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방법 논문

Necrotizing Enterocolitis의 소설 인간 상피 Enteroid 모델

7.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59194

⸱

2019년 4월 10일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Northwestern University, 2Division of Pediatric Surgery, Ann & Robert H. Lurie Children's Hospital of Chicago

이 논문에서

요약

Enteroids 인간 질병의 연구에 새로운 모델로 떠오르고 있다. 프로토콜 신생아 조직에서 생성 된 enteroids의 lipopolysaccharide (LPS) 치료를 사용 하 여 인간의 necrotizing enterocolitis에의 enteroid 모델을 시뮬레이션 하는 방법을 설명 합니다. 수집 된 enteroids 그 인간의 necrotizing enterocolitis에 본 유사 염증 성 변화를 보여 줍니다.

초록

Necrotizing enterocolitis (NEC) 신생아 유아의 치명적인 질병입니다. 그것은, 손상 회복, 그리고 세포 죽음 증가 증가 창 자 침투성으로 이어지는 인간 장 상피에 여러 pathophysiologic 변경 특징. NEC의 수많은 동물 모델을 확인 하 고는, 부상 및 치료 내정간섭에 응답 종 사이 매우 다양 수 있습니다. 또한, 그것은 질병 이상 또는 인체, 특히 아이 들에서 직접 새로운 치료제 연구를 윤리적으로 도전입니다. 따라서, 그것은 매우 바람직한 인간 직물을 사용 하 여 NEC의 새로운 모델을 개발입니다. Enteroids는 3 차원 organoids 장 상피 세포에서 파생 된. 그들은 복잡 한 생리 적인 상호 작용, 세포 신호, 및 호스트 병원 체 방어의 연구에 이상적입니다. 이 원고에 우리 기술 프로토콜 그 문화 인간 enteroids 창 자 절제술 환자에서 장 줄기 세포를 분리 한 후. 토 굴 세포 감 별 법 인간 장 상피의 다양 한 셀 형식 기본으로 격려 하는 성장 인자를 포함 하는 미디어에 교양. 이 세포는 여분의 세포 지하실 막을 흉내 낸를 발판으로 봉사 하는 단백질의 합성, collagenous 믹스에서 성장 된다. 그 결과, enteroids 개발 꼭대기 basolateral 극성. 미디어에서 lipopolysaccharide (LPS)의 공동 관리 enteroids, 조직학, 유전, 선도 및 단백질 식 변경 그 인간의 선관위에서 본 비슷한 염증 반응을 발생 합니다. 우리가이 질병을 위한 치료를 식별 하기 위해 노력 하 고 인간의 조직을 사용 하 여 NEC의 실험 모델 약물 및 치료 인체 실험, 사전 테스트에 대 한 더 정확한 플랫폼을 제공할 수 있습니다.

서론

인간 enteroids 있다 전 비보 3 차원 문화 시스템 인간의 창 자 조직 샘플의 장 지하실에서 분리 된 줄기 세포에서 생성 된. 이 획기적인 모델 2007 마우스1소장의 지하실에서 Lgr5 + 줄기 세포의 발견 다음에 Hans Clevers 연구진이 개척 했다. 그들의 작품 전을 설정 하기 위한 토대를 마련 여러 종류의 세포는 상당한 유전적 또는 생리 변화2없이 passaged 수 비보 장 상피 문화. 이 발견 이후 enteroids 정상 소화 생리학, 선 동적인 장 질병, 호스트 병원 체 상호 작용, 재생 의학2등 장 질환의 병 태 생리학을 공부 하 고 새로운 모델으로 사용 되었습니다.

사용 전으로 enteroids의 vivo 모델 장 이상의 연구에 대 한 대체 기술을 통해 몇 가지 장점을. 지난 몇 십년에 대 한 동물 모델과 불멸 하 게 장 암 파생 셀 라인 장 생리학3,,45연구 사용 되었습니다. 단일 세포 배양 세포 유형 정상적인 창 자 상피에 존재 함으로써 셀을 크로스 토크와 세그먼트-특이성 단백질 표정, 신호, 및 병원 체 유발 질병6부족의 다양성을 대표 하지 않는다. Enteroids에 있는 줄기 세포 상피 세포 유형 enterocytes, Paneth 세포, 잔 세포, enteroendocrine 세포와 더 많은3주요로 구분합니다. 그들은 극성을 전시, 상피 전송 기능을 수행 하 고 장 세그먼트 특이성6허용 합니다. Enteroids 인간 장 상피의 여러 세포 유형 정리 수 있습니다, 이후 그들은 암 세포 기반 시스템의 인정된이 제한을 극복 하기 위해 수 있습니다. 시간이 지남에, 셀 라인의 파생 상품 subcloned는 고 단백질 식 및 지역화3에 큰 다양성을 전시 진화. 그와 반대로, 상당한 유전적 또는 생리 변화2없이 enteroids는 passaged 수 있습니다. 선관위에 대 한 수많은 동물 모델 존재, 부상 및 치료 내정간섭에 응답 종 사이 높게 가변 될 수 있습니다. 이러한 제한으로 인해 치료 동물 모델에서 파생 된 시간의 90% 실패 때문에 독성 또는 효능3인간의 재판에서 테스트 했을 때. Enteroids 복잡 한 장 이상과 따라서 더의 더 나은 이해로 이어지는 이러한 결함을 극복할 수 있는 유망한 전 임상 모델 역할 성공적이 고 비용 효율적인 치료 혁신. 또한 최근 증거는 enteroid에서 생성 되는 조직의 나이 생물학으로 중요 한7남아 있다. Enteroids 신생아 조직, NEC와 환자에 게 생리 관련성 유지에서 생성 되므로 이것은 우리의 모델에 대 한 특히 중요 한 정보 이다.

인간 질병의 모델로 enteroids의 유틸리티 확장, 심한와 보급 조건 치료를 찾는 희망 하 고 있습니다. Necrotizing enterocolitis (NEC) 신생아 장 괴 사 특징의 엄청난 장 질환 이며 자주 죽음8, 패 혈 증, 창 자 벽의 구멍 뚫 기를 리드. 때문에 선관위의 복잡 하 고 multifactorial 이상, 질병의 정확한 메커니즘 하지 아직 되었습니다 완전히 해명 했습니다; 그러나, 증가 창 자 침투성은 질병 과정8에서 명확 하 게 연루 되었습니다. 주어진 NEC와 잠재적인 치료제의 연구는 윤리적으로 인체, 특히 어린이에 도전, 매우 인간의 신생아 티슈를 사용 하 여 NEC의 생물학 관련 enteroid 모델을 활용 하는 것이 좋습니다. 지금까지, enteroids NEC의 연구에서 제한 된 역할을 있다. 이 프로토콜 enteroids enterocolitis necrotizing의 연구에 대 한 vivo 모델 전 소설으로 인간의 창 자 조직 샘플에서 파생 된의 사용을 설명 합니다.

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프로토콜

기관 심사 위원회 승인 (IRB #2013-15152) 얻은 앤 로버트 H. Lurie 어린이 병원의 시카고, 시카고, 일리노이에서 창 자 절제술 환자에서 조직 샘플의 컬렉션에 대 한. 모든 프로토콜은 기관 및 국가 지침 및 인간의 복지에 대 한 규정에 따라 수행 했다. 부모의 동의서 정보 요구 되었고 모든 경우에서 샘플 수집 전에 얻은.

1. 시 약 준비

  1. 문화 미디어 재고 솔루션 전체 조직 컬렉션에 대 한 준비: 1 L의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM), 110 mL의 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린-스 (최종 농도 1%)의 11 mL 1.1 ml 필터 소독 인슐린 (최종 농도 0.1%.) 4 ° c.에 게 재고 솔루션
  2. 킬레이트 버퍼 #1 준비: 문화 미디어 (1.1에서와 같이), 30 mL 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 600 µ L (최종 농도 10 m m), 300 µ L Gentamicin (최종 농도 1%)의 고 암포 B (최종 농도 0.2%)의 60 µ L. 4 ° c.에 게 재고 솔루션
  3. 킬레이트 버퍼 #2 준비: 문화 미디어 (1.1에서와 같이), 30 mL Gentamicin (최종 농도 1%)의 0.5 M EDTA (최종 농도 5 m m), 300 µ L의 300 µ L 고 암포 B (최종 농도 0.2%)의 60 µ L. 4 ° c.에 게 재고 솔루션
  4. 인간의 Minigut 미디어 준비: 41.4 mL DMEM/F-12, FBS (최종 10%), 500 µ L의 페니실린-스 (최종 농도 1%), L-글루타민 (최종 농도 1%), Gentamicin (최종 농도 1%), 암포 b (최종 100 µ L의 500 µ L의 500 µ L의 5 mL 농도 0.2%), 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane 술 폰 산 (HEPES)의 500 µ L (최종 농도 10 m m), 100 x 500 µ L N-2 보충, 및 50 x의 1 mL 50 mL의 전체 볼륨에 대 한 비타민 A 마이너스 B-27 보충. -20 ° c.에 게 재고 솔루션
  5. 인간의 Minigut 미디어 완료 준비: 10 mL의 인간 Minigut 미디어 (준비에서 1.4), 10 µ L 100 µ g/mL Wnt3a의 (최종 농도가 100 ng/mL), 100 µ g/mL 머리 (최종 농도가 100 ng/mL), 1 mg/mL R Spondin의 10 µ L의 10 µ L (최종 농도 1 µ g/mL) 500 µ g/mL 표 피 성장 인자 (EGF) (최종 농도 50 ng/mL), 1의 10 µ L의 10 µ L M N-진 (최종 농도 1 m m) 10, 500 µ M의 10 m m Y-27632 (최종 농도 10 μ M), 10 µ L의 µ L A-83 (최종 농도 500 nM), 10 mM SB202190 (마지막의 10 µ L 농도 10 μ M), 1 M 니코틴의 100 µ L (최종 농도 10 m m)와 1 µ L 100 µ M [레이] 15 gastrin 1 (최종 농도 10 nM)의. 전체 용량 10 mL. 4 ° c.에 게 재고 솔루션
    참고: 솔루션 내에서 48 h 사용 해야 합니다.

2. 토 굴 격리 및 전체 조직에서 도금

  1. 요원에 있는 컬렉션의 시간에 인간의 작은 창 자 조직 샘플에서 찬 Dulbecco 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS) 놓습니다. 대변과 혈액의 클리어까지 차가운 DPBS에 표본을 씻어. 토 굴 격리에 대 한 준비까지 4 ° C에서 견본 RPMI 1640 매체에 저장 합니다.
    참고: 조직 24 시간 이상 저장할 수 없습니다.
    1. 표본은 분명 대변과 혈액의 다는 것을 확인 하십시오. 섬세 한 해가 위를 사용 하 여 모든 초과 지방 또는 수술 클립/스테이플 등 제거. 무게는 견본.
      참고: 조각 약 0.75-2.5 g에 대 한 목표.
  2. 표본 0.5 cm 조각으로 잘라 하 고 킬레이트 화 버퍼 # 1의 30 mL에 장소 (로 단계 1.2 준비).
    1. 4 ° c.에 15 분 동안 낮은 속도 흔들
    2. 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 조직 필터 및 흐름을 통해 삭제.
  3. (1.3 단계에서 준비)로 조직 킬레이트 화 버퍼 # 2의 30 mL를 추가 합니다.
    1. 4 ° c.에 15 분 동안 낮은 속도 흔들
    2. 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 조직 필터 및 흐름을 통해 삭제.
  4. 2.8 단계에서 사용 하기 위해 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스의 500 mL 녹여
  5. 10 mL 50 mL 원뿔 튜브에 차가운 DMEM의 조직을 추가 하 고 10 대 손으로 적극적으로 악수 s.
    1. 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터 및 수집 (레이블 #1)를 통해 흐름. 튜브 얼음에 # 1를 유지.
    2. 별도 50 mL 원뿔 튜브에 차가운 DMEM의 또 다른 10 mL에 조직을 추가 하 고 10 대 손으로 적극적으로 악수 s.
    3. 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터 및 수집 (레이블 #2)를 통해 흐름.
    4. 두 개의 추가 시간 흐름 (레이블이 튜브 #1-4)를 통해 4 개의 원뿔 관까지를 반복 합니다.
  6. 필터 튜브 100 µ m 셀 스 트레이너 및 전송 흐름을 통해 15 mL 원뿔 튜브 (레이블 #1)으로 통해 #1 솔루션. #2-4를 반복 합니다.
    1. 원심 분리기 15 mL 튜브 #1-4 200 x g 에서 4 ° c.에서 15 분
  7. 층 류 두건에 튜브 #1-4에서에서는 상쾌한을 제거 하 고 삭제 합니다. 경우에 일부 상쾌한 남겨두고 조직 바로 위에 펠 릿의 구름을 방해 하지 마십시오.
    1. 천천히 pipetting으로 남은 튜브 #1-4에서에서 표면에 뜨는와 펠 릿을 함께 섞는다.
    2. 하나의 단일 2 mL 원뿔 튜브로 튜브 #1-4에서에서 혼합물을 전송.
    3. 4 ° c.에 20 분 200 x g 에서 원뿔 튜브 원심
  8. 상쾌한을 제거 하 고 다시 지하실 멤브레인 매트릭스의 500 µ L에 펠 릿을 중단.
    참고:     모든 시간에 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스를 유지 하 고 신속 하 게 다음 단계에 대 한 작업. 이 제품은 실 온에서 매우 신속 하 게 polymerizes.
    1. 24-잘 접시에 잘의 센터에 견본/지하실 막 매트릭스 서 스 펜 션의 50 µ L를 적용 됩니다. 이 돔 모양으로 나타납니다.
      참고: 냉장된 피 펫 팁의 사용 최소화 합 정지, 매끄러운 전송에 에이즈.
    2. 10 총 우물을 채우기 위해 9 번을 반복 합니다.
  9. 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터 중 합 수 있도록 30 분에 24-잘 접시를 놓습니다.
  10. 각 우물에 인간 Minigut 미디어 완벽 한 (준비 단계 1.5에서에서)의 500 µ L를 추가 합니다. 2 일 마다 교체 합니다.
  11. 5-10 일 후, 신진 시각 때 enteroids를 수집 합니다. 단계 4 및 5 컬렉션 지침에 대 한 참조.

3입니다. 실험 NEC의 유도

  1. 0에 인간 Minigut 미디어 완벽 한 (단계 1.5에서에서 준비)에 각 잘의 500 µ L를 lipopolysaccharide (LPS)의 5 mg/mL의 10 µ L를 추가 합니다. 컬렉션까지 2 일 마다 교체 합니다.

4입니다. 파라핀 포함을 위한 준비

  1. 부드럽게 미디어를 제거 합니다.
    1. PBS의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 아래로 주의 enteroids를 lyse 않기로 지하실 멤브레인 매트릭스를 해산 하기 위해 플라스틱.
    2. PBS/enteroid 혼합물을 원심 < 작은 PBS를 제거 하 5 분에 대 한 300 x g .
  2. 4% paraformaldehyde 1 시간 실 온에서 해결 하기 위해 추가 합니다.
  3. 원심에서 < 300 x g 5 분 작은, 그리고 PBS를 제거 합니다.
    1. 부드럽게 1 mL의 PBS로 세척 하 고 원심에서 < 300 x g 5 분 작은, 그리고 PBS를 제거 합니다.
    2. 4.3.1 단계를 반복 합니다.
  4. 충분 한 양의 젤 (약 300 µ L) 원뿔 튜브에 원하는 금액을 배치 하 고 액체까지 3-10 분 동안 65 ° C에서 드라이 목욕 인큐베이터에서 온난 하 여 처리 하는 조직에 녹 인 다.
    1. 펠 릿을 젤 처리 조직을 추가 하 고 부드럽게 혼합.
    2. coverslip에서 작은 복제 반지를 놓습니다.
    3. 복제 반지는 coverslip에 장착으로 젤과 enteroid 혼합 처리 조직 플라스틱
  5. 젤, enteroid 혼합물 1 h 4 ° C에서 고형화 처리 하는 조직을 수 있습니다.
    1. 파라핀을 포함 하기 위한 준비에 70% 에탄올으로 응고 혼합 복제 반지를 잠수함.

5. Enteroid 컬렉션 RNA 및 단백질 추출에 대 한

  1. 부드럽게 각 우물에서 인간 Minigut 미디어 완전 제거 합니다.
  2. 1 mL PBS를 추가 하 고 부드럽게 아래로 지하실 멤브레인 매트릭스를 해산 하기 위해 플라스틱. 수는 enteroids을 분리 하지 않도록 주의 하십시오.
    1. 살 균 2 mL 원뿔 관으로 PBS/enteroid 혼합물을 놓습니다.
    2. 원심에서 < 작은 5 분 300 x g .
    3. 부드럽게 PBS는 enteroids를 제거 하지 않도록 주의 복용 제거 합니다.
  3. 단계 시리즈 5.2 두 번 더 반복 합니다.
  4. 단백질 또는 RNA 추출에 대 한 준비까지-80 ° C에 고정 합니다.
  5. 잘 설립 qRT-PCR 및 서양 Blotting 기술을 사용 하 여 enteroids의 유전자 표현과 단백질 격리를 수행 합니다.

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결과

도금, 직후 갓 격리 장 지하실 길쭉한 봉으로 표시 됩니다. 시간 내는 enteroid (그림 1a) 둥근 모양에 걸릴 것입니다. 앞으로 몇 일 동안에 enteroids 그림 1b에서 보듯이 구체를 형성 시작 합니다. 신진그림 1(c) 5-10 일 사이 발생 해야 하 고 enteroid 컬렉션은 그 시간에 발생 한다.

성장 enteroids 또한 중앙된 루멘, 꼭대기 국경과 basolateral 도메인 (그림 2)를 포함 하는 극성을 전시할 것 이다. Entero...

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토론

Ex vivo 인간 창 자 enteroid 모델이이 소설 장 장벽 부전 necrotizing enterocolitis (NEC)에서 연구에 대 한 유용한 방법으로 제공 합니다. 여기에 제시 된 enteroid 처리 방법 박사 안개 좋은, 마이클 Helmrath와 제이슨 베르트 하 임10,,1112의 이전 직장에서 적응 했다.

세부 사항 전체를 둘러싼 조직 수집 및 토 굴 격리의 타이밍은이 프로토콜에서 중요 한 단계. 조직 요원 절제 시 즉시 수집 하 고 조직 연구실에 도착 하자마자 토 굴 격리에 대 한 처리 해야 합니다. 우리는이 모델에 대 한 보다 3 개월 환자에서 조직 선택. 지연된 처리 24 시간 이내 전체 조직 컬렉션 후 필요한 경우 발생할 수 있습니다. 또한, 인간의 조직 샘플의 품질에는 크립 트 격리의 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 당뇨병과 소화와 신장 질환 그랜트 (K08DK106450) C.J.H.에 미국 소아 외과 협회에서 제이 Grosfeld 상 건강 연구소의 국립 연구소에 의해 지원 되었다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4% 파라포름알데히드ThermoFisherAAJ19943K2
A-83R& D Tocris2939/10
Amphotericin BThermoFisher 15290026
B-27 보충제 마이너스 비타민 AThermoFisher17504-044
기저막 매트릭스 (Matrigel)CorningCB-40230C
DMEM/F-12ThermoFisherMT-16-405-CV
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher11-965-118
Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS)ThermoFisher14190-144
표피 성장 인자(EGF)시그마E9644-.2MG
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)시그마EDS-500G
소 태아 혈청(FBS)제미니 바이오 프로100-125
겐타마이신시그마G5013-1G
글루타맥스( L-글루타민)ThermoFisher35050-061
인슐린시그마I9278-5mL
[leu] 15-가스트린 1시그마G9145-.1MG
리포다당류(LPS)시그마L2630-25MG
N-2 보충제ThermoFisher17502-048
N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄 술폰산(HEPES)ThermoFisher15630-080
N-아세틸시스테인시그마A9165-5G
니코틴아미드시그마N0636-100G
NogginR& D Systems INC6057-NG/CF
페니실린-스트렙토마이신ThermoFisher15140-148
인산염 완충 식염수(PBS)SigmaP5368-5X10PAK
RPMI 1640 매체Invitrogen11875093
R-SpondinPEPROTECH INC120-38
SB202190SigmaS7067-5MG
조직 처리 젤 (Histogel)ThermoFisher22-110-678
Wnt3aR& D 시스템 INC5036-WN-010
Y-27632시그마Y0503-1MG

참고문헌

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  13. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  14. Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).
  15. Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).
  16. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).

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