Lck:eGFP 제 브라에서에서 Malignant 및 비 Malignant B 세포 분리

요약

유전자 변형 lck:eGFP zebrafish T 림프 톨에 GFP를 높게 표현 하 고 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병을 연구 하는 데 사용 되었습니다. 이 선 낮은 수준에서 lck 표현 연구 B 셀에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 lck:eGFP 제 브라에서 악성 및 비 악성 B 세포의 정화를 설명합니다.

초록

Zebrafish (Danio rerio)는 림프 구 개발을 공부 하는 강력한 모델입니다. 포유류 처럼, D. rerio B와 T 림프 톨을 포함 하는 적합 한 면역 계통을 소유. D. rerio 세포 표면 마커를 인식 하는 항 체는 일반적으로 분리 및 B 계보를 포함 하 여 다른 림프 구 인구의 특성을 복잡 하 게 사용할 수 없습니다 때문에 제 브라 lymphopoiesis의 연구는 어려운 셀입니다. 계보 특정 fluorophore 식 유전자 변형 라인 자주이 문제를 우회 하는 데 사용 됩니다. 유전자 변형 lck:eGFP 라인 D. rerio T 셀 개발, 연구 하는 데 사용 되었습니다 그리고 또한 모델 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병 (T-모든) 활용 되었습니다. Lck:eGFP 물고기 널리 사용 되었습니다 T-계보를 분석, 하지만 그들은 하지 B 세포 연구에 사용 되었습니다. 최근, 우리가 발견 lck을 표현 하는 많은 zebrafish B 셀 낮은 수준에 쓰 신. 따라서, lck:eGFP B 세포는 마찬가지로 GFP의 저급을 표현 한다. 이에 따라, 우리 lck:eGFP zebrafish, 우리가 보고 여기에서 B 계보 세포를 정화 하는 프로토콜을 개발 했다. 우리의 방법은 정화 lck:eGFP 물고기 또는 이중 유전자 변형 rag2:hMYC; 등 관련된 라인에서 B 세포 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)를 활용 하는 방법을 설명 합니다. lck:eGFP 물고기입니다. 에이 라인, B 세포, 특히 미 성숙한 B 세포, 낮은 하지만 감지 수준 급행 GFP 그들 고유 높은 GFP를 표현 하는 T 세포에서 허용. B 세포는 골 수, 흉 선, 비장, 혈액, 또는 다른 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 정화 D. rerio B 세포, B 세포 개발 및 B 림프 구 악성 같은 주제에 초점을 맞춘 연구를 활성화 하는 새로운 방법을 제공 합니다.

서론

Zebrafish는 강력한 특성, 유전자 manipulability, 높은 통치, 광학 반투명, 급속 한 발전 등 유전자 방법을 사용 하 여 공부 척추 개발을 용이 하 게 제공 합니다. Teleost 및 포유류 조의 공유 기능과 함께 이러한 장점을 D. rerio 애벌레 성인 기 동안에 그들의 가장 이른 외관에서 lymphopoiesis 및 림프 구 기능 vivo에서 분석에 적합 확인합니다. Zebrafish에 혈액 개발, 포유류와 공유 하는 잘 보존 유전 프로세스에 의존 하 고 이러한 적응형 면역 체계에 확장. 또한, 림프 개발을 경 세 하는 분자 메커니즘은 너무나 zebrafish 및 포유류¹사이 보존 하 고.

지난 2 년간 유전자 변형 D. rerio 라인 그 레이블 특정 혈액 계보 그리고 돌연변이 라인 결핍이 계보에 생성 된^2,3,,45. 이 lck:eGFP 유전자 변형 라인 중 하나 GFP 식

프로토콜

제 브라와 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 오클라호마 대학 건강 과학 센터에 의해 승인 되었다.

1. 유전자 변형 lck:eGFP 생선 에서 비 악성 B 및 T 림프 구 분리

1. 물고기 물고기 시스템 물에 0.02 %tricaine (MS-222)를 사용 하 여 anesthetize
2. 제 브라와 다른 teleosts¹⁴의 아가미 구멍의 dorsomedial 측면에 있는 형광 thymi에 대 한 2-6 달 오래 된 물고기를 검사 합니다. (470/40 여기 파장과 525/50 방출 필터) GFP를 감지 하는 epifluorescence 현미경을 사용 합니다.
3. 로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) 포함 1% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스 (정렬 미디어) x 필터 살 균 1의 50 mL를 사전에 준비 합니다. 사용 하지 않는 정렬 미디어 4 ° C에서 최대 2 개월까지 저장할 수 있습니다.
4. 0.2% 들어 있는 비 커에 그것을 배치 하 여 물고기를 안락사 약 5 분, Tricaine 뒤에 얼음 목욕 침수. Opercular (길) 움직임의 정....

결과

우리 사용 분석 cytometry FACS GFP^소호 및 GFP^{안녕하세요} 세포 thymus, 신장 골 수, 및 lck:eGFP 유전자 변형 zebrafish의 비장 으로부터 분리. 3 개월 된 물고기의 분석 thymus 포함 GFP⁺ 세포 주로 밝혔다. GFP⁺ 세포 림프 게이트 이전 Traver 외.¹⁷에 의해 설명에 주로 국한 되었다. 두 가지 GFP⁺ 인구, GFP^lo와 GFP^{안녕하세요}, thymus에서 관찰할 수^있습니다 . GFP^{안녕하세요} 세포 GFP로 셀은 덜 풍부 하 고, 총 thymic 세포 (표 1)의 40% ~ 60%, 더 높은 백분율 표현. 달리 포유류, 물고기 조 혈 골.......

토론

우리가 개발 하 고이 B 계보 레이블^3,4다른 D. rerio 모델에 추가 하는 것은 lck:eGFP 유전자 변형 zebrafish에서 B 세포 격리 프로토콜을 제공. 약간 의외로, GFP^로 B 셀이이 라인의 식별이 갔다 2004 년에 그것의 설명부터 주목. 일반적으로, lck 는 T 세포 관련⁶, 간주 됩니다 하지만 최근 연구 발견 예기치 않은 lck 식 자연 킬러에 의해 및 골수성 세포, 또한 같이^18,19B 세포에서. 우리의 발견 zebrafish B 세포 GFP^lo, 사전-B, 순진한, 그리고 성숙 B와 인간에서 세포 또한 LCK

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35 &마이크로; m mesh	Sefar Filter technology	7050-1220-000-13
5 mL 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브(셀 스트레이너 캡 포함	Falcon Corning 브랜드	352235
50 mL 원추형 튜브	VWR international	525-0448
AZ APO 100 형광 현미경	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	니콘
에틸 3- 아미노 벤조 에이트 메탄 세설포 네이트; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
태아 소 혈청	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
em>lck:eGFP			Langeneu et al., 2004
NIS Elements software	Nikon	버전 4.13
Penicilin-Streptomycin	Sigma	P4333
Petsle 마이크로 튜브 균질화 장치	전자 현미경 과학	64788-20
플라스틱 전송 pippetes
rag2:hMYC-ER			참조 Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030

) <참조