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방법 논문

시드 및 마우스 모델에서 생 합성 조직 설계 Tracheal 이식의 이식

6.6K 조회수

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DOI:

10.3791/59173

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2019년 4월 1일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology Head & Neck Surgery, Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3Center for Regenerative Medicine, Research Institute at Nationwide Children's Hospital, 4Center for Perinatal Research, Nationwide Children's Hospital, 5Nanofiber Solutions, Inc., 6Department of Pediatric Surgery, Nationwide Children's Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이식 협 조직 설계 기도 교체에서 중요 한 장애물을 포즈. 협 기본 셀룰러 메커니즘을 조사, 우리 시드 골 단 세포 (BM-MNC)와 조직 설계 tracheal 교체의 murine 모델을 활용 합니다. 여기, 우리가 우리의 프로토콜을 비 계 제조, BM MNC 절연, 이식 시드, 및 주입을 포함 하 여 선발.

초록

선 천 성 또는 보조 긴 세그먼트 tracheal 결함에 대 한 치료 옵션 역사적으로 기능 조직을 대체 하는 무 능력으로 인해 제한 되었습니다. 조직 공학 3 차원 비 계에 세포 신호 분자를 통합 하는 기능과 잠재적인 솔루션으로 위대한 약속을 보유 하고있다. 조직 설계 tracheal 이식 (TETGs)와 최근 작품 본 일부 성공 하지만 그들의 번역 이식 협 착에 의해 제한 되어, 붕괴, 이식 epithelialization 지연. 이러한 문제를 운전 하는 메커니즘을 조사 하기 위하여 우리는 조직 설계 tracheal 이식 이식에 대 한 마우스 모델을 개발 했습니다. TETGs 애완 동물 및 PU (과 % 무게)의 혼합물에 electrospun 고분자 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물)과 폴리우레탄 (PU)를 사용 하 여 건설 되었다. 건설 기계 했다 다음 골 단 세포 6-8 주에서 격리를 사용 하 여 시드-그라데이션 원심 분리에 의해 오래 된 C57BL/6 쥐. 이식 당 10 백만 셀 발판의 루멘에 시드 되었고 제 3의 그리고 일곱 번째 tracheal 반지 사이 주입 전에 밤새 품 어 수 있습니다. 이러한 이식 협 착 증의 결과 정리 할 수 있었고, 조직학 분석과 면역 형광 검사에서 기저 상피 세포 각 질 5와 각 질 14의 부족에 의해 증명으로 epithelialization를 지연. 이 모델은 개장 하는 호스트에 관련 된 세포 및 분자 메커니즘을 조사 하기 위한 도구로 될 것입니다.

서론

긴 세그먼트 tracheal 결함 완전 tracheal 반지 및 tracheal agenesis로 외상, 악성 종양, 감염 등 희귀 한 선 천 적 조건으로 제시할 수 있습니다. 성인 또는 어린이 tracheal 길이의 30%에서 6 cm를 초과 하는 경우 이러한 결함 수술 재건에 의해 대우 될 수 없습니다. 자가 조직, 싱가포르로 이주, 및 인공 구조와 기도 대체 하려고 만성 감염, 알갱이 만듦, 기계 고장, 그리고 협 착 증에 의해 괴 롭 혀 되었습니다.

조직 설계 tracheal 이식 (TETGs) 잠재적으로 평생 면역 억제에 대 한 필요성을 피하고 있는 동안이 문제를 해결할 수 있습니다. 지난 10 년간에서 TETGs 동물 모델에서 테스트 고 동정 사용1,2,3의 드문 경우에 임상적으로 활용 되었습니다. 임상 및 큰 동물 연구에서 조직 설계 기도 교체에서 수술 복구 필요한 전투 협 수많은 개입 (정의 > 50 %luminal 좁히기) 고 기도 patency 유지. 추가 TETG 작업을 선택, vascularization와 비 계 디자인 시드 셀의 역할 평가 통해이 협 착이 증을 줄이기 위해 노력해왔다. 셀 시드 선택 및 비 계 디자인 네이티브 기관지 구조/기능을 복원 하기 위한 주로 호흡 상피 세포 및 다양 한 resorbable, 비-resorbable 및 decellularized 건설 기계에 시드 chondrocytes에 집중 되었습니다. 로 vascularization 가능성이 협의 개발에 중요 한 역할을, 다른 그룹 생체 외에서 또는 heterotopic 모델 revascularization 또는 neoangiogenesis4를 신속 하 게 최적화에 집중 했다. 그럼에도 불구 하 고, 또한 기계적으로 유능 하 고 기능 TETG를 유지 하면서 성공적인 vascularization 달성 도전 남아 있습니다. 최근 발전에도 불구 하 고 협 최소화 임상 번역 중요 한 장애물을 남아 있다.

이 histopathological 응답 TETG 주입에서 vivo에서조사, 우리 조직 설계 tracheal 교체의 양 모델을 개발 했다. 이식 혼합된 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물)과 폴리우레탄 (PU) electrospun 비 계 골 파생 된 단 세포 (BM-MNCs) 시드 구성 되었다. 이 작은 일대에 우리 시드 헌 BM MNCs 다시 epithelialization 가속 및 지연 협5시연. 비록 헌 BM MNCs 향상 생존 시드는 BM MNCs 조절 기능 neotissue의 형성 세포 메커니즘 불분명 남아 있습니다.

조직의 murine 모델의 세포질 수준 필요한 개발 조사 설계 tracheal 교체. 양 연구와 마찬가지로, 우리는 BM로 시드 PET:PU electrospun 비 계 활용-MNCs. 일관성 양 모델, TETG 협 이식1,2,3 다음 첫 2 주에 걸쳐 개발 ,5. 이 murine 모델을 더 기도 협 착을 기본 셀룰러 메커니즘을 심문 이전에 관찰 병 리 지 제안 했다.

이 보고서에서 우리 조직 설계 tracheal 교체 비 계 제조, BM MNC 절연, 시드, 이식 및 이식 (그림 1, 그림 2)를 포함 하 여 마우스 모델에 대 한 우리의 프로토콜 세부.

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프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 전국 어린이 병원에 의해 승인 되었습니다.

1. 비 계 제조

  1. 하 여 폴리머 nanofiber 전조 솔루션 준비: 1) 녹이는 8 wt % 애완 동물 2) 실 온에서 1,1,1,3,3,3 hexafluoroisopropanol에서 3 wt %PU 용 해 하 여 1,1,1,3,3,3 hexafluoroisopropanol 및 60 ° C에 솔루션을가 열.
  2. 일단 냉각, 애완 동물 및 PU (과)의 최종 폴리머 혼합물을 만드는 솔루션을 결합 합니다.
  3. 스테인레스 스틸 로드 (1 밀리미터 직경)에 PET+ PU 솔루션 PET:PU 솔루션으로 가득 60 mL 주사기에 20 G 무딘 팁 바늘을 이용 하 여 높은 전압 DC 전원 공급 장치 설정 14 사용 하 여 바늘, 다른 높은 전압 DC 전원에 kV 공급-3로 설정 하는 Electrospin kV 5 mL/h 흐름 속도 20 cm 팁-기판 거리. 섬유 증 착 동안 350 rpm에서 막대를 회전 합니다.
  4. 300 µ m의 원하는 비 계 벽 두께 얻을 때까지 전기를 계속 합니다. 비 계는 막대에서 슬라이드 다음 하룻밤 어떤 잔여 용 매를 제거 하려면 진공에서 개최.
  5. 이식 전에 350 mJ/cm2 의 자외선 빛 복용량을 사용 하 여 발판 소독.

2. 골 수 파생 된 단 세포 (BM-MNC) 수확

  1. 안락사는 6-8 주 오래 된, 여성, C57BL/6 마우스 마 취 제 (200 mg/kg), xylazine (20 mg/kg)과 ketoprofen (10 mg/kg)의 칵테일. 꼬리 핀치 방법으로 완전 한 안락사에 대 한 확인 합니다. 안락사에 대 한 지역의 지침을 따르도록 해야 합니다.
  2. 무 균 조건 하에서 화관과 tibias 좋은 위 및 마이크로 Adson 집게를 사용 하 여 뼈를 노출 하는 피부를 제거 합니다. Dumont #5 집게 및 Dumont #5/45 집게를 사용 하 여 근 막 및 힘 줄을 제거 하. 뼈를 분리 하 고 양쪽에 그들의 각각을 잘라. 5 mL 주사기와 25 G 바늘 using Rosewell 공원 기념 연구소 (RPMI) 미디어의 30 mL를 포함 하는 페 트리 접시에 골 수 플러시. 50 mL 튜브에 70 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 골 수와이 RPMI를 필터링 합니다.
  3. Biosafety 내각에 15 mL 튜브에 polysurcrose와 나트륨 diatrizoate의 5 mL을 놓습니다. 2 개의 층의 혼합을 방지 하려면 RPMI 튜브의 측면 골 단 세포를 포함 하는 부드럽게 추가 합니다. 원심 분리기와 30 분 461 x g 에 "브레이크 1" 24 ° c.에
    참고: 우리의 원심 분리기에 브레이크 1 약자는 긴 시간 감속 동안에 밖으로 실행합니다.
  4. 형성 하는 3 개의 층에서 플라즈마의 탑 (핑크) 레이어를 삭제 하 고 골 단 세포로 구성 된 중간 (명확한) 레이어를 수집 합니다. 적혈구의 침전을 삭제 합니다.
  5. 24 ° c.에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) "브레이크 9" 1:1 비율에 461 x g 에서 원심 분리기로 10 분에 골 단 세포 (BM-MNC)를 희석
  6. 상쾌한을 제거 하 고 PBS의 5 mL와 펠 릿을 희석. 원심 분리기로 10 분 동안 461 x g 에 "브레이크 9" 24 ° c.에
  7. 제거는 상쾌한 고 RPMI의 ~ 10 mL와 펠 릿을 희석.
  8. 0.4 %trypan 파랑 1 mL 튜브에의 동등한 양으로 BM MNC 솔루션의 10 µ L를 희석. 챔버 슬라이드를 계산 하는 셀에 솔루션의 장소 10 µ L. 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 단계를 반복 하 고 셀의 평균 수를 계산 합니다.
    참고: 1 X 108 셀의 평균 세포 수 두 기증자 마우스의 사용에서 얻은 했다. 이 두 개의 화관에 해당 될 것 이며 골 수 뼈 두 tibias 격리.
  9. 24 ° c.에서 10 분 동안 461 x g 에서 BM MNC 솔루션 "브레이크 9" 원심 상쾌한을 제거 하 고 107 셀/이식에 셀 농도 희석.
    참고: 우리 공부 1, 10 및 100 백만 셀 사이의 효율 시드 하 고 이식 당 10 백만 셀 높은 시드 효율 산출 발견.

3입니다. 세포는 이식에 시드

  1. 장비의 길이 측정 하 고, 필요한 경우 5 m m의 길이에 그들을 잘라.
  2. 미리 젖은 5 분 제거는 RPMI 위한 RPMI의 5 µ L로 비 계.
  3. 10 분 동안 발판의 루멘에 BM MNC 솔루션의 5 µ L를 추가 합니다.
  4. 이식의 루멘을 통해 21 G 바늘을 통과 하 고 품 어 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 RPMI의 1000 µ L에 이식.

4. 이식 이식

참고: 관리는 이식 이식 절차 동안 무 균 기법을 유지 하기 위해 취해야 한다.

  1. 받는 사람으로 6 8 주 오래 된 여성 C57BL/6 마우스를 사용 하 여 셀 시드 이식에 대 한. Enrofloxacin (10 mg/kg) 피하 주사의 바로 전에 절 개 수술 전과 24 h.
  2. 그리고 마우스 무게 intraperitoneally 진통으로 케 타 민 (100mg/kg), xylazine (10 mg/kg)과 ketoprofen (5 mg/kg)의 마 취 칵테일의 0.1 mL/10 g 복용량을 관리.
  3. 마 취의 비행기 꼬리 핀치 방법에 의해 달성 되었습니다 경우 확인 하십시오. 진정의 수준을 확인, 눈에 불 임 안과 연 고를 적용 하 고 clavicles에서 턱 수술 사이트에 머리를 클립. 장소 등 휴식 위치에서 패드에 동물. Povidone-요오드 준비 패드, 뒤에 알코올 준비 패드 (70% 알코올), 그리고 한 번 더 povidone-요오드 준비 패드 먼저 사용 하 여 수술 부위의 소독.
  4. 외과 의사에서 머리와 해 현미경 동물을 놓습니다. 좋은 위 및 마이크로 Adson 겸의 도움으로 hyoid 뼈는 clavicles에서 배열 하는 중간 절 개를 확인 합니다. Dumont # 5와 필요, 하 고 자기 유지 Colibri 견인 삽입 경우 멸 균 면봉 함께 Dumont #7 좋은 집게 근 막 청소.
  5. 갑 상선 연골, 반지 연골과 기도 노출 하 몬 트 #5 및 Dumont #7 좋은 집게와 스트랩 근육 (그림 3A)를 엽니다. 퉁 명 스럽게 회귀 후 두 신경 식도 (그림 3B)에서 기도의 원주 분리 뒤 양쪽에 병렬 실행에서 기도 구분 합니다.
  6. Using 20 G 바늘과 수술 표식, 기관지의 앞쪽 부분 얼룩.
  7. 기도 식별 하 고 세 번째 tracheal 연골 반지 아래 절 개 transect 욕실이 Tubingen 봄이 위 및 Dumont #7 좋은 집게의 쌍을 사용 하 여 기관. 고급 곡선된 겸 자와 그것을 잡고, 살 균을 사용 하 여 흉 골을 말 초 기관지를 만드는 임시 tracheostomy (그림 3C) 9-0 나일론 봉합 보안. 참고: 사용할 수 있는 대체 봉합 사 물자 tracheal 주입 및 근육 reapproximation에 대 한 9-0 PDS는.
  8. 20 G 바늘과 수술 표식, 앞쪽 부분을 표현 하기 위해 이식 얼룩.
  9. 근 위-후부, 인접 측면 삽입 이식 임 플 란 트 하 고 9-0 살 균 나일론 봉합 (그림 3D), 몬 트 # 7을 사용 하 여 순서 대로 인접 앞쪽 봉합 좋은 집게와 바늘 홀더.
  10. 외과에서 꼬리를 동물 180 °를 설정 합니다. 임시 tracheostomy를 놓습니다. 말 초 기관 철회에 대 한 그 루터 기로 절제 세그먼트의 사용을 허용 하도록 transected 불완전 이다. 더 이상 필요 하지, 5 MM 기관 세그먼트 완전히 제거 됩니다.
  11. 근 위 문 합으로 비슷한 패션에는 봉합을 배치 하 여 원심 문 합을 완료 합니다.
  12. 다시 이식 위치와 스트랩 근육 대략적인. 운영 하는 본에 9-0 살 균 나일론 봉합을 사용 하 여 절 개를 닫습니다.
  13. Buprenorphine (0.1 mg/kg)의 0.1 mL를 피하 주사 하 고 다른 동물 케이지에서 없이 난방 패드에 복구에에서 동물을 배치.
  14. 의식 하 고 ambulate, 다음 부드러운 침구, 촉촉한 차 우와 48 h에 대 한 치료 물 (이 부 프로펜, 30 mg/kg)로 새로운 케이지를 마우스를 전송할 수 있게 될 때까지 마우스를 관찰 합니다. 이 기간 후 마우스를 다른 마우스와 일반 케이지 돌아갑니다.
    참고: 마우스는 호흡 곤란을 유지 또는 이식 후 활동 감소는 32 ° C 배양 기에서 실험실 및 동물 또는 직원에 의해 관찰 된다. 이 48 시간 이상 계속 되 면 쥐 안락사 해야 한다.

5. 조직학 및 Immunohistochemistry

참고: Hematoxylin에 오신 얼룩 했다 표준 기술을 사용 하 여 의해 수행 전국 어린이 병원 형태학 코어. Immunohistochemistry에 따라 수행 된 단계 아래.

  1. 슬라이드 deparaffinize H2O (dH2O) 5 분 5 분, 5 분 동안 2) 크 실 렌, 5 분, 5 분의 4) 90% 에탄올, 5 분, 5) 70% 에탄올 3) 100% 에탄올에 대 한 1) 크 실 렌을 사용 하 여 6) 증류수.
  2. 시트르산 버퍼에 슬라이드를 잠수함과 물 가득 압력 밥 솥에 놓습니다. 다음 10 분 동안 열 실내 온도에 냉각 수 있습니다. 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA-PBS) PBS에와 dH2오 분 린스 세척
    참고: 난방도 온수 욕조 또는 15 분 동안 전자 레인지로 할 수 있습니다.
  3. 3% 정상 염소 혈 청 PBS에 실 온에서 1 h와 슬라이드를 품 어. 0.1%와 세척 5 (1:1000)6각 질 14 (1: 250)6 , 4 ° c.에 하룻밤 18 h f 4/80 (1: 100)7 BSA-PBS 5 분에 대 한 각 질에 대 한 농도와 1 차 항 체에 품 어
  4. 0.1% BSA PBS 두 번 10 분 동안 각 세척 세척. K5/K14 및 1:300 F4/80 실 온에서 1 h 1: 500의 농도에서 적절 한 2 차 항 체로 품 어. 0.1% BSA PBS 두 번 10 분 동안 각 세척 세척.
  5. 마운트 4', 6-diamidino-2-phenolindole를 사용 하 여 (DAPI) 포함 하는 설치 미디어와 유리 커버 전표. 이미징 하기 전에 30 분 동안 앉아서 수 있습니다.

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결과

그림 1 에서는 TETG 시드 및 이식의 회로도를 보여 줍니다. 골 수는 C57BL/6 마우스에서 수확 했다 하 고 체 외에서배양. BM MNCs 밀도 원심 분리에 의해 분리 되었고에 TETG에 시드. 시드 TETGs syngeneic 받는 사람 C57BL/6 마우스에 이식 했다.

그림 2 는 PET:PU TETG 비 계 제조 공정에 대 한 개요 이다. PET:PU 솔루션 기본 마우스 기도을 1mm의 300 µ m 및 루멘 직경의 최종 TETG 벽 두께 달성 하기 위하여 20 G 무딘 바늘에 electrospun 이었다. TETG의 표면 스캐닝 전자 현미경 이미지 애니메이션 단 세포에서 볼 수 있습니다.

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토론

조직 설계 tracheas에 대 한 마우스 모델의 개발 요인 임상 번역 TETGs;의 제한 된 이해에 필수적 이다 즉 이식 붕괴, 협 착 증 및 지연된 epithelialization4. 이러한 제한에 기여 하는 몇 가지 요인이 이식 재료, 제조 공정, 비 계 디자인 및 프로토콜 시드 셀의 선택을 포함 합니다. 이 모델 빠른 평가 이러한 요인의 영향을 미치는 세포 및 분자 메커니즘을 이해 하기 위해 수 있습니다.

우리는 여기에 표시 된 상피 세포 (그림 4)의 존재 뿐 아니라 이식 협 (그림 5);를 정리 하는 모델의 능력 그러나, 모델의 성공적인 사용은 이식 과정에서 몇 가지 주요 단계에 따라 다릅니다. 첫째, 초기 절 개 및 마우스 기도의 절연을 하는 동안 그것은 부상을 피하기 위해 필수적 또는 tracheoesophageal ...

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공개 사항

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

감사의 글

우리는 그래픽 디자인에서 로버트 Strouse 연구 정보 솔루션 및 그들의 지원에 대 한 전국 어린이 병원 혁신 부서를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품은 NIH (NHLBI K08HL138460)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 염화나트륨 주사APP 제약NDC 63323-186-10
10cc 혈청학적 피펫팔콘357551
18G 1.5in. 니들BD305190
1mL 주사기BD309659
24웰 플레이트Corning3526
25cc 혈청학 피펫Falcon356535
25G 1in. 바늘BD305125
50cc 튜브BD352070
알코올 준비 패드Fisher HealthcareNDC 69250-661-02
Baytril (enrofloxacin) 솔루션Bayer Healthcare, LLCNDC 0859-2267-01
블랙 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사, 9-0AROSurgical Instruments CorporationT05A09N10-13
C57BL / 6,여성 잭슨 실험실6646-8 주 된
구연산염 완충제 pH 6.0 20x 농축액ThermoFisher5000
Colibri 견인기FST 17000-04
코튼 팁 애플리케이터FisherScientific 23-400-118
Cytokeratin 14 단일 클론 항체ThermoFisherMA5-11599
Dumont # 5 집게F.S.T11251-20
Dumont # 5/45 집게F.S.T11251-35
Dumont # 7 - 미세 집게F.S.T11274-20
F4 / 80 쥐 안티 마우스 항체Bio-RadMCA497R
FicollSigma10831-100mL
미세 가위 - 날카로운 무딘F.S.T14028-10
Fisherbrand 프리미엄 커버 안경ThermoFisher12-548-5M
Fluoroshield 마운팅 미디어, DAPIAbcamab104139
염소-안티 마우스 IgG 보조 항체 Alexa Fluor 594ThermoFisherA-11001
염소-안티 토끼 IgG 보조 항체 Alexa Fluor 594ThermoFisherA-11012
염소-안티 쥐 IgG 2차 항체 Alexa Fluor 647ThermoFisherA-21247
IbuprofenPrecision Dose, IncNDC 68094-494-59
요오드 준비 패드Professional disposables international, Inc.NDC 10819-3883-1
케라틴 5 폴리 클로 항체, 정제BioLegend905501
케타민 염산염 주사Hospira Inc.NDC 0409-2053
Micro-Adson 겸자FS11018-12
현미경LeicaM80
부직포 스폰지Covidien441401
안과 연고Dechra 수의학 제품NDC 17033-211-38
PBSGibco10010-023
PET / PU (폴리에틸렌 테레프탈레이트 & 폴리우레탄) 스캐폴드나노섬유 솔루션맞춤형 주문
페트리 디쉬BD353003
RPMI 1640 MediumGibco11875-093
TISH 바늘 홀더/집게MicrinsMI1540
트리머Wahl9854-500
Vannas-Tü bingen 스프링 가위F.S.T15008-08
온수 순환기GaymarTP-700
자일라진 멸균 용액Akorn 동물 건강NDC 59399-110-20

참고문헌

  1. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
  2. Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study. The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
  3. Elliott, M. J., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study. The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
  4. Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).
  5. Clark, E. S., et al. Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).
  6. Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool. American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).
  7. Onwuka, E., et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).
  8. Grimmer, J. F., et al. Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage. Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).
  9. Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. Tracheal reconstruction in a canine model. Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).
  10. Haag, J., et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue. Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).
  11. Best, C. A., et al. Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).

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