이 연구는 cytometry 반응성 산소 종 (선생님) 생산은 FcγR의 활성화에서 결과 검색의 사용을 보여줍니다. 항균 및 산화 환 원 신호 면역성이 있는 복합물, opsonized 미생물, 또는 직접 FcγR cross-linking에 식 세포의 기능을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
산화 또는 호흡기 버스트는 다양 한 면역 자극에 응답 식 세포에 의해 산소의 급속 한 소비와 반응성 산소 종 (ROS)의 발생을 설명 하기 위해 사용 됩니다. 선생님 면역 활성화 중 생성 된 미생물의 죽음을 일으키는 주로 손상 DNA와 단백질, 선생님의 능력을 통해 강력한 항균 활성을 발휘 한다. Reproducibly 고 쉽게 선생님 생산을 측정할 수 있는 다양 한 경로 호스트 방어의이 메커니즘을 분자의 기여를 평가 하기 위해 필요 하다. 이 종이에 우리 형광 프로브의 사용과 cytometry 선생님 생산 검색 합니다. 널리 사용 되지만, 선생님의 형광 측정 특정 하지 mitogenic 자극에 의해 유도 된 선생님의 측정에 관하여 특히 악명 높게 문제 이다. 우리는 대 식 세포 생성, 못쓰게, 얼룩, FcγR 교차 연결, 및 결말 흐름 cytometric 분석 시작 특정 FcγR 자극 결과로 생성 된 선생님을 감지 하는 상세한 방법론 제시.
서론
반응성 산소 종 (선생님)는 반응 분자 또는 호 기성 호흡 ( 1에서검토)의 부산물입니다 자유 래 디 칼. Superoxide 음이온, 과산화 수소, 과산화 수소, 수 산 기 과격 한, 그리고 수 산 기 이온, 다른 사람의 사이에서 포함 됩니다. 정상적인 생리 적인 조건 하에서 선생님 미토 콘 드리 아와 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (NADPH) oxidases에 의해 주로 생성 하 고 다양 한 효소와 단백질 superoxide dismutase, glutathione 등 여 detoxified 빠르게. 선생님 또는 선생님을 제거 하는 기능에 결함의 과장 된 생산 산화 스트레스, 반응성 산소 종 단백질, 지질, 및 세포 스트레스 또는 죽음 및 병 적인 질병 상태를 선도 하는 DNA의 손상을 촉진 하는 그것에 의하여 발생할 수 있습니다. 그러나, 그것은 현재 감사 선생님 수 있습니다. 신호 분자 (산화 환 원 신호), 또한 역할을 하 고 다양 한 분자 및 통로 중간체의 수정 선생님 중재 세포질 물질 대사, 증식, 생존, 선 동적인 영향을 미칠 수 있습니다. 신호, 그리고2노화입니다. Phagocytic 세포에서 선생님 소위 "호흡 파열"1,
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프로토콜
처리 하는 동물에 대 한 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 센트럴 플로리다 대학의에 의해 승인 되었다.
1. 골 수의 생성 유래 세포 (BMDMs)
-
문화 미디어 준비
- D10F 기본 미디어 준비:에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM), 추가 10% 열 소 태아 혈 청 (FBS), 1 m m 나트륨 pyruvate, 10 m m 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 산과 0.05 m m β-mercaptoethanol 비활성화.
참고: 신선한 D10F 미디어를 사용 하는, D10F 기본 미디어 수 준비까지 2 주를 사전에 주 내 여러 실험에 사용할. 1 마우스에 대 한 D10F 기본 미디어의 약 175 mL 이며 필요한 (뼈를 25 mL) 대 식 세포 감 별 법 미디어 있도록 150 mL - LADMAC 성장 미디어 준비:에 글의 최소 필수 매체 (EMEM), 추가 10% 열 비활성화 FBS 및 2 m L-글루타민. 당신의 문화를 시작 하려는 날에 미디어 신선한을 준비 합니다.
참고: LADMAC 성장 매체의 1 개 리터 약 (19) 50 mL aliquots ....
- D10F 기본 미디어 준비:에 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM), 추가 10% 열 소 태아 혈 청 (FBS), 1 m m 나트륨 pyruvate, 10 m m 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 산과 0.05 m m β-mercaptoethanol 비활성화.
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결과
내에서 설명 된 프로토콜을 사용 하는 FcγR 통해 WT C57BL/6J BMDMs의 자극에서 발생 하는 선생님 생산의 흐름 cytometric 탐지를 보여주는 대표적인 데이터 선물이. 예상 대로, 우리 unstimulated 셀에 배경 수준 이상의 FL1 또는 FL2 형광에서 최소한의 변화 관찰 (그림 3A, "스테인드, unstimulated" vs "흠 없는, unstimulated" 점 플롯 비교). 우리는 셀 FcγR cross-linking 대리인 (그림 3A, 대 비교 "얼룩이 지 고 Fc cross-linking 통해 자극" 샘플 "스테인드, unstimulated" 점 플롯)와 자극은 때 FL1 및 FL2 형광에 표시 된 증가 관찰 합니다. 마지막으로 때 셀 FcγR cross-linking 이전 선생님 억제제로 치료 했다,이 증가 된 형광은 돌아온 기초 수준에 (그림 .......
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토론
DCFH2-다 고 선생님의 DHE 기반 탐지 기술은 널리 사용14,15입니다. 사용의 용이성과 이러한 선생님 프로브 키네틱 microplate 형식에 대 한 적응성, 형광 현미경 검사 법 또는 흐름 cytometric 분석은 그들의 인기에 기여 했다. 그러나, 우리의 연구에서 FcγR 중재 하는 대 식 세포 기능, 거기 보이지 않았다 될 FcγR 상호 연결 된 셀의 흐름 cytometric 분석을 위한이 분석을 수행 하기 위한 표준 프로토콜. 평가 되는 analytes의 반응 특성을 감안할 때, 우리는 발견 타이밍 확인 재현성을 달성에 중요 한 중요성의 이다. 우리 또한 키네틱 microplate 분석 실험을 수행 했습니다, 하지만 있을 수 있습니다 넓은 가변성 형광의 강도 실험에서 실험, 통계 분석에 대 한 복제 집계 생물에 게 어려운. 흐름 cytometric 사용이이 프로브는 이러한 문제를 해결 하지.......
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공개 사항
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
감사의 글
저자는 Madelyn H. 밀러, 등 오마르 카 르도 나, Andjie Jeudy, Roopin 싱 실험실 유지와 마우스 식민지 유지 관리에 그들의 도움에 대 한 Tigno-아 랑 페 즈 연구소의 다른 회원 들에 게 감사 하 고 싶습니다. 이 연구에 대 한 지원 그랜트 R00 HL122365와 J.T.T-a 시작 자금에 의해 제공 된
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| kappa IBSA9E2C2 | BSA IgG1 | 혁신적인 연구 | |
| ; Isotype Ctrl 항체 | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 항체는 Alexa Fluor 647에 접합 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 항체는 FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b 항체는 Alexa Fluor 647에 접합; | BioLegend | 101218 | |
| 베타-메르캅토에탄올 (BME) | 시그마 | M3148-100ml | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) 분수V | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | 재고 번호 : 000664 | |
| CM-H2DCFDA | 분자 프로브 | C6827 | Enzo 키트의 산화 스트레스 검출 시약을 대체 할 수 있습니다 |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 의 과산화물 검출 시약을 대체 할 수 있습니다.31053-028 | |
| DMF 무수 | Acros Organics | 61094-1000 | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC 쥐 IgG2a, κ Isotype Ctrl 항체 | BioLegend | 400506 | |
| Hepes (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L 글루타민 | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC 세포 | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| 마우스 IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N- 아세틸 -L- 시스테인 | EMD Milipore | 106425 | Enzo 키트의 ROS 억제제/제거제를 대체할 수 있습니다 |
| Autosampler가 있는 Novocyte 유세포 분석기 | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| 트립신-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
참고문헌
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462....
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재인쇄 및 허가
