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방법 논문

종양 면역 프로 파일링에 대 한 쥐 및 치료 반응 평가에 편평 세포 암 종 세포의 intramucosal 접종

11.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59195

⸱

2019년 4월 22일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 2Department of Anesthesiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 3Division of Radiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus

이 논문에서

요약

여기 우리는 머리와 목 편평 상피 세포 암의 orthotopic murine 모델 개발에 대 한 재현 방법 제시. 종양 괴 사, 불 쌍 한 차별화, 꾸벅꾸벅 졸 기 전이 및 면역 침투를 포함 하 여 질병의 임상 관련 histopathological 기능을 보여 줍니다. 부전 실어증, 턱 변위, 및 체중 감소를 포함 한 임상 관련 증상을 개발 하는 종양 방위 쥐.

초록

머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)은 치료 실패와 재발의 높은 보급으로 쇠 약하게 하 고 치명적인 질병 이다. 더 나은 치료 전략을 개발 하기 위하여 종양 microenvironmental 요소 이해 치료 저항에 기여 하는 중요 하다. 질병 메커니즘을 이해 하 고 치료를 개선 하는 주요 장애물이 인간 HNSCCs의 공격적이 고 전이성 자연 닮은 murine 셀 라인의 부족 했습니다. 또한, murine 모델의 대다수 종양 머리와 목 지역, 높은 혈관 밀도, 광범위 한 림프 맥 관 구조, 상주 점 막 식물 등의 중요 한 생리 기능을 부족의 피하 implantations를 사용 합니다. 이 연구의 목적은 개발 하 고 HNSCC의 orthotopic 모델의 특성입니다. 우리는 두 유전자 별개 murine 셀 라인 및 설립된 종양 생쥐의 뺨 점 막에 사용합니다. 우리는 콜라 기반 종양 소화 방법이 설립된 종양에서 단일 세포의 최적의 복구를 최적화합니다. 여기에 제시 된 데이터 표시 마우스 지역 림프절에 전이 매우 vascularized 종양 개발. 단일 셀 multiparametric 대량 cytometry 분석 모든 면역 세포의 대다수를 대표 하는 골수성 세포와 다양 한 면역 인구의 존재를 보여줍니다. 이 연구에서 제안 된 모델이 있다 암 생물학, 종양 면역학, 및 새로운 치료제의 전 임상 개발에 응용 프로그램. 인간 질병의 임상 특징 orthotopic 모델의 닮은 향상 된 번역 및 향상 된 환자 결과 대 한 도구를 제공 합니다.

서론

HNSCC 다섯 번째 가장 일반적인 종은 세계적으로, 매년 진단 이상 600000 환자와1. 적극적인 화학 요법과 방사선 (RT) 치료, 치료에도 불구 하 고 인간 유 두 종 바이러스 (HPV) 감염 없이 HNSCC 환자에 대 한 전반적인 생존 (OS) 율25 년 후 50% 미만 남아 있다. 이것은 크게에 기인 매우 복잡 한 종양 microenvironment 종양 볼 점 막, 혀, 구강, 비 강, 구강, 인 두의 바닥을 포함 한 머리와 목 지역 내의 여러 가지 해 부 사이트에서 발생 한 수로 oropharynx, 그리고 hypopharynx입니다. 또한, 머리와 목 지역 높은 나가도록 하 고 몸3에 모든 림프절의 거의 절반을 포함. 머리와 목 종양 생물학 조사 연구의 대다수는 측면 지역에서 종양 모델에 의존 합니다. 이러한 모델 종양 내장 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다 하지만 기본 머리와 목 microenvironment의 부족 같은 결과의 변환 가능성 영향 크게 수 있습니다. 구강 종양을 유발 하는 데 사용 되었습니다 하나의 방법은 발암 물질 9, 10-디 메 틸-1, 2-benzanthracene (DMBA)4에 노출을 통해 이다. 그러나,이 메서드는 연결 된 마우스에만 쥐 및 햄스터 종양을 유도 하는 과정, 그리고 결과 종양의 차별화 된 Scc5,6조직학 특징의 많은가지고 있지 않습니다. Carcinogen4-nitroquinoline 1-산화물 (4-NQO), 수용 성 quinolone 파생, 마우스 구강 종양 구두로 적용 하는 경우에 발생 하지만 또한 긴 노출 시간 (16 주)와 제한 된에서 고통 소개 걸릴 시간과 일괄 처리 사이 속도 쥐7,,89. 임상 관련 모델을 개발 하기 위해서는 여러 그룹 드라이버 oncogenes 또는 종양 억제기 유전자, TP53, TGFB, KRA, HRA, 및 SMAD410등의 조작에 관련 된 유전자 조작된 모델을 활용 합니다. 이러한 모델 알려진된 드라이버 유전자와 종양에 대 한 통찰력을 제공할 수 있지만 인간 HNSCCs의 복잡 한이 정리 하지 않습니다.

이 작품에서 편평 세포 암 종 세포의 intramucosal 접종 생쥐에서 수행의 타당성을 설명 합니다. 접종된 세포 주입의 1 주 안에 공격적인 종양으로 발전. 인간의 HNSCCs와 마찬가지로 종양 지역 림프절에 전이. 우리는 질병의 조직학 및 임상 기능을 특성화 하 고 종양 면역 microenvironment에 대 한 통찰력을 제공. 우리는 HNSCC의이 orthotopic 모델 암 생물학, 종양 면역학, 및 전 임상 연구에 응용 프로그램을 제안 합니다. 면역 회피, 종양 진행, 치료 저항, 및 전이 메커니즘 제안 된 모델을 사용 하 여 해결 될 수 있는 임상 의미의 영역을 나타냅니다.

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프로토콜

모든 동물 절차는 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 프로토콜 대학의 콜로라도 덴버 (프로토콜 # 00250)에 따라 수행 했다.

1. 종양 세포 배양

참고: B4B8 및 LY2 셀 라인 orthotopic HNSCC 종양을 생성 하는 데 사용 했다: B4B8 종양 세포 (BALB/C 마우스)에서 발암 물질 변형 막 keratinocytes11에서 파생 되었다. LY2 종양 세포는 저절로 변형된 BALB/C keratinocyte 선 (Pam 212)12,13의 림프절 전이에서 파생 되었다. 두 셀 라인 친절 하 게 박사 Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, 휴스턴, 텍사스, 미국)에 의해 제공 되었다.

  1. Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) F/12 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 항균 시 셀 라인 유지 보수에 대 한 보완을 사용 합니다. 37 ° C, 5% CO2무 균 인큐베이터에서 이러한 셀 라인을 유지 합니다. 셀 15 구절을 초과 하기 전에 접종을 위해 사용 되어야 한다.
  2. 플레이트 4 x 106 셀 175 cm2 셀 문화 플라스 크에 2 x 106 .
    참고: 확인 셀 90% 미만 스트레스 응답을 유도 하지 않으려면 합칠.
  3. 셀 (~ 48 h) 70% 합칠 때, 인큐베이터에서 플라스 크를 제거 하 고 세척 셀 3 찬 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 x.
  4. 0.25 %trypsin, 충분히 사용 하 여 판의 표면을 커버 플라스 크에서 세포를 분리 합니다.
    1. 이렇게 하려면 70 %confluent 셀을 포함 하는 175 cm2 플라스 크에서 trypsin의 4 mL를 분배 합니다. 37 ° C, 5% CO2셀 문화 인큐베이터에서 3-4 분 trypsin 셀을 품 어.
    2. 세포 분리를 보장 하기 위해 현미경으로 세포를 시각화 합니다.
    3. 트립 신 활동을 무력화 하는 FBS를 포함 된 DMEM F/12 미디어 12 mL를 추가 합니다.
  5. 세포 현 탁 액을 발음 하 고 50 mL 원뿔 튜브에 배치.
  6. 3 x-4 그것을 반전 하 여 셀을 포함 하는 튜브를 흔들어 x.
  7. 필요한 경우, microcentrifuge 튜브에서 Trypan 파랑의 10 µ L로 세포 현 탁 액의 약 10 µ L 수를 혼합 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀. 셀의 총 수에서 Trypan 파랑 양성 세포의 수를 빼서 세포 생존 능력을 결정 하 고 셀의 총 수로 나누면.
  8. 300 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심
  9. 1 x 106 세포는 미디어의 50 µ L에 적절 한 볼륨에서 혈 청-와 항생제 DMEM 셀을 resuspend.
    참고: (경험적으로 결정) vivo에서 세포 선 공격에 따라, 사출 사이트 마우스 당 당 1 x 106 셀 B4B8 및 LY2 셀에 대 한 적절 한 간주 되었다.
  10. 얼음에 세포 현 탁 액을 포함 하는 유리병을 놓습니다.
  11. 얼음에 미리 해 동된 지하실 멤브레인 매트릭스를 놓습니다.
    참고: 지하실 막 매트릭스는 4 ° c.에 하룻밤 해 동

2. 셀 쥐로 주입

  1. 셀: 지하실 막 매트릭스 (50 µ L 각)의 1:1 혼합물을 준비 합니다.
  2. 추가 셀. 그런 다음, 점차적으로 지하실 멤브레인 매트릭스 플라스틱. 기포를 소개 하지 마십시오. 혼합 동물 주입 직전 이루어집니다 있는지 확인 합니다. 지하실 막을 시간의 연장된 기간에 대 한 셀을 추가 하는 것은 셀 혼합물을 엄격 하 게 동요 하기 어려운 시키는 매트릭스 혼합물에 정착 귀 착될 수 있다. 이 쥐의 종양 크기에 상당한 가변성을 발생 합니다.
  3. 부드럽게 혼합. 매트릭스를 포함 하는 모든 단계는 얼음에 수행 됩니다 확인 합니다. 지하실 막 매트릭스는 실내 온도에 유해 합니다.
  4. 접종에 대 한 주사기를 준비 합니다.
  5. 셀/지하실 막 매트릭스 솔루션의 100 µ L를 0.5 mL 인슐린 주사기 (23 G)를 넣습니다.
  6. 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스 합을 피하기 위해 주사기를 유지.
  7. 산소 (2.5%)와 isoflurane 챔버에 배치 하 여 마우스를 anesthetize.
  8. 생쥐는 (발가락 핀치에 응답의 부족 함으로써) 주사를 수행 하기 전에 마 취 깊이 확인 합니다.
  9. 오른쪽 또는 왼쪽 뺨 지역에 바늘을 삽입 합니다. 이것은 입의 양쪽에 사용할 수 있는 열린 공간을 통해 수행 됩니다.
  10. 마우스의 혀는 방식에서 아닙니다 인지 확인 합니다.
    참고: 혀, 혀 종양 귀 착될 것 이다 찌 르 기 쉽습니다. 필요한 경우에 반대 측에 혀를 이동 합니다.
  11. 주사기 구강 내 뺨 지역에 평행 하 게 유지.
  12. 때 주사, 주사기를 뒤로 당겨 10 ° 각도로 주사기를 천천히 삽입을 준비.
  13. 5 기간 동안 셀/지하실 막 매트릭스 정지 100 µ L를 주사 s.
  14. 추가 5 장소에 주사기를 잡고 모든 자료를 되도록 s 주입.
    참고: 제어 nontumor 베어링 마우스 주사 혈 청 자유로운 미디어와 매트릭스의 혼합물 (위에서 설명한)으로 종양 세포 없이.
  15. 부드럽게 주사기를 철회 한다.
  16. 나머지 마우스 위의 절차를 계속 합니다.
  17. 종양 심하게 나타나는 것을 시작 될 때까지 1 주에 대 한 허용 (50-200 밀리미터3 B4B8 및 LY2 셀).

3입니다. 마우스 모니터링

  1. 종양 세포 주입 후 1 주에 캘리퍼스를 사용 하 여 첫 번째 측정을 수행 합니다. 외부 캘리퍼스를 사용 하 여 종양 볼륨을 계산 하기 위해 최고의 경도 직경 (길이) 및 가장 큰 가로 지름 (폭)를 결정 하 고 수정된 타원 수식14,15를 사용 합니다.
    figure-protocol-1
  2. 계속 종양 볼륨 (x-2 1x 주당 정기적으로) 정기적인 캘리퍼스 측정을 수행 합니다.
  3. 종양의 성장에 먹이의 효과 평가 하기 위해 동물 무게를 측정 합니다.

4. 수확 종양

  1. 실험적인 끝점에 도달 하면 적절 한 조치 (예: CO2 질, 잘린, 또는 자 궁 경부 전위)를 사용 하 여 동물을 안락사.
    참고: 이 연구에서는 끝점에 도달 했다 쥐 죽어가는 경우 (체중의 감소와 함께 > 악 손질의 부족, 그들의 초기 무게의 15%) 및 종양 크기에 도달 하면 1, 000 m m3.
  2. 목 지역에는 중간을 통해 긴 절 개를 만들어 동물을 해 부를 시작 합니다.
    1. 무딘 집게를 사용 하 여 피부를 피부를 잘라가 위를 날카로운.
  3. 부드럽게 피부 종양을 덮고 아래가 위를 삽입 하 고와 피부에가 위를 추진 하 여 공기 주머니를 만듭니다.
  4. 피부 종양에서 충분히 분리 되 면 배출 림프 노드 (DLNs)를 식별 하 고 종양 조직 림프절의 존재에 의해 혼동된 하지 않도록 그들을 삭제할.
    참고: 큰 종양에 도달 및는 DLN 커버 수 있습니다. 수행 되는 분석 결과의 종류에 따라 그대로 림프절의 시험 결과 skewing 귀 착될 것 이다 종양에 면역 세포의 흘림 방지 필수적 이다.
  5. 전체 볼륨이 분리 될 때까지 종양의 국경을 통해 잘라.

5입니다. 종양 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 처리

  1. 다운스트림 조직학 검사에 대 한 실 온에서 10% 포 르 말린에 종양을 배치 합니다. Overfixation을 피하기 위해, 70% 에탄올으로는 포 르 말린을 바꿉니다. 아래 설명 된 대로 흐름 cytometry 분석, 대 한 종양을 처리 합니다.
    참고: Overfixation 얼룩의 특정 종류에 대 한 문제가 될 수 있는 전에 조직 72 h에 대 한 포 르 말린에 보관할 수 있습니다.
  2. 1-2 m m로 종양을 잘라-크기의 조각 살 균 면도날 또는 날카로운가 위를 사용 하 여.
  3. 콜라 3 세와 50 mL 원뿔 튜브에서 컷된 종양 조각을 놓으십시오 (샘플 당 4250 단위), DNase I (샘플 당 0.1 밀리 그램), 및 트립 신 억제제 (샘플 당 1 밀리 그램).
  4. 매 10 분을 떨고와 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    참고: 샘플 resealable 봉투, 90% 에탄올으로 소독 하 고 셀 문화 인큐베이터에 배치에 배치할 수 있습니다.
  5. 30 분 후 20 mL의 행 크의 균형 소금물 (HBSS) 및 5 분에 대 한 300 x g 에서 스핀을 추가 합니다.
    참고: HBSS는 염화 칼륨, 염화 나트륨, 나트륨 중 탄산염, 염기 나트륨 인산 염, 인산 이수소 나트륨과 포도 당으로 이루어져 있습니다.
  6. 삭제는 상쾌한 고 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼의 2-3 mL에 펠 릿을 resuspend. 엄격 하 게 플라스틱.
    참고: RBC 세포의 용 해 버퍼는 염화 암모늄, 중 탄산 나트륨, 및 disodium 구성 됩니다.
  7. 실 온에서 2 분 동안 품 어.
    참고: 더 이상 외피 다른 세포 인구에 게 독성이 될 수 있습니다.
  8. 세포의 용 해 버퍼의 효과 중화 하는 HBSS의 20 mL를 추가 합니다.
  9. 5 분에 대 한 300 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
  10. HBSS 10 mL에 펠 릿을 resuspend.
  11. 70 µ m 나일론 restrainer 통해 해결책을 통과 하 고 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한 삭제.
  12. 5.8-5.10 단계를 반복 하 고 정지에서 어떤 추가적인 파편 든 지 제거 되도록 하기 위해 40 µ m 나일론 restrainer 통해 세포 현 탁 액을 통과.

6. 세포 얼룩 및 데이터 수집

  1. HBSS의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.
  2. 1.7 단계에 설명 된 대로 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀의 개수
  3. 총 셀 수와 얼룩에 대 한 적절 한 농도 결정 합니다.
    참고:     흐름 cytometry 얼룩에 대 한 이상적인 셀 농도 1-2 백만 셀. 예를 들어 96 잘 접시에서 수행 하는 얼룩을 10 백만 셀이 1 mL 및 플레이트 100 µ L을 잘 당 1 백만 셀에 샘플을 resuspend.
  4. FcγIII 및 FcγII 수용 체 면역 글로불린의 nonantigen 특정 바인딩 방지 하기 위하여 1: 100의 농도에서 Fc 블록 (CD16/CD32)를 추가 합니다. 실 온에서 5 분 동안 품 어.

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결과

LY2 및 B4B8 세포 증식의 생체 외에서 평가 했다 두 셀 라인 비슷한 두 배로 시간을가지고 (21h와 23 h, 각각). Vivo에서 두 셀 라인 접종 (그림 1A)의 1 주 안에 단일, 표시, 및 만져 서 질량을 형성. LY2 종양 방위 쥐, 턱 종양 부담 (그림 1A) 때문에 3 주에 의해 전치 되었다. 종양 세포에는 영향을 받지 않은 통제 쥐 팬 들은 예상 대로 종양의 정보를 개발 하지 않았다. LY2 종양 B4B8 종양에 비해 더 높은 속도로 성장 했다. LY2 종양 방위 쥐 이었다 B4B8 종양 (그림 1B)에 162 ± 4 m m3 에 비해 632 ± 10 m m3 에서 21 일에 평균 종양 볼륨. 빠르게 턱 변위를 전시 하는 마우스 개발 dysphagia ...

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토론

엄격한 분석 및 종양 microenvironment의 종양 개발, 진행, 전이의 메커니즘을 이해 하 고 효과적인 치료의 개발에 대 한 중요 한 전략을 나타냅니다. 머리와 목 암은 머리와 목 지역 내의 여러 해 부 사이트에서 발생 한 수 있습니다 복잡 한 질병 이다. 질병 메커니즘을 이해 하 고 치료를 개선 하는 주요 장애물이 인간 HNSCCs의 공격적이 고 전이성 자연 닮은 murine 마우스 셀 라인의 부족 했습니다. 또한, 수많은 murine 모델 종양 머리와 목 지역, 높은 혈관 밀도, 광범위 한 림프 맥 관 구조, 및 상주 점 막 식물의 중요 한 생리 기능을 부족의 피하 주입을 사용 합니다.

이 연구에서 우리는 murine HNSCC의 orthotopic 모델 특징. 우리는 여러 가지 이유가, 이미지 지도, 캘리퍼스, 점 막 식물 내에서 종양의 존재를 사용 하 여 종양의 성장을 평가 하는 능력에 대 한 필요 없이 지역에 쉬운 접근을 포함 하 여 종양 접종의 사이트 볼 점 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
콜라겐 분해 효소 IIIWorthington Biochemical Corp.
DNase IWorthington Biochemical Corp.
Fc 블록 (CD16/32)BD 생명과학553141  클론 2.4G2 
플로우 사이토메트리 염색 버퍼eBioscience00-4222-26
HBSSThermoFisher Scientific14175079 칼슘, 마그네슘, 페노 레드
없음 Helois 질량 사이토미터FluidigmNA
Matrigel 막 매트릭스Corning CB-40234B
MRI 스캐너BrukerNA7.4 Tesla
RBC 용해 완충액BioLegend420301
트립신 억제제Worthington Biochemical Corp.
LS004183LS006328LS002830

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