단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

요약

여기, 선물이 단일 분자 수준에서 복잡 한 단백질 견본에서 각 단백질 종에 대 한 라벨 동질성을 평가 하는 프로토콜.

초록

셀 proteomes 전기 이동 법 분석 실험, 세포에 있는 단백질의 모든 종 형광 염료와 레이블이 아닌 구체적으로 하 고 그들의 분리에 따라 매칭에 의해 발견을 사용 하 여 특징. 단일 분자 형광 이미징 개별 형광 분자 시각화 능력 磁 단백질 검출을 제공할 수 있다. 그러나, 전기 이동 법 분석 실험에이 강력한 이미징 방법의 응용은 프로테옴 걸쳐 각 단백질의 형광 라벨의 동질성을 특성화 하는 방법의 부족에 의해 방해 된다. 여기, 우리는 단일 분자 형광 이미징 분석 결과에 따라 프로테옴 걸쳐 라벨 동질성을 평가 하는 방법을 개발 했다. 헬러 세포 샘플, 우리는 '라벨 인' 되 나 적어도 하나의 염료와 함께 표시 하는 단백질의 비율을 사용 하 여 측정에서 (LO), 결정 되었다 범위를 50%에서 90%, 단일 분자 이미징에 응용 프로그램의 높은 잠재력을 지 원하는 민감하고 정확한 프로테옴 분석입니다.

서론

프로테옴 분석, 셀에 표시 하는 단백질 분자의 전체 집합을 계량 하는 것을 목표로, 현재 생물의 약 연구에 귀중 한 접근 이다. 이 분석은 일반적으로 단백질 종 단백질 이온화^1,2,3를 통해 생성 된 스펙트럼에 따라 식별 하는 질량 분석에 의존 합니다. 프로테옴 분석에 대 한 대체 방법 이며 전기 이동 법, polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)를 포함 하 여, 모 세관 전기 이동 법 2 차원 (2D) 젤 전기 이동 법. 이 방법은 일반적인 전기 이동 별거 및 탐지 및 정량화 각 단백질의 분석 된 셀에서 모든 단백질 분자의 형광 라벨에 의존 합니다. 달성 하기 위해 필요한 일반적인 단백질 라벨, 하나의 전략 Coomassie Blue와 Sypro-루비^{4,5,6 등 정전기 및 소수 성 상호 작용을 통해 단백질을 바인딩할 수 있는 형광 염료를 사용 하는} . N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스테 르 또는 maleimide, 1 차 아....

프로토콜

1. 세포 준비

1. 37 ° C에서 10 cm 접시에 HeLa 세포 배양 미만 5% CO₂ Dulbecco의 수정 10% 태아 둔감 한 혈 청을 포함 하는 글의 중간.
2. 그들은 70 %confluency, ATCC 지침¹⁷다음에 도달 되 면 기 하 급수적으로 성장 세포를 수집 합니다.
   1. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) (pH 7.4) x 1의 5 mL로 세포를 씻어. PBS를 제거 합니다.
   2. 0.1% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 1 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에서 5 분을 품 어
   3. 현미경으로 세포 분리의 진행을 모니터링 합니다.
   4. 일단 셀 라운드 되 고 접시에서 분리, 성장 매체의 4 mL를 추가 하 고 셀 덩어리를 pipetting으로 휴식.
   5. 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
   6. 원심 분리기 튜브에서 10 분 150 x g 에서. 매체를 제거 하 고 resuspend 1 x PBS (pH 7.4)의 5 mL와 함께 셀 펠 릿.
   7. 1.2.6 단계를 반복 합니다. 10⁶ 셀/m....

결과

그림 4 는 긍정적이 고 부정적인 제어 뿐 아니라 HeLa 세포, lysate에서 단백질의 다른 분자량 분수에 대 한 원시 이미지 데이터를 나타냅니다. 단백질 견본 및 긍정적인 이미지 당 100-500 전시 명소를 제어 하는 동안 부정적인 컨트롤 없음 또는 프로토콜 충분히 coverslip 표면에 염료의 일반적인 바인딩을 억제를 보여주는 몇 가지 관광 명소를 표시 합니다. 자리 강도 히스토그램 단백질 샘플 및 긍정적인 통제에 대 한 여러 봉우리, 대표 하는 염료의 확률적 바인딩 단백질 및 avidin tetramer 구조²², 1 차 아민을 각각 제시. 모든 관광 명소 깜박이 stepwise photobleaching 연속 레이저 여기, (그림 5AB) 단일 분자 수준에서 관찰을 강조 했다.<.......

토론

이 문서는 SDS 페이지 (3 단계)와 분리 후 셀에 각 레이블이 단백질 종의 라벨 동질성을 계량 하는 프로토콜을 설명 합니다. 분리 방법 분리 및 특수 장비²³을 요구 하면서 높은 해상도, 세포질 단백질의 분류를 허용 하는 모 세관 전기 이동 법, 액체 크로마토그래피 등 다른 방법으로 교체하실 수 있습니다. 현재 프로토콜에 NHS 에스테 르를 사용 하 여 라벨 메서드 예 maleimide-에스테 르 또는 항 체를 사용 하 여 다른 방법으로 대체할 수 있습니다.

커플링 효율 분석에 가정 동질성 분석을 라벨에 대 한 요구 사항은 간단한 무작위 과정에서 일탈 얼마나 라벨에 따라 다릅니다. 우리의 최근 연구¹⁶ 는 pH 및 세제 같은 반응 조건에 따라 임의의 프로세스에서 일탈 단백질의 NHS 에스테 르 레이블 표시. 우리는 몇 가지 조건 이종 단백질에 염료의 협력적인 바인딩 또는 불완전 한 가용 화 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
22x22x0.15mm 커버슬립	VWR	470019-004
488nm 아르곤 레이저	Coherent	Innova 70C
488nm 이색성 미러	Semrock	FF495-Di03
488nm 방출 필터	Semrock	FF02-520/28
560nm 이색성 필터	Semrock	Di02-R561
560nm 방출 필터	Semrock	FF02-617/73
560nm 파이버 레이저	MBP 통신	F-04306-2
60x 오일 이멀젼 렌즈	Olympus	PLAPON 60x
Avidin	Nacalai-tesque	03553-64
Biotin-PEG-amine	Thermo Scientific	21346
Biotinylated Alexa Fluor 488	Nanocs
Borate	Nacalai-tesque
BSA	Sigma-Aldrich	A9547
CHAPS	Dojindo	C008-10
Cy3 NHS-에스테르 염료	GE 헬스케어	PA13101
투석기  - D-튜브, 6-8 kDa	Merck Millipore	71507-M
DMEM	시그마-Aldrich
DTT	Nacalai-tesque	14112-94
EDC	Nacalai-tesque
EMCCD 카메라	Andor	IiXon 897
Epi 형광 현미경	Olympus	IX81
젤 뷰어	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000
페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테레신 믹스	Gibco
플라즈마 클리너	Diener Electronic
SDS	Wako	NC0792960
Size 정화 칼럼 10K	Merck Millipore	UFC5010
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416