 의해 제어 하는 주요 매개 변수는 고급 동맥 경 화성 병 변에서 재생할 수 있습니다.

SMC-혈통 추적 마우스 모델 동맥 경화 병 인에 운명과이 혈통과 그들의 공헌의 phenotypic 변조를 정확 하 게 추적 하는 강력한 도구입니다. Tamo...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 그들의 도움에 대 한 피츠버그 대학에서 생물 학적 이미징 (NIH 1S10OD019973-01에 의해 지원)에 대 한 중심을 감사 합니다. 이 작품은 지원 여 D.G. R.A.B.에는 미국 심장 협회에서 15SDG25860021에 의해 지원 되었다 과학 개발 교부 금에 의해 지원 됩니다 NIH 부여 F30 HL136188.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% 파라포름알데히드 수용액전자 현미경 과학RT 15710조직 관류 및 고정
23G 나비 바늘FisherBD367342
25G 바늘Fisher14-821-13D 
A1 컨포칼 현미경니콘컨포칼 현미경
ACTA2-FITC 항체 (마우스)Sigma AldrichF37771차 항체
Alexa-647 anti goatInvitrogenA-214472차 항체
항원 Unmasking solution, 구연산 기반Vector LabsH-3300항원 회수 솔루션
Chow DietHarlan TekladTD.7012
CoverslipFisher12-544-14Any 50 x 24 mm cover glass
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)InvitrogenD1306Nucleus 형광 대조 염색
당나귀 Alexa-488 anti-rabbitInvitrogenA-212062차 항체
Donkey Alexa-555 anti-ratAbcamab1501542차 항체
DPBS 10XGibco 14200166PBS. 탈이온수에 1x로 희석
임베딩 카세트Fisher15-182-701D
ETDA 진공관Fisher02-685-2B
에탄올 200 프루프Decon2701
폼 패드Fisher22-222-012
냉수 어류 피부의 젤라틴Sigma AldrichG7765
GFP 항체(염소)abcamab66731 차 항체
염소 IgG 제어Vector LabsI-5000IgG 제어
고지방 다이어트Harlan TekladTD.88137
ImageJNIH컴퓨터 프로그램 https://imagej.nih.gov/ij/ 
LGALS3 항체 (쥐)CedarlaneCL8942AP일차 항체
LSM700 컨포칼 현미경Zeiss컨포칼 현미경
현미경 슬라이드, Superfrost PlusFisher12-550-15
마이크로톰 블레이드Fisher30-538-35
마우스 IgG 제어Vector LabsI-2000IgG 제어
NIS 요소 이미징 소프트웨어Nikon이미징 소프트웨어 z-stack 이미지 획득
Normal Horse serumSigma AldrichH1270
Pap PenFisher50-550-221
땅콩 오일SigmaP2144
Prolong gold Antifade mountantInvitrogenP36930마운팅 매체 
토끼 IgG 제어Vector LabsI-1000IgG 제어
Rat IgG 제어Vector LabsI-4000IgG 제어
RUNX2 항체 (토끼)Abcamab192256기본 항체
사기BD3096281 ml 주사기
TamoxifenSigmaT5648
XyleneFisherX55K-4
Zen 이미징 소프트웨어z-stack 이미지 획득을 위한Zeiss
칼슘 및 마그네슘이 없는 용액 희석 및 세척을 위한 주 이미징 소프트웨어

References

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