여기 우리 organotypic 슬라이스 문화 마우스 소 뇌 및 myelination와 중앙 신 경계에 remyelination의 메커니즘을 조사 적합 immunohistochemistry에 의해 얼룩 myelin 칼 집에서 준비 하는 방법을 제시.
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이 논문에서
요약
초록
신 경계에서 수 초 이며 glial myelinating에 의해 생성 된 복잡 한 막 구조 세포, 어떤 ensheathes 축 삭 빠른 전기 전도 용이 하 게. Myelin 변경 어디 기능적인 적자와 관련 된 다양 한 신경 질환에 표시 되었습니다. 여기, 우리는 전직에 대 한 자세한 설명을 제공 vivo 모델 마우스 organotypic 소 뇌 조각, 여러 주 및 추가 표시 myelin를 시각화를 위한 문화에서 유지 될 수 있는 구성 된.
서론
신경 세포는 그것의 환경 및 생성 및 다른 세포에 전기 자극의 전파를 보장 하는 축 삭에서 입력을 받는 somato 수지상 구획을 구성 하는 매우 편광된 세포 이다. 빠른 전파와 정보의 적시 납품은 신경 시스템의 적절 한 작동에 대 한 필수적입니다. 척추 동물, 그것은 myelination axonal 전도 속도1증가 수에 의해 촉진 된다. Myelin 압축된 계층 myelinating 명과 의해 생성 된 플라즈마 멤브레인의 중앙 신경 조직 (CNS)에 즉 oligodendrocytes 및 Schwann 세포는 말 초 신 경계 (PNS)에 의해 형성 된 특수 구조 이다. CNS 그리고 PNS에서 둘 다, axoglial 상호 작용 드라이브 전문된 axonal 도메인의 형성: 노드의 Ranvier와 그들의 주변 도메인, paranodes, 및 juxtaparanodes2. 수 초, 또는 internodes, 전압 개폐 나트륨 채널 (Nav)에서 풍성 하 게 하는 작은 unmyelinated 도메인에 해당 하는 노드의 Ranvier와 대체 절연 axonal 세그먼트. 높은 농도 및 노드의 Ranvier에서 나v 채널의 급속 한 활성화 활동 전위 그리고 myelin 칼 집의....
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프로토콜
동물을 포함 하는 모든 작업 준수 기관 정책 및 지침 UPMC, INSERM 프랑스 및 유럽 공동체 위원회 지시 86/609/EEC에 의해 설립.
1. 준비 문화 매체와 문화의 삽입 (실습 시간 ≈ 10-15 분)
참고: 흐름 문화 후드 무 균 조건 하에서이 단계를 수행
- 50%로 구성 된 문화 매체의 40 mL를 준비 공학은, 25% 행 크의 균형 소금 솔루션 (1x), 25% 열 비활성화 말 혈 청, 2mm 글루타민 파생, 100 IU/mL 페니실린-스와 4.5 mg/mL D-포도 당 보충. PH 7.4에 조정 합니다.
- 필터-소독 매체 50 mL 플라스틱 주사기에 적응 0.22 μ m 필터를 통해.
참고: 적어도 일주일에 4 ° C에서 문화 매체를 저장할 수 있습니다. - 6 강아지의 표준 쓰레기, 대 한 두 개의 살 균 6 잘 플레이트를 사용 합니다. 각 접시에 대 한 커버를 제거 하 고 잘 당 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다.
- 장소 문화 삽입 각 개별 잘 소독 집게와 플라스틱 가장자리를 눌러. 접시에 다시 커버를 넣어.
참고:
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결과
Organotypic 소 뇌 조각 PLP GFP 유전자 변형 마우스 (그림 2B), 뿐만 아니라 Purkinje 세포 얼룩 함께 P9-P10 C57black6 야생-타입 (WT) (그림 2A)에서 얻은 대표 myelin immunostainings의 예. 소 뇌 조각 백색 질에서 미는 folia의 주변으로 조각의 영역 트랙과 myelination Purkinje 세포의 주로 6 ~ 7 후 달성 팀 7 DIV에서 전체 demyelination의 유도 LPC 치료 (그림 2Ci-ii)를 통해 가능 하다. 다음 demyelination, 슬라이스 자발적으로 remyelinate는 완전히 remyelinated demyelination (그림 2Ciii.......
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토론
여기, 우리는 전을 생성 하는 프로토콜 세부 vivo 모델 마우스 소 뇌 organotypic 슬라이스 문화에 해당 게시 방법15,,1619 및 후속 myelin 이전에서 적응 이러한 준비의 immunostaining입니다. 이 전략 모두 건강 하 고 병 적인 상태에는 고해상도와 수 초 구성 요소를 시각화 하는 가능성을 제공 합니다.
10 일 된 쥐에서 가져온 소 뇌 organotypic 조각 문화는 가장 해 부 재현 하 수 분자 및 세포 메커니즘 myelination 및 remyelination 프로세스 기본 조사를 확고 실험 모델 및 생체 조건 뿐만 아니라 잘 정의 된 세포질 건축 뿐만 아니라 성숙 타임 라인17의 보존을 포함 하 여 해당 조직의 기능 기능. 또한, 소.......
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공개 사항
작가의 아무도 경쟁 관심사 또는 상반 되는 관심사를 있다.
감사의 글
우리에 대 한 귀중 한 의견 원고 박사 숀 프리먼, 닥터 나탈리 솔-Foulon와 박사 토마스 루 감사합니다. 이 작품 INSERM, ICM, ARSEP 교부 금 R13123DD, ANR R17127DD (광고)에 FRM 친목, SPF20110421435 (광고)에 의해 투자 되었다 (몬태나)를 FDT20170437332. 우리는 icm CELIS 셀 문화 시설 감사합니다. 양의 이미징 플랫폼입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BME 배지 | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank' ThermoFisher | Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| 열 비활성화 말 세럼 | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin– 스트렙토마이신(10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey' s 균형 잡힌 소금 용액 | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-글루코스 용액(45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| 리소포스파티딜콜린(LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| 파라포름알데히드(PFA) | 전자 현미경 과학 | 15714 | |
| 앱솔루트 에탄올(100% 에탄올) | VWR Chemicals | 20821.330 | -20°C에서 냉각; C |
| 트리톤® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP 항체 (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) 항체 (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) 항체 (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP 항체 (Rat, Hybridoma) | K. Ikenaka 박사의 선물; 일본 오카사키, | 석 1/5 to 1/10 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| 조직 다지기 | McIlwain | ||
| 면도날 | |||
| 대형 가위 | FST | 14101-14 | |
| 소형 가위 | FS | T 91500-09 | |
| 미세 직선 집게 | FS T | 91150-20 | |
| 곡선 - 미세 집게 | F.S.T | 11297-00 | |
| 세포 배양 접시 (60mm 및 100mm) | TPP | ||
| 4-, 6-웰 배양 플레이트 | TPP | ||
| 밀리 세포 배양 인서트 (0,4 µ m, 직경 30mm) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| 세포 배양 인큐베이터 | 37°C; C, 5% CO2 | ||
| 미세 엔드 피펫 팁 | Dutscher | 134000CL | |
| 광형 피펫 팁 | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| 멸균 주사기 | Terumo Europe | 20 또는 50 mL | |
| 멸균 주사기 필터 | Terumo Europe | 0.22 µ m | |
| 메스 | Swann-Morton | 0510 | |
| 브러시 | |||
| 현미경 슬라이드 | RS 프랑스 | 76 mm x 26 mm x 1.1 mm | |
| 유리 커버 슬립 | RS 프랑스 | 22 mm x 22 mm | |
| Kimtech Sciences 조직 와이퍼 | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| 쌍안 현미경 |
참고문헌
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple scleros....
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