여기서, 3마리의 해양 무척추동물에 대한 마이크로포커스 X선 컴퓨터 단층촬영(microCT) 영상을 수행하기 위한 프로토콜을 상세히 설명한다. 이 연구에서는 샘플 고정, 염색, 장착, 스캐닝, 이미지 재구성 및 데이터 분석과 같은 단계를 설명합니다. 다양한 샘플에 대해 프로토콜을 조정할 수 있는 방법에 대한 제안도 제공됩니다.
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방법 논문
마이크로 포커스 X 선 CT (마이크로CT) 액티니아 에퀴나의 이미징 (Cnidaria), 하모토 sp. (안넬리다), 그리고 Xenoturbella 자포니카 (제나코엘로모파)
이 논문에서
요약
초록
전통적으로 생물학자들은 불투명한 유기체의 내부 구조를 조사하기 위해 절제와 같은 파괴적인 방법에 의존해야 했습니다. 비파괴 마이크로포커스 X선 컴퓨터 단층 촬영(microCT) 이미징은 마이크로CT 하드웨어, 프로세싱 컴퓨터 및 데이터의 샘플 염색 방법 및 혁신분야의 기술 발전으로 인해 생물학 분야에서 강력하고 새로운 프로토콜이 되었습니다. 분석 소프트웨어. 그러나 이 프로토콜은 의료 및 산업 분야에서 일반적으로 사용되지 않습니다. 이러한 제한된 사용 이유 중 하나는 샘플 수집, 고정, 염색, 장착, 스캔 및 데이터 분석과 같은 필요한 모든 단계를 다루는 간단하고 이해하기 좋은 설명서가 없기 때문이다. 또 다른 이유는 메타조안, 특히 해양 무척추 동물의 광대 한 다양성이다. 해양 무척추 동물의 다양한 크기, 형태 학 및 생리로 인해 샘플에 따라 각 단계에서 실험 조건 및 하드웨어 구성을 조정하는 것이 중요합니다. 여기서, 마이크로CT 이미징 방법은 세 가지 계통유전학적으로 다양한 해양 무척추 동물을 사용하여 자세히 설명됩니다: 액티니아 에퀴나(안토조아, 소니다리아), 하모토스p. (폴리채타, 안넬리다), 그리고 제노투르벨라 자포니카 ( 제노투르벨리다, 제나코멜로모파). 다양한 동물에 대한 마이크로CT 이미징 수행에 대한 제안도 제공됩니다.
서론
생물학 연구원은 일반적으로 불투명한 유기체의 내부 구조물을 조사하기 위하여 얇은 단면도를 만들고 빛 또는 전자 현미경 검사법에 의하여 관측을 능력을 발휘해야 했습니다. 그러나 이러한 방법은 희귀하거나 귀중한 표본에 적용할 때 파괴적이고 문제가 됩니다. 또한 포함 및 단면화와 같은 메서드의 여러 단계는 시간이 많이 소요되며 프로토콜에 따라 샘플을 관찰하는 데 며칠이 걸릴 수 있습니다. 또한, 수많은 섹션을 처리 할 때, 손상 또는 일부 섹션을 잃을 가능성이 항상있다. 조직 제거 기술은 일부 시편1, 2,3,4,5에 사용할 수 있지만 아직 많은 동물 종에 적용되지 않습니다.
이러한 문제를 극복하기 위해 일부 생물학자들은 마이크로 포커스 X 선 컴퓨터 단층촬영 (microCT) 이미징 6, 7,8,9
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프로토콜
1. 고정
- 액티니아 에퀴나에대해, 실온에서 약 15분 동안 10% MgCl2 바닷물에서 동물을 이완시. 70% 에탄올로 옮기고 실온에서 보관하십시오.
- Harmothoe sp.의 경우, 동물을 얼음차가운 바닷물에 약 15 분 동안 넣어 마취하십시오.
- Xenoturbella japonica의경우, 담수에서 7% MgCl 2를 사용하여 동물을 이완시하십시오. 하룻밤 여과 된 바닷물에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 고정하십시오. 70% 에탄올에 놓고 4°C에 보관하십시오.
주의: PFA는 위험하며 주의해서 취급해야 합니다.
2. 염색
- 샘플을 50% 에탄올로 옮기고 실온에서 15시간 동안 보관하십시오. 50% 에탄올을 25% 에탄올로 교체하고 실온에서 2시간 동안 보관하십시오.
참고 : 이것은 해수와 10 % (v / v) 포르말린 용액에서 Harmothoe sp. 샘플에 필요하지 않습니다. - 용액을 증류수(DW)로 교체하고 샘플을 실온에서 DW에 2시간 동안 보관하십시오.
- 재고 용액(아래)을 DW로 25%로 희석하....
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결과
우리는 A. equina (안토조아, Cnidaria), 하모토 스p. (폴리채타, 안넬리다) 및 X. 자포니카 (Xenoturbellida, 제나코엘로모파)에서 25 % 루골 용액으로 샘플을 염색 한 후 마이크로 CT 이미징을 수행했습니다. 염색은 성공적으로 내부 연조직의 관찰을 가능하게, 모든 견본에 있는 내부 구조물의대조를 향상했습니다 (그림 6). 과거의 보고서와 함께6,7,16,19,22,23,24,.......
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토론
본 연구에 사용된 해수에서 10% (v/v) 포르말린 용액과 같은 포르말린을 이용한 고착제는 다양한 해양 무척추 동물의 형태를 보존하는 것으로 알려져 있으며 마이크로CT 이미징18,24,25에 자주 사용됩니다. ,26,28,30,33. 그러나, 이 화학 물질의 사용에 대 한 제한은 최근 몇 년 동안일부 국가에서 엄격한 되고있다, 그리고 파라 포름 알데히드 또는 글루타랄데히드 와 같은 대체 사용할 수 있습니다. 스캐닝 후 DNA를 추출할 계획이 있는 경우, DNA를 단편화하는 것으로 알려져 있기 때문에 포르말린을 고정.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
시로이시 도시히코씨의 도움과 연구 환경 제공에 감사드립니다. 야나기 켄스케와 이즈미 다카토에게 A. 에퀴나,다나카 마사츠에 대한 조언을 해주신 것에 감사드립니다. 시모다 해양연구센터, 츠쿠바대학, 미사키 해양생물국, 도쿄대학 의 시모다 해양생물센터 직원에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 영어 편집에 대한 편집 (www.editage.jp)에 감사드립니다. 이 작품은 젊은 과학자를위한 JSPS 보조금 에이드 (A) (JP26711022)와 JAMBIO, 일본 해양 생물학 협회에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 250ml 삼각 플라스크 | Corning | CLS430183 | |
| 5ml 샘플링 튜브 ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50ml 폴리프로필렌 튜브 | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60mm 무처리 접시 | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| 생태 등급 팁(파란색) 1000 &마이크로; l | BMBio | BIO1000RF | |
| 에탄올 | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| 포르말린 | Wako Pure Chemical | Industries 061-00416 | |
| 요오드 | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| 염화마그네슘 육수화물 | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| 파라포름알데히드 | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| 잎자루 바늘 | AS | ONE 2-013-01 | |
| Pipetman P200 마이크로피펫 | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 마이크로피펫 | GILSON | F123602 | |
| 요오드화칼륨 | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| 정밀 핀셋 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI 핏 팁 (옐로우) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| 면도날 | Feather | FA-10 | |
| 링 핀셋 | NAPOX | A-26 | |
| 실체 현미경 | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT 이미징 시스템 | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
참고문헌
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R.
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