Enteroids 인간 질병의 연구에 새로운 모델로 떠오르고 있다. 프로토콜 신생아 조직에서 생성 된 enteroids의 lipopolysaccharide (LPS) 치료를 사용 하 여 인간의 necrotizing enterocolitis에의 enteroid 모델을 시뮬레이션 하는 방법을 설명 합니다. 수집 된 enteroids 그 인간의 necrotizing enterocolitis에 본 유사 염증 성 변화를 보여 줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
Necrotizing enterocolitis (NEC) 신생아 유아의 치명적인 질병입니다. 그것은, 손상 회복, 그리고 세포 죽음 증가 증가 창 자 침투성으로 이어지는 인간 장 상피에 여러 pathophysiologic 변경 특징. NEC의 수많은 동물 모델을 확인 하 고는, 부상 및 치료 내정간섭에 응답 종 사이 매우 다양 수 있습니다. 또한, 그것은 질병 이상 또는 인체, 특히 아이 들에서 직접 새로운 치료제 연구를 윤리적으로 도전입니다. 따라서, 그것은 매우 바람직한 인간 직물을 사용 하 여 NEC의 새로운 모델을 개발입니다. Enteroids는 3 차원 organoids 장 상피 세포에서 파생 된. 그들은 복잡 한 생리 적인 상호 작용, 세포 신호, 및 호스트 병원 체 방어의 연구에 이상적입니다. 이 원고에 우리 기술 프로토콜 그 문화 인간 enteroids 창 자 절제술 환자에서 장 줄기 세포를 분리 한 후. 토 굴 세포 감 별 법 인간 장 상피의 다양 한 셀 형식 기본으로 격려 하는 성장 인자를 포함 하는 미디어에 교양. 이 세포는 여분의 세포 지하실 막을 흉내 낸를 발판으로 봉사 하는 단백질의 합성, collagenous 믹스에서 성장 된다. 그 결과, enteroids 개발 꼭대기 basolateral 극성. 미디어에서 lipopolysaccharide (LPS)의 공동 관리 enteroids, 조직학, 유전, 선도 및 단백질 식 변경 그 인간의 선관위에서 본 비슷한 염증 반응을 발생 합니다. 우리가이 질병을 위한 치료를 식별 하기 위해 노력 하 고 인간의 조직을 사용 하 여 NEC의 실험 모델 약물 및 치료 인체 실험, 사전 테스트에 대 한 더 정확한 플랫폼을 제공할 수 있습니다.
서론
인간 enteroids 있다 전 비보 3 차원 문화 시스템 인간의 창 자 조직 샘플의 장 지하실에서 분리 된 줄기 세포에서 생성 된. 이 획기적인 모델 2007 마우스1소장의 지하실에서 Lgr5 + 줄기 세포의 발견 다음에 Hans Clevers 연구진이 개척 했다. 그들의 작품 전을 설정 하기 위한 토대를 마련 여러 종류의 세포는 상당한 유전적 또는 생리 변화2없이 passaged 수 비보 장 상피 문화. 이 발견 이후 enteroids 정상 소화 생리학, 선 동적인 장 질병, 호스트 병원 체 상호 작용, 재생 의학2등 장 질환의 병 태 생리학을 공부 하 고 새로운 모델으로 사용 되었습니다.
사용 전으로 enteroids의 vivo 모델 장 이상의 연구에 대 한 대체 기술을 통해 몇 가지 장점을. 지난 몇 십년에 대 한 동물 모델과 불멸 하 게 장 암 파생 셀 라인 장 생리학3,,45연구 사용 되었습니다. 단일 세포 배양 세포 유형 정상적인 창 자 ....
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프로토콜
기관 심사 위원회 승인 (IRB #2013-15152) 얻은 앤 로버트 H. Lurie 어린이 병원의 시카고, 시카고, 일리노이에서 창 자 절제술 환자에서 조직 샘플의 컬렉션에 대 한. 모든 프로토콜은 기관 및 국가 지침 및 인간의 복지에 대 한 규정에 따라 수행 했다. 부모의 동의서 정보 요구 되었고 모든 경우에서 샘플 수집 전에 얻은.
1. 시 약 준비
- 문화 미디어 재고 솔루션 전체 조직 컬렉션에 대 한 준비: 1 L의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM), 110 mL의 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린-스 (최종 농도 1%)의 11 mL 1.1 ml 필터 소독 인슐린 (최종 농도 0.1%.) 4 ° c.에 게 재고 솔루션
- 킬레이트 버퍼 #1 준비: 문화 미디어 (1.1에서와 같이), 30 mL 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 600 µ L (최종 농도 10 m m), 300 µ L Gentamicin (최종 농도 1%)의 고 암포 B (최종 농도 0.2%)의 60 µ L. 4 ° c.에 게 재고 솔루션
- 킬레이트 버퍼 #2 준비: 문화 미디어 (1.1에서와 같이), 30 mL Gentamicin (최종 농도 1%)의 0.5....
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결과
도금, 직후 갓 격리 장 지하실 길쭉한 봉으로 표시 됩니다. 시간 내는 enteroid (그림 1a) 둥근 모양에 걸릴 것입니다. 앞으로 몇 일 동안에 enteroids 그림 1b에서 보듯이 구체를 형성 시작 합니다. 신진그림 1(c) 5-10 일 사이 발생 해야 하 고 enteroid 컬렉션은 그 시간에 발생 한다.
성장 enteroids 또한 중앙된 루멘, 꼭대기 국경과 basolateral 도메인 (그림 2)를 포함 하는 극성을 전시할 것 이다. Entero.......
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토론
Ex vivo 인간 창 자 enteroid 모델이이 소설 장 장벽 부전 necrotizing enterocolitis (NEC)에서 연구에 대 한 유용한 방법으로 제공 합니다. 여기에 제시 된 enteroid 처리 방법 박사 안개 좋은, 마이클 Helmrath와 제이슨 베르트 하 임10,,1112의 이전 직장에서 적응 했다.
세부 사항 전체를 둘러싼 조직 수집 및 토 굴 격리의 타이밍은이 프로토콜에서 중요 한 단계. 조직 요원 절제 시 즉시 수집 하 고 조직 연구실에 도착 하자마자 토 굴 격리에 대 한 처리 해야 합니다. 우리는이 모델에 대 한 보다 3 개월 환자에서 조직 선택. 지연된 처리 24 시간 이내 전체 조직 컬렉션 후 필요한 경우 발생할 수 있습니다. 또한, 인간의 조직 샘플의 품질에는 크립 트 격리의 .......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 당뇨병과 소화와 신장 질환 그랜트 (K08DK106450) C.J.H.에 미국 소아 외과 협회에서 제이 Grosfeld 상 건강 연구소의 국립 연구소에 의해 지원 되었다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4% 파라포름알데히드 | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R& D Tocris | 2939/10 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher 15290026 | ||
| B-27 보충제 마이너스 비타민 A | ThermoFisher | 17504-044 | |
| 기저막 매트릭스 (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
| 표피 성장 인자(EGF) | 시그마 | E9644-.2MG | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) | 시그마 | EDS-500G | |
| 소 태아 혈청(FBS) | 제미니 바이오 프로 | 100-125 | |
| 겐타마이신 | 시그마 | G5013-1G | |
| 글루타맥스( L-글루타민) | ThermoFisher | 35050-061 | |
| 인슐린 | 시그마 | I9278-5mL | |
| [leu] 15-가스트린 1 | 시그마 | G9145-.1MG | |
| 리포다당류(LPS) | 시그마 | L2630-25MG | |
| N-2 보충제 | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄 술폰산(HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-아세틸시스테인 | 시그마 | A9165-5G | |
| 니코틴아미드 | 시그마 | N0636-100G | |
| Noggin | R& D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | ThermoFisher | 15140-148 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 매체 | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| 조직 처리 젤 (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R& D 시스템 INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | 시그마 | Y0503-1MG |
참고문헌
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. ....
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재인쇄 및 허가
