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방법 논문

마이크로 포커스 X 선 CT (마이크로CT) 액티니아 에퀴나의 이미징 (Cnidaria), 하모토 sp. (안넬리다), 그리고 Xenoturbella 자포니카 (제나코엘로모파)

8.3K 조회수

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DOI:

10.3791/59161

⸱

2019년 8월 6일

 ,  ,  , 
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

이 논문에서

요약

여기서, 3마리의 해양 무척추동물에 대한 마이크로포커스 X선 컴퓨터 단층촬영(microCT) 영상을 수행하기 위한 프로토콜을 상세히 설명한다. 이 연구에서는 샘플 고정, 염색, 장착, 스캐닝, 이미지 재구성 및 데이터 분석과 같은 단계를 설명합니다. 다양한 샘플에 대해 프로토콜을 조정할 수 있는 방법에 대한 제안도 제공됩니다.

초록

전통적으로 생물학자들은 불투명한 유기체의 내부 구조를 조사하기 위해 절제와 같은 파괴적인 방법에 의존해야 했습니다. 비파괴 마이크로포커스 X선 컴퓨터 단층 촬영(microCT) 이미징은 마이크로CT 하드웨어, 프로세싱 컴퓨터 및 데이터의 샘플 염색 방법 및 혁신분야의 기술 발전으로 인해 생물학 분야에서 강력하고 새로운 프로토콜이 되었습니다. 분석 소프트웨어. 그러나 이 프로토콜은 의료 및 산업 분야에서 일반적으로 사용되지 않습니다. 이러한 제한된 사용 이유 중 하나는 샘플 수집, 고정, 염색, 장착, 스캔 및 데이터 분석과 같은 필요한 모든 단계를 다루는 간단하고 이해하기 좋은 설명서가 없기 때문이다. 또 다른 이유는 메타조안, 특히 해양 무척추 동물의 광대 한 다양성이다. 해양 무척추 동물의 다양한 크기, 형태 학 및 생리로 인해 샘플에 따라 각 단계에서 실험 조건 및 하드웨어 구성을 조정하는 것이 중요합니다. 여기서, 마이크로CT 이미징 방법은 세 가지 계통유전학적으로 다양한 해양 무척추 동물을 사용하여 자세히 설명됩니다: 액티니아 에퀴나(안토조아, 소니다리아), 하모토스p. (폴리채타, 안넬리다), 그리고 제노투르벨라 자포니카 ( 제노투르벨리다, 제나코멜로모파). 다양한 동물에 대한 마이크로CT 이미징 수행에 대한 제안도 제공됩니다.

서론

생물학 연구원은 일반적으로 불투명한 유기체의 내부 구조물을 조사하기 위하여 얇은 단면도를 만들고 빛 또는 전자 현미경 검사법에 의하여 관측을 능력을 발휘해야 했습니다. 그러나 이러한 방법은 희귀하거나 귀중한 표본에 적용할 때 파괴적이고 문제가 됩니다. 또한 포함 및 단면화와 같은 메서드의 여러 단계는 시간이 많이 소요되며 프로토콜에 따라 샘플을 관찰하는 데 며칠이 걸릴 수 있습니다. 또한, 수많은 섹션을 처리 할 때, 손상 또는 일부 섹션을 잃을 가능성이 항상있다. 조직 제거 기술은 일부 시편1, 2,3,4,5에 사용할 수 있지만 아직 많은 동물 종에 적용되지 않습니다.

이러한 문제를 극복하기 위해 일부 생물학자들은 마이크로 포커스 X 선 컴퓨터 단층촬영 (microCT) 이미징 6, 7,8,9,10,11을사용하기 시작했습니다. 12,13,14,15. X 선 CT에서, 견본은 견본의 주위에 이동하는 엑스레이 근원에서 생성되는 각종 각도에서 엑스레이로 조사되고, 전송된 엑스레이는 또한 견본의 주위에 움직이는 검출기에 의해 감시됩니다. 얻어진 X선 전송 데이터는 표본의 단면 이미지를 재구성하기 위하여 분석됩니다. 이 방법을 사용하면 샘플을 파괴하지 않고 내부 구조를 관찰 할 수 있습니다. 그것의 안전과 용이성 때문에, 그것은 일반적으로 의료 및 치과 응용 프로그램에서 사용되며, CT 시스템은 전 세계 병원과 치과 센터에서 찾을 수 있습니다. 또한 산업용 X선 CT는 산업 분야의 검사 및 계측을 위해 비의료 시료를 관찰하는 데 자주 사용됩니다. X선 소스와 검출기가 이동되는 의료 용 CT와 달리 두 부품은 산업용 CT에 고정되어 있으며 스캔 중에 샘플이 회전합니다. 산업용 CT는 일반적으로 의료 용 CT보다 고해상도 이미지를 생성하며 마이크로 CT (마이크로 미터 수준 해상도) 또는 나노 CT (나노 미터 수준의 해상도)라고합니다. 최근, microCT를 이용한 연구는 생물학 14,15,16,17,18,19, 20개 , 21세 , 22세 , 23세 , 24세 , 25개 , 26세 , 27세 , 28세 , 29세 , 30개 , 31세 , 32세 , 33세 , 34.

CT를 이용한 생물학적 연구는 주로 뼈와 같은 단단한 조직으로 구성되는 내부 구조물을 표적으로 했습니다. 다양한 화학 약체를 이용한 염색 기술의 발전으로 다양한 유기체6,7,8,9,14,15에서 연조직의 시각화가 가능 , 16세 , 17세 , 18세 , 19세 , 20개 , 21세 , 22세 , 23세 , 24세 , 25개 , 26세 , 27세 , 28세 , 29세 , 30개 , 31세 , 32세 , 33세 , 34.이들 시약 중, 요오드계 조영제는 비교적 안전하고 저렴하며, 다양한 유기체에서연조직의 가시화에 사용될 수 있다 7,14. 해양 무척추 동물에 관해서는, microCT는 연체 동물6,25,32,33,annelids18,19, 20개 , 28, 및 arthoropods21,23,29,31. 그러나, 다른 동물 필라에 대한 보고는 거의 없었으며, 이러한 bryozoans6,제나코멜로모프26,및 cnidarians24,30. 일반적으로, 척추 동물에 비해 해양 무척추 동물에 microCT를 사용 하 여 적은 연구 되었습니다. 해양 무척추 동물에 이 제한적인 사용에 대 한 한 가지 주요 이유는 이 동물에서 관찰 하는 광대 한 다양성. 그들의 다양한 크기 때문에, 형태학, 및 생리학, 각 종은 다른 실험 절차에 다르게 반응합니다. 따라서 시료 준비 중에 가장 적합한 고정 및 염색 시약을 선택하고 각 종에 대해 조정된 각 단계에서 조건을 설정하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 각 샘플에 대해 장착 방법, 전압, 전류, 기계적 확대 속도 및 공간 분해 전력과 같은 스캐닝 구성을 적절히 설정해야 합니다. 이 문제를 극복하기 위해 필요한 모든 단계를 포괄하는 간단하고 이해하기 좋은 매뉴얼을 통해 각 단계가 시편에 따라 어떻게 조정할 수 있는지 설명하고 여러 샘플의 자세한 예제를 보여 주는 것이 필수적입니다.

본 연구에서는, 우리는 3개의 해양 무척추 동물 종을 사용하여, 견본 고정에서 데이터 분석에 마이크로CT 화상 진찰 프로토콜을 단계별로 기술합니다. 도내 미사키 해양 생물국 근처에서 말미잘 액티니아 에퀴나(안토조아, Cnidaria)의 표본을 수집하였다. 그들은 직경이 약 2cm인 구형의 부드러운 몸을 가지고 있었다 (그림1A-C). 하모토 스프(폴리채타, 안넬리다) 시료도 미사키 해양 생물국 근처에서 채취하였다. 길이가 약 1.5cm인 가느다란 벌레였고, 몸 전체를 따라 터프한 채태가 존재한다(그림1D). 제13회 JAMBIO 해안 생물 공동 조사 에서 쓰쿠바 대학 시모다 해양 연구 센터 근처에서 Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) 표본을 수집했습니다. 길이가 0.8cm에 달하는 부드러운 몸의 벌레였다(그림1E). 각 샘플의 조건 및 구성에 대한 조정에 대해 자세히 설명합니다. 우리의 연구 결과는 해양 무척추 동물에 microCT 화상 진찰을 능력을 발휘하는 방법에 대한 몇몇 제안을 제공하고, 우리는 생물학자가 그들의 연구를 위해 이 프로토콜을 이용하도록 격려할 것이라는 점을 희망합니다.

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프로토콜

1. 고정

  1. 액티니아 에퀴나에대해, 실온에서 약 15분 동안 10% MgCl2 바닷물에서 동물을 이완시. 70% 에탄올로 옮기고 실온에서 보관하십시오.
  2. Harmothoe sp.의 경우, 동물을 얼음차가운 바닷물에 약 15 분 동안 넣어 마취하십시오.
  3. Xenoturbella japonica의경우, 담수에서 7% MgCl 2를 사용하여 동물을 이완시하십시오. 하룻밤 여과 된 바닷물에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 고정하십시오. 70% 에탄올에 놓고 4°C에 보관하십시오.
    주의: PFA는 위험하며 주의해서 취급해야 합니다.

2. 염색

  1. 샘플을 50% 에탄올로 옮기고 실온에서 15시간 동안 보관하십시오. 50% 에탄올을 25% 에탄올로 교체하고 실온에서 2시간 동안 보관하십시오.
    참고 : 이것은 해수와 10 % (v / v) 포르말린 용액에서 Harmothoe sp. 샘플에 필요하지 않습니다.
  2. 용액을 증류수(DW)로 교체하고 샘플을 실온에서 DW에 2시간 동안 보관하십시오.
  3. 재고 용액(아래)을 DW로 25%로 희석하여 25% Lugol 솔루션을 준비합니다. 재고 용액 (100 % 루골 용액)에는 10g의 KI와 5 g의 I2가포함되어 있으며 DW로 100 mL로 조정됩니다.
    참고: Lugol 솔루션은 빛에 민감하므로 빛으로부터 보호되는 솔루션을 저장하고 처리하십시오. 요오드 취급 및 폐기물 처리에 대한 각 국가 및 기관의 규정을 준수하십시오.
  4. 샘플에서 DW를 데낸다음 25% 루골 용액을 붓습니다. 실온에서 24 시간 동안 얼룩을 지피시고.

3. 스테이지 마운팅

  1. 전자레인지에서 250 mL 원추형 플라스크(800W, 약 1-3분)에 DW 100 mL에 500 mg의 아가로즈를 용해시킴으로써 0.5% 아가로스를 준비한다. 실온에서 유지하여 약 30-40°C까지 냉각시.
    주의: 아가로오스가 끓는 것을 방지하기 위해 가열할 때 플라스크를 과열하거나 완전히 밀봉하지 마십시오.
  2. 50 mL 튜브를 사용하여 A. equina와 같은 큰 샘플을 장착합니다.
    참고: 1,000 μL 마이크로파이펫 '블루' 팁에 맞지 않는 대형 시료를 장착하기 위해 50mL 튜브를 사용하십시오.
    1. 얼룩진 샘플을 DW와 함께 60mm 접시에 놓고 표면에서 과도한 염색 용액을 씻어 내보도록 합니다.
    2. 0.5% 아가로즈 5 mL를 50 mL 튜브에 부드럽게 붓고 얼음에 아가로스를 굳게 합니다. 아가로즈에 거품을 만들지 않도록주의하십시오.
    3. 50 mL 튜브에 0.5 %의 아가로스 20 mL을 부드럽게 추가하고 아가로스가 경화되기 시작할 때까지 얼음위에 놓습니다. 집게를 사용하여 0.5% 아가로즈 내에 시편을 놓습니다. 아가로즈에 거품을 만들지 않도록주의하십시오.
    4. 집게로 시료의 위치와 방향을 조정하고 얼음에 아가로스를 굳게 합니다.
    5. 마이크로CT 장착 단계에 점토를 놓고 점토에 50 mL 튜브를 놓습니다 (그림2A).
  3. 1,000 μL 마이크로파이펫 '블루' 팁을 사용하여 하모토 스프 및 X. 자포니카와 같은 작은 샘플을 마운트합니다.
    참고: 더 작은 샘플의 경우 200 μL 마이크로파이펫 '옐로우' 팁을 사용할 수 있습니다. 이 경우 플러그에 아가로오스 30 μL을 사용하고 아가로오스 또는 증류수 200 μL을 첨가하십시오.
    1. 100 μL의 0.5%의 아가로스를 1,000 μL 마이크로파이펫 '블루' 팁으로 끌어올려 얼음 위에 팁을 잡고 팁에 플러그를 만들어 아가로스를 경화시다(그림2B-a).
    2. 스테인드 샘플을 포인을 사용하지 않고 60mm 접시에 넣습니다.
    3. 링 핀셋을 사용하여 샘플을 DW로 다른 60mm 접시에 부드럽게 옮겨 표면에서 과도한 염색 용액을 씻어냅니다.
    4. 마이크로파이펫을 사용하여 0.5% 아가로즈 또는 DW의 1,000 μL을 플러그팁(단계 3.3.1)에 넣습니다.
      참고: 0.5% 아가로즈를 사용하는 것이 좋지만, 아가로가 피해야 하는 깨지기 쉽거나 귀중한 시료에는 DW를 사용하십시오.
    5. 링 핀셋을 사용하여 60mm 접시에서 아가로즈 또는 DW로 샘플을 연결한 팁으로 부드럽게 옮김.
    6. 잎트리산 바늘 또는 정밀 핀셋으로 시료의 위치와 방향을 부드럽게 조정합니다. 마운팅 매체에 거품이 들어가지 않도록 주의하십시오. DW를 마운팅 매체로 사용할 때 팁 의 벽 사이에 샘플이 안정적인지 확인합니다(그림2D-b). 얼음 에 팁을 놓고 마운팅 매체로 사용되는 경우 아가로스를 경화시도록 합니다.
    7. 새로운 1,000 μL 마이크로파이펫 '블루' 팁(그림2B-b,c)의팁을 잘라내고 연결된 팁의 팁을 새 팁에 삽입합니다.
    8. 마이크로CT 장착 단계에 점토를 놓고 점토 내부에 샘플로 팁을 설정합니다 (그림2C,D).
      참고: 염색 용액은 DW에 놓이면 샘플을 씻어 내므로 다음 스캔 단계로 즉시 진행하십시오.

4. 마이크로CT 스캐닝

  1. 80 kV, 100 μA에서 X 선 빔을 켭니다.
  2. 화면 중앙에서 X선 투과 영상을 관찰하면서(그림3A),X축 및 Z축 버튼(그림 3A)을 클릭하여 전체 샘플을 볼 수 있도록 스테이지를 이동하고 수동으로 Y축 노브를 장착 스테이지에서조정합니다(그림 3B). 대비 조건을 조정하여 내부 구조를 관찰할 수 있도록 이미지의 대비를 설정합니다(그림3A: 이미지대비).
  3. 점토에서 튜브/팁의 각도를 변경하여 샘플의 방향을 조정합니다(그림2A). 회전 축(그림3A)을 90으로 설정하고 상대 이동 버튼을 클릭하여 스테이지를 90°로 회전합니다(그림3A). 전체 회전을 완료하기 위해 같은 기동을 네 번 수행합니다.
    참고: 시스템이 자동으로 꺼지지 않는 한 샘플 도어가 열릴 때마다 X선 빔을 수동으로 끕니다.
  4. Z축 버튼(그림3A)을 클릭하고 장착 스테이지에서 Y축노브를 수동으로 조정하여 샘플이 뷰의 중심에 있도록 스테이지를 이동합니다(그림3B). 무대를 90°로 돌리고 동일한 작업을 수행합니다. 스테이지를 360° 회전하고 샘플이 모든 방향에서 뷰의 중심에 있는지 확인합니다.
  5. X축 단추(그림3A)를 클릭하여 X축 을 따라 X선 빔 소스쪽으로 스테이지를 이동하여 샘플을 확대하고 필요에 따라 조정하여 뷰에 딱 맞도록 조정합니다(그림3C).
  6. 스테이지를 360° 회전하고 필요에 따라 조정하여 샘플이 모든 방향에서 보기에 맞도록 합니다.
  7. 표1과 같이 스캔 조건을 조정합니다.
  8. 스캔을 시작하십시오. 약 10분이 소요됩니다.

5. 이미지 재구성

  1. microCT 시스템의 액세서리 소프트웨어를 시작하고(재료 표참조) 스캔한 데이터를 엽니다.
  2. 자동 시프트 값 계산 버튼(그림4A: 녹색 상자)을 클릭하여 스캔하는 동안 샘플의 회전 축의 차이를 조정합니다.
  3. 주황색 화살표를 회전하여 이미지의 방향을 조정합니다(그림4B). 방향이 변경된 경우 5.2단계를 반복합니다.
  4. 영역 탭(그림4C: 마젠타 상자)을 클릭하고 샘플이 없는 영역을 잘라내세요(그림4C: 노란색 상자).
  5. 재구성 탭(그림4D: 마젠타 박스)을 클릭하고 필터를 다음과 같이 설정하여 노이즈를 제거합니다. 링 아티팩트는 필터를 줄입니다: 중앙값 필터 -3; 노이즈 제거 필터: 평균 필터-1.
  6. 재구성 단추(그림4D: 녹색 상자)를 클릭하여 재구성을 수행합니다.
  7. 흑백 값을 검정값 0, 흰색 값 250(그림4D: 파란색 상자)으로 설정하여 이미지 밝기와 대비를 조정합니다.
  8. 저장 버튼을 클릭하여 재구성된 TIFF 이미지 데이터 집합을 8비트 TIFF로 저장합니다. 다음과 같이 TIFF 파일의 이름을 바꿉니다.
    참고 : 이 연구의 원래 microCT 데이터 세트는 Figshare 저장소, doi : 10.6084 / m9.figshare.767083736에서사용할 수 있습니다.

6. 데이터 분석

  1. 데이터 분석 소프트웨어를 시작하고 데이터베이스 아이콘(그림 5A: 마젠타 상자)을 클릭하고 그림 5B에 표시된 상자를 끄면 TIFF 파일을 가져올 수 있습니다.
  2. 가져오기 아이콘(그림5C: 마젠타 상자)을 클릭하고 섹션 5에 저장된 데이터 집합을 선택하고 열기를 클릭합니다.
  3. 복사 링크 버튼(그림5D)을 클릭하여 데이터를 가져옵니다.
  4. 2D 뷰어 아이콘(그림 5C : 파란색상자)을 클릭하여 2D 횡단면을 표시합니다.
  5. 3D 뷰어 탭(그림5E: 마젠타 상자)을 클릭하고 스캔 시 해상도 값을 입력하여 데이터 세트를 보정합니다(이 연구에서 0.018이 [그림5F]).
  6. 밝기/대비 아이콘(그림5E녹색 상자)을 클릭합니다. 표시된 2D 이미지 내부의 커서를 이동하고 창 레벨 및 창 너비를변경하여 밝기와 대비를 조정합니다(그림 5G).
  7. 스크롤 막대를 이동하여 다른 횡단면이미지를 선택합니다(그림5G: 상자).
  8. 방향 아이콘(그림5E: 파란색 상자)을 클릭하여 횡단면의 방향을 변경하고 모든 방향에서 이미지를 선택합니다(그림5H).
  9. 표시된 이미지를 클릭하고 내보내기 탭을 선택하여 횡단면 이미지를 저장합니다.

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결과

우리는 A. equina (안토조아, Cnidaria), 하모토 스p. (폴리채타, 안넬리다) 및 X. 자포니카 (Xenoturbellida, 제나코엘로모파)에서 25 % 루골 용액으로 샘플을 염색 한 후 마이크로 CT 이미징을 수행했습니다. 염색은 성공적으로 내부 연조직의 관찰을 가능하게, 모든 견본에 있는 내부 구조물의대조를 향상했습니다 (그림 6). 과거의 보고서와 함께6,7,16,19,22,23,24,...

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토론

본 연구에 사용된 해수에서 10% (v/v) 포르말린 용액과 같은 포르말린을 이용한 고착제는 다양한 해양 무척추 동물의 형태를 보존하는 것으로 알려져 있으며 마이크로CT 이미징18,24,25에 자주 사용됩니다. ,26,28,30,33. 그러나, 이 화학 물질의 사용에 대 한 제한은 최근 몇 년 동안일부 국가에서 엄격한 되고있다, 그리고 파라 포름 알데히드 또는 글루타랄데히드 와 같은 대체 사용할 수 있습니다. 스캐닝 후 DNA를 추출할 계획이 있는 경우, DNA를 단편화하는 것으로 알려져 있기 때문에 포르말린을 고정...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

시로이시 도시히코씨의 도움과 연구 환경 제공에 감사드립니다. 야나기 켄스케와 이즈미 다카토에게 A. 에퀴나,다나카 마사츠에 대한 조언을 해주신 것에 감사드립니다. 시모다 해양연구센터, 츠쿠바대학, 미사키 해양생물국, 도쿄대학 의 시모다 해양생물센터 직원에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 영어 편집에 대한 편집 (www.editage.jp)에 감사드립니다. 이 작품은 젊은 과학자를위한 JSPS 보조금 에이드 (A) (JP26711022)와 JAMBIO, 일본 해양 생물학 협회에 의해 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
250ml 삼각 플라스크CorningCLS430183
5ml 샘플링 튜브 ST-500BIO-BIK103010
50ml 폴리프로필렌 튜브Greiner Bio One International227261
60mm 무처리 접시IWAKI1010-060
AgarosePromegaV3125
생태 등급 팁(파란색) 1000 &마이크로; lBMBioBIO1000RF
에탄올Wako Pure Chemical Industries057-00451
포르말린Wako Pure ChemicalIndustries 061-00416
요오드Wako Pure Chemical Industries094-05421
염화마그네슘 육수화물Wako Pure Chemical Industries135-00165
OsiriX DICOM ViewerPixmeo SARLOsiriX MD v10.0https://www.osirix-viewer.com
파라포름알데히드Wako Pure Chemical Industries163-25983
잎자루 바늘ASONE 2-013-01
Pipetman P200 마이크로피펫GILSONF123601
Pipetman P1000 마이크로피펫GILSONF123602
요오드화칼륨Wako Pure Chemical Industries166-03971
정밀 핀셋 5DUMONT0302-5-PS
QuickRack MultI 핏 팁 (옐로우) 200 ulSorenson10660
면도날FeatherFA-10
링 핀셋NAPOXA-26
실체 현미경LeicaMZ95
X-ray Micro-CT 이미징 시스템ComscantechnoScanXmate-E090S105

참고문헌

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마이크로 포커스 X 선 CT (마이크로CT) 액티니아 에퀴나의 이미징 (Cnidaria), 하모토 sp. (안넬리다), 그리고 Xenoturbella 자포니카 (제나코엘로모파)
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