단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

요약

여기, 선물이 단일 분자 수준에서 복잡 한 단백질 견본에서 각 단백질 종에 대 한 라벨 동질성을 평가 하는 프로토콜.

초록

셀 proteomes 전기 이동 법 분석 실험, 세포에 있는 단백질의 모든 종 형광 염료와 레이블이 아닌 구체적으로 하 고 그들의 분리에 따라 매칭에 의해 발견을 사용 하 여 특징. 단일 분자 형광 이미징 개별 형광 분자 시각화 능력 磁 단백질 검출을 제공할 수 있다. 그러나, 전기 이동 법 분석 실험에이 강력한 이미징 방법의 응용은 프로테옴 걸쳐 각 단백질의 형광 라벨의 동질성을 특성화 하는 방법의 부족에 의해 방해 된다. 여기, 우리는 단일 분자 형광 이미징 분석 결과에 따라 프로테옴 걸쳐 라벨 동질성을 평가 하는 방법을 개발 했다. 헬러 세포 샘플, 우리는 '라벨 인' 되 나 적어도 하나의 염료와 함께 표시 하는 단백질의 비율을 사용 하 여 측정에서 (LO), 결정 되었다 범위를 50%에서 90%, 단일 분자 이미징에 응용 프로그램의 높은 잠재력을 지 원하는 민감하고 정확한 프로테옴 분석입니다.

서론

프로테옴 분석, 셀에 표시 하는 단백질 분자의 전체 집합을 계량 하는 것을 목표로, 현재 생물의 약 연구에 귀중 한 접근 이다. 이 분석은 일반적으로 단백질 종 단백질 이온화^1,2,3를 통해 생성 된 스펙트럼에 따라 식별 하는 질량 분석에 의존 합니다. 프로테옴 분석에 대 한 대체 방법 이며 전기 이동 법, polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)를 포함 하 여, 모 세관 전기 이동 법 2 차원 (2D) 젤 전기 이동 법. 이 방법은 일반적인 전기 이동 별거 및 탐지 및 정량화 각 단백질의 분석 된 셀에서 모든 단백질 분자의 형광 라벨에 의존 합니다. 달성 하기 위해 필요한 일반적인 단백질 라벨, 하나의 전략 Coomassie Blue와 Sypro-루비^{4,5,6 등 정전기 및 소수 성 상호 작용을 통해 단백질을 바인딩할 수 있는 형광 염료를 사용 하는} . N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스테 르 또는 maleimide, 1 차 아민 및 thiols와 같은 일반적인 잔류물을 통해 단백질에 묶는 covalently 수 있습니다, 각각^7, 를 포함 하는 염료와 화학식 라벨을 사용 하는 대체 전략은 ⁸.

한편, 형광 검출의 감도 낮은 풍부한 단백질 및 세포의 작은 숫자 분석에 이상적입니다. 단일 분자 형광 이미징 개별 형광 염료와 생체 외와 생체 조건^{9,10,,1112, 레이블이 지정 된 단백질의 검출을 허용 하는 가장 중요 한 방법 중 하나는 13,,1415}. 응용 프로그램 이미징이 방법의 전기 기반 프로테옴 분석을 개별 붙일 표시 된 단백질을 계산 하 여 매우 민감하고 양적 분석을 사용 예정입니다. 그러나, 남아 있다 불분명 여부 형광 염료로 충분히 균질에 걸쳐 모든 단백질 분자 이며 어떻게이 동질성 다른 단백질 종 (그림 1)에 의해 영향을 받습니다. 간단한 대량 솔루션 측정 '커플링 효율'⁸ 또는 '효율 라벨' 라는 단백질에 형광 염료의 어 금 니 비율을 얻기 위해 사용할 수 있지만이 속성 중 라벨의 동질성에 정보를 제공 하지 않습니다. 단백질 분자입니다.

여기, 우리는 라벨 동질성¹⁶셀 (그림 2) 모든 단백질 종에 대 한 조사 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 분석 결과의 두 가지 주요 단계는 단백질 정화 및 이미징. 첫 번째 단계에서 셀에 모든 단백질은 붙일 표시 하 고 biotinylated, 다음 별도로 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 압축을 푼 뒤에 electroelution. 두 번째 단계에서 추출 된 표본에서 개별 단백질 분자의 형광 속성 단일 분자 이미징에 따라 평가 됩니다. 우리가 라벨 인 (LO)¹⁶, 전화와 형광 염료의 평균 수는 단일 단백질 분자에 바인딩된는이 데이터를 매개 변수 계산 분석에 대 한 중요 한 단백질의 비율 이라고 적어도 한 같은 염색 (n̄ _염료), 특성화 될 수 있습니다. 프로토콜, NHS 에스테 르 기반 Cyanine 3 (Cy3) 염료와 HeLa 세포 프로테옴을 라벨에 대 한 최적화 절차를 예를 들어, 제시 하 고 원하는 연구 목표에 따라 다른 레이블 프로시저를 수정할 수 있습니다.

프로토콜

1. 세포 준비

1. 37 ° C에서 10 cm 접시에 HeLa 세포 배양 미만 5% CO₂ Dulbecco의 수정 10% 태아 둔감 한 혈 청을 포함 하는 글의 중간.
2. 그들은 70 %confluency, ATCC 지침¹⁷다음에 도달 되 면 기 하 급수적으로 성장 세포를 수집 합니다.
   1. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) (pH 7.4) x 1의 5 mL로 세포를 씻어. PBS를 제거 합니다.
   2. 0.1% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 1 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에서 5 분을 품 어
   3. 현미경으로 세포 분리의 진행을 모니터링 합니다.
   4. 일단 셀 라운드 되 고 접시에서 분리, 성장 매체의 4 mL를 추가 하 고 셀 덩어리를 pipetting으로 휴식.
   5. 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
   6. 원심 분리기 튜브에서 10 분 150 x g 에서. 매체를 제거 하 고 resuspend 1 x PBS (pH 7.4)의 5 mL와 함께 셀 펠 릿.
   7. 1.2.6 단계를 반복 합니다. 10⁶ 셀/ml 단계 1.2.5에서에서 카운트 번호를 사용 하 여 최종 농도를 1 x PBS (pH 7.4)에 셀 resuspend
      참고: 셀 정지 수 aliquoted-80 ° C에서 저장 몇 달 동안. 냉동/해 동 주기를 반복 피해 야 한다.

2. 세포 세포의 용 해 및 형광 라벨

1. 게 lysing 버퍼의 10 mL (0.1 m M 붕 산 염, 1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)와 1% 트윈 20). PH 12 2 M NaOH를 사용 하 여 조정 됩니다.
   주의: 집중된 NaOH 부식성입니다. 이 솔루션을 준비 하는 때 적합 한 장갑과 안경 착용.
   참고: Lysing 버퍼는 실 온에서 1 주일까지 저장할 수 있습니다.
2. 1 M dithiothreitol (DTT)의 1 μ와 버퍼 및 4 lysing의 믹스 100 μ μ의 50 %3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (챕).
3. 2.2 단계에서 혼합된 lysing 버퍼와 세포 배양 (약 1, 000 셀)의 믹스 1 μ. 천천히 거품을 피하기 위해를 pipetting으로 솔루션을 균질. 부드러운 동요와 5 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 품 어. 다시 천천히 pipetting으로 솔루션을 균질.
4. 2 μ g/mL Cy3 NHS 에스테 르 염료의 1 μ를 추가 합니다. 천천히 거품을 피하기 위해를 pipetting으로 솔루션을 균질. 부드러운 동요와 함께 실 온에서 어둠 속에서 5 분 동안 품 어.
   참고:이 버퍼의 높은 산도 단백질, 높은 반응성 선도 리 진 잔류물의 중화를 발생 합니다.
5. 2 μ g/mL Cy3 NHS 에스테 르 염료의 1 μ의 추가 반복 합니다. 천천히 거품을 피하기 위해를 pipetting으로 솔루션을 균질. 부드러운 동요와 함께 실 온에서 어둠 속에서 10 분 동안 품 어.
   참고:이 반복 NHS 에스테 르 염료의 추가 때문에 일부 Cy3 NHS 에스테 르 염료의 분해 반응 버퍼의 높은 pH에 의해 비활성화 라벨 효율을 증가 시킬 수 있습니다.
6. PH 7.2 0.8 M의 100 μ를 추가 하 여 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) 조정-NaOH pH 7.2 반응 해소. 천천히 거품을 피하기 위해를 pipetting으로 솔루션을 균질.
7. 추가 19 mg/mL biotin-(폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG))₂의 20 μ-아민 및 20 mg/mL 1의 5 μ-에틸-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). 천천히 거품을 피하기 위해를 pipetting으로 솔루션을 균질. 부드러운 동요와 함께 실 온에서 어둠 속에서 1 시간에 품 어.
   참고:이 biotinylation 단계 현미경 coverslip 고정 밀도 및 아무 단백질 종에 단백질 분자를 해결할 필요가 있다.
8. Unreacted 라벨 시 약을 제거 하 고 제조업체의 지침에 따라 10 kDa 커트 오프와 한 열을 사용 하 여 샘플을 집중.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 샘플 몇 주 동안-80 ° C에 저장할 수 있습니다.

3. 프로테옴 분리 및 복구

1. SDS 샘플 버퍼 (200 mM Tris HCl pH 6.8, 4 %SDS, 4% 글리세롤과 0.4 %bromophenol 블루) x 4를 추가 합니다.
   참고: 염료 손상을 방지 하려면 단백질 샘플 수가 열 안 표준 SDS 페이지에서 다 고 실 온에서 보관 한다.
2. 단백질 견본 및 20% 아크릴 아 미드 젤을 사용 하 여 분자 사다리에 대 한 표준 SDS 페이지를 수행 합니다. 샘플을 마이그레이션하는 마이그레이션까지 일정 전압 (160 V)에서 젤 앞 그냥 젤 종료.
3. 단백질 밴드 (그림 3)의 위치를 식별할 수 젤 이미지.
4. 밴드 위치에 따라 날카로운 칼 날을 사용 하 여 관심사의 단백질 분수 포함 젤 부분을 잘라. 마찰 16, 23, 55 및 120 kDa 봉우리와 19-25, 25-32, 32-42, 42-54, 54-69, 69-97, 97-136, 136-226 kDa 영역은 그림 3에 나와 있습니다.
5. 제조업체의 지침에 따라 6-8 kDa의 기 공 크기와 electroelution에 의해는 dialyzer를 사용 하 여 단백질을 추출 합니다.
   참고: 추출 된 샘플 저장할 수 있습니다-80 ° C에서 몇 주 동안.

4. 현미경 coverslip 준비

1. 각 샘플 avidin 버퍼 (5 mM HEPES NaOH pH 7.2, 10 ng/mL avidin, 2 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA))의 200 μ를 준비 합니다.
2. 22 m m x 22 m m, 0.15 m m 두께의 coverslips을 준비 합니다. 공기 플라즈마를 사용 하 여 플라즈마 1 분 동안 청소기 청소 하 고 그들의 표면 활성화 coverslips를 노출 합니다.
3. 코트 1000 rpm에서 30 초 뒤 500 rpm에서 5 초 동안 스핀 coater를 사용 하는 avidin 버퍼의 스핀 코팅 200 μ에 의해 avidin와 coverslips. 드라이 그들을 실 온에서 15 분 동안 coverslips를 품 어.
4. Coverslips 단백질 샘플 준비.
   1. 5 mM HEPES NaOH ph 7.2 (3.5)에서 단백질 샘플 100 배 희석.
   2. (4.3 단계)에서 avidin 코팅 coverslip의 중심에서 표면에 희석된 샘플의 장소 100 μ.
   3. 실 온에서 15 분 동안 어둠 속에서 품 어.
5. 긍정적인 통제를 준비 합니다.
   1. 10 ng/mL의 장소 100 μ (단계 4.3)에서 5 mM HEPES NaOH pH 7.2는 avidin의 센터에서 코팅 coverslip 형광 biotin 정화.
   2. 실 온에서 15 분 동안 어둠 속에서 품 어.
      참고:이 긍정적인 통제 coverslip 제공 한다 avidin 밀도 바인딩 관광 명소를, LO를 계산 하는 데 사용 되는.
6. 부정적인 통제를 준비 합니다.
   1. 스핀-코트는 플라즈마 (avidin) 없이 5 mM HEPES NaOH 및 2 mg/mL BSA의 200 μ와 coverslip 청소.
   2. 건조 실 온에서 15 분 동안 품 어.
   3. 5 mM HEPES NaOH ph 7.2 10 ng/mL 정화 형광 biotin의 100 μ를 추가 합니다.
   4. 실 온에서 15 분 동안 어둠 속에서 품 어.
      참고:이 부정적인 제어 coverslip avidin 없이 coverslip에 형광 biotin의 일반적인 바인딩 양을 제공합니다.
7. 팁과 coverslip의 중간을 터치를 하지 coverslip의 가장자리에 pipetting으로 증류수 200 μ와 각 coverslip 린스. 이 세척 3 번 반복 합니다.
   참고:는 coverslip에 발음, 후 물 즉시 두어야 한다 완전히 밖으로 건조에서 그것을 방지 하기 위해 coverslip에 다시.
8. 4.2 단계에서 coverslips의 동일한 수에 어 플라즈마에 노출.
9. 건조를 피하기 위해 단계 4.7에서에서 샘플 바인딩된 coverslip 청소 coverslip을 놓습니다.

5입니다. 단일 분자 형광 현미경으로 관찰

1. 넓은 필드 또는 사라져 분야 형광 현미경을 시작 합니다.
   주의: 직접 또는 흩어져 레이저 방사선 눈 발생할 수 있습니다 또는 피부 손상. 적합 한 보호 고글을 착용 하 고 방패 레이저 빛 경로.
   참고: 현미경 설치를 참조 하십시오 우리의 이전 게시¹⁶. 간단히, 고 전력 488 nm 레이저 구동, 높은 수 가늠 구멍 객 관 렌즈와 고감도 카메라 넓은 필드 또는 사라져 분야 형광 현미경이이 측정을 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 자동 측정, 컴퓨터 제어 XY 변환 샘플 단, 레이저 업무가 대 한 기계적 셔터와 자동 초점 시스템 설치에 권장 됩니다.
2. 현미경에는 coverslip를 설정 하 고 포커스를 찾을.
3. 적어도 100 이미지를 타일 스캔을 수행 합니다.
   참고: 레이저 조명 photobleaching를 최소화 하기 위해 카메라와 이미지를 기록 하는 경우에 샘플에 노출 될 기계적 셔터와 제어 한다. 많은 샘플을 확인 하 고는, 자동된 측정 현미경 장치를 제어 하는 컴퓨터 프로그램을 사용 하 여 것이 좋습니다. 각 이미지 60 x 객관적 렌즈를 사용 하는 경우 일반적으로 100-500 단일 분자 관광 명소를 포함 합니다.

6. 이미지 분석 및 정보 추출

1. 이미지 흘 레이저 조명 패턴 때문에, 그것에 게¹⁸를 해결 하기 위해 이미지 처리 실시 합니다.
   1. 균일 하 게 확산 염료 설정 단계 5.3 같은 카메라를 사용 하 여 구성 된 coverslip 샘플 측정 하 여 참조 이미지를 취득 합니다.
   2. 없는 레이저 여기 같은 카메라 설정을 사용 하 여 측정 하 여 오프셋된 이미지를 취득 합니다.
   3. 오프셋된 이미지의 가치와 모든 샘플 이미지와 참조 이미지에서 각 픽셀 값을 뺍니다.
   4. 뺀된 참조 이미지에 값 뺀된 샘플 이미지의 각 픽셀 값을 나눕니다.
2. 제대로 획득된 이미지 수집 및 이미지 배경 제거.
   1. 큰 형광 집계를 수동으로 포함 된 이미지를 제거 합니다.
   2. ImageJ²⁰를 사용 하 여 50 픽셀의 공 반경으로 회전 공 알고리즘¹⁹ 를 적용 하 여 배경 이미지를 제거 합니다.
   3. ImageJ를 사용 하 여 흐린된 이미지를 빼서 이미지를 선명 하 게 (이미지 기능을 선명 하 게).
3. 찾아서 이미지 관광 명소 단일 분자 분석.
   1. ImageJ를 사용 하 여 엔 임계값 알고리즘²¹ 단일 분자 관광 명소를 식별 합니다.
   2. 제외할 카메라와 관광 명소의 어두운 소음 ImageJ (ROI 관리자)를 사용 하 여 단백질의 집계 제외 20 픽셀 미만 두 픽셀와 명소를 필터링 합니다.
   3. 각 이미지에 관광 명소의 수를 계산 합니다. 조명 수정된 이미지 (6.1.4 단계) 분석을 사용 하 여 모든 명소에 대 한 픽셀 내에서 농도 총 ImageJ를 사용 하 여.
4. 다음 수식을 사용 하 여 라벨 인 (LO)를 계산.
   LO = (샘플에서의 번호 / 긍정적인 컨트롤의 번호) x 100
5. 단일 단백질 분자 (n̄_염료)에 바인딩된 형광 염료의 평균 수를 계산 합니다.
   1. 모든 자리의 농도의 히스토그램을 분석 합니다.
      참고: 히스토그램 일반적으로 여러 개의 봉우리, 그리고 모든 피크는 단백질에 바인딩된 염료 분자의 다른 수를 나타냅니다. 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 피크 히스토그램에 각각 1, 2, 3 분자에 해당.
   2. 히스토그램에서 평균 강도 계산 합니다. 또한 가우스 피팅을 적용 하 여 첫 번째 피크의 피크 강도 계산 합니다.
   3. N̄_염료 피크 강도 평균 강도 나누어 계산 합니다.

결과

그림 4 는 긍정적이 고 부정적인 제어 뿐 아니라 HeLa 세포, lysate에서 단백질의 다른 분자량 분수에 대 한 원시 이미지 데이터를 나타냅니다. 단백질 견본 및 긍정적인 이미지 당 100-500 전시 명소를 제어 하는 동안 부정적인 컨트롤 없음 또는 프로토콜 충분히 coverslip 표면에 염료의 일반적인 바인딩을 억제를 보여주는 몇 가지 관광 명소를 표시 합니다. 자리 강도 히스토그램 단백질 샘플 및 긍정적인 통제에 대 한 여러 봉우리, 대표 하는 염료의 확률적 바인딩 단백질 및 avidin tetramer 구조²², 1 차 아민을 각각 제시. 모든 관광 명소 깜박이 stepwise photobleaching 연속 레이저 여기, (그림 5AB) 단일 분자 수준에서 관찰을 강조 했다.<...

토론

이 문서는 SDS 페이지 (3 단계)와 분리 후 셀에 각 레이블이 단백질 종의 라벨 동질성을 계량 하는 프로토콜을 설명 합니다. 분리 방법 분리 및 특수 장비²³을 요구 하면서 높은 해상도, 세포질 단백질의 분류를 허용 하는 모 세관 전기 이동 법, 액체 크로마토그래피 등 다른 방법으로 교체하실 수 있습니다. 현재 프로토콜에 NHS 에스테 르를 사용 하 여 라벨 메서드 예 maleimide-에스테 르 또는 항 체를 사용 하 여 다른 방법으로 대체할 수 있습니다.

커플링 효율 분석에 가정 동질성 분석을 라벨에 대 한 요구 사항은 간단한 무작위 과정에서 일탈 얼마나 라벨에 따라 다릅니다. 우리의 최근 연구¹⁶ 는 pH 및 세제 같은 반응 조건에 따라 임의의 프로세스에서 일탈 단백질의 NHS 에스테 르 레이블 표시. 우리는 몇 가지 조건 이종 단백질에 염료의 협력적인 바인딩 또는 불완전 한 가용 화 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
22x22x0.15mm 커버슬립	VWR	470019-004
488nm 아르곤 레이저	Coherent	Innova 70C
488nm 이색성 미러	Semrock	FF495-Di03
488nm 방출 필터	Semrock	FF02-520/28
560nm 이색성 필터	Semrock	Di02-R561
560nm 방출 필터	Semrock	FF02-617/73
560nm 파이버 레이저	MBP 통신	F-04306-2
60x 오일 이멀젼 렌즈	Olympus	PLAPON 60x
Avidin	Nacalai-tesque	03553-64
Biotin-PEG-amine	Thermo Scientific	21346
Biotinylated Alexa Fluor 488	Nanocs
Borate	Nacalai-tesque
BSA	Sigma-Aldrich	A9547
CHAPS	Dojindo	C008-10
Cy3 NHS-에스테르 염료	GE 헬스케어	PA13101
투석기  - D-튜브, 6-8 kDa	Merck Millipore	71507-M
DMEM	시그마-Aldrich
DTT	Nacalai-tesque	14112-94
EDC	Nacalai-tesque
EMCCD 카메라	Andor	IiXon 897
Epi 형광 현미경	Olympus	IX81
젤 뷰어	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000
페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테레신 믹스	Gibco
플라즈마 클리너	Diener Electronic
SDS	Wako	NC0792960
Size 정화 칼럼 10K	Merck Millipore	UFC5010
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416