Method Article

마우스에서 뇌간 에서 데이터 수집 및 분석 음성 응답 청력 측정

DOI:

10.3791/59200

⸱

May 10th, 2019

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1Experimental Neuropsychopharmacology, Federal Institute for Drugs and Medical Devices, 2KBRwyle GmbH, 3Cognitive Neurophysiology, Department of Psychiatry and Psychotherapy, Faculty of Medicine, University of Cologne, 4Molecular and Cellular Cognition, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 5Institute of Neurophysiology, Faculty of Medicine, University of Cologne, 6Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM), 7Thescon GmbH

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

뇌간 은 임상 신경 생리학에서 중요한 도구입니다 반응 청력 측정을 불러 일으켰다. 요즘, 뇌간 은 약리학 및 유전 동물 모델 모두를 포함하는 기초 과학 및 전임상 연구에서도 반응 청력 측정을 불러 일으켰다. 여기에서 우리는 청각 뇌간 반응이 마우스에서 성공적으로 기록되고 분석될 수 있는 방법에 대한 상세한 설명을 제공합니다.

Abstract

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뇌간 유발 반응 청력 측정 (BERA)는 임상 신경 생리학에서 중앙 관련성입니다. 시각적으로 유발된 전위(EP) 전위(EP) 또는 체감각 유발 전위(SEP)와 같은 다른 자극전위(EP) 기술이 바와 같이, 청각 유발 전위(AEP)는 동일한 자극의 반복적인 프리젠테이션에 의해 촉발됩니다. 뇌전도 (EEG) 응답은 이후에 뚜렷한 양성 (p) 및 음의 (n) 편향의 결과로 평균화됩니다. 인간에서는, 개별 피크의 진폭 그리고 대기 시간 둘 다 근본적인 신경 회로에 있는 동기화 및 전도 속도의 변경을 특성화하기 위하여 이용될 수 있습니다. 중요한 것은, AE는 또한 약리학 및 유전 동물 모형에 있는 청각 기능을 확인하고 특성화하기 위하여 기초와 전임상 과학에서 적용됩니다. 더욱이, 약리학적 인 테스트와 함께 동물 모델은 감각 신경성 난청 (예 : 연령 또는 소음 유발 청력 적자)의 치료에 잠재적 인 이점을 조사하기 위해 활용됩니다. 여기에서우리는 클릭과 톤 버스트 응용 프로그램을 사용하여 마우스에 청각 뇌간 유발 응답 (AR)을 기록하는 방법에 대한 상세하고 통합적인 설명을 제공합니다. 이 프로토콜의 특정 초점은 실험 전 동물 하우징, 마취, ABR 기록, ABR 필터링 프로세스, 자동화된 웨이블릿 기반 진폭 성장 함수 분석 및 대기 시간 감지에 있습니다.

Introduction

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뇌 생리학의 핵심 측면은 학습, 기억, 정서적 반응 또는 운동 반응과 같은 다양한 본질 또는 외적 출력을 초래하는 환경 정보를 처리하는 기능입니다. 다양한 실험 및 진단 접근법은 자극 관련 뉴런 회로 내에서 개별 신경 세포 유형 또는 클러스터/뉴런의 반응성의 전기생리학적 반응을 특성화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 전기 생리학적 기술은 마이크로, 메소 및 대용량 1에 대한상이한 시공간적 치수를 다룹니다. 마이크로 스케일 레벨은 예를 들어 배양 또는 급성 해리 뉴런 1을 사용하는 다른 패치 클램프모드에서 전압 및 전류 클램프 접근법을 포함합니다. 이러한 시험관내 기술은 개별적인 현재 엔티티 및 그들의약리학적 변조2,3의특성화를 허용한다. 그러나 중요한 단점은 마이크로 및 매크로 회로 정보 통합 및 처리와 관련하여 체계적인 정보가 부족하다는 것입니다. 이 손상은 배양 된 뉴런뿐만 아니라 급성 뇌 슬라이스에서도 동시에 세포 외 다전극 기록을 허용하는 다전극 배열과 같은 메조 스케일의 생체 외 기술에 의해 부분적으로 극복됩니다4. 5.마이크로 회로는 특정 범위 (예를 들어, 해마에서)로 뇌 슬라이스에 보존 될 수 있지만, 장거리 상호 연결은 전형적으로손실6. 궁극적으로, 뉴런 회로내의 기능적 상호연결을 연구하기 위해, 거시적 척도에 대한 생체내 전기생리학적 기술이 선택된7의방법이다. 이러한 접근법은 무엇보다도, 인간 및 동물 모델 둘 다에서 수행되는 표면(경막외) 및 깊은(intracerebral) EEG 기록을 포함한다. EEG 신호는 주로 흥분제 입력8의 일반적인 우세에도 불구하고 주체에서 억제 또는 흥분될 수 있는 상이한 피질 층에서 피라미드 형 뉴런에동기화 된 시냅스 입력을 기반으로합니다. 동기화시, 세포외 전기장에서의 흥분성 세포내전위 전위-기반 이동은 표면 전극을 사용하여 두피에 기록될 수 있는 충분한 강도의 신호를 형성하기 위해 합산된다. 특히, 개별 전극에서 검출 가능한 두피 기록은 증폭기, 필터링 프로세스(로우 패스 필터, 하이 패스 필터, 노치 필터 및 특정 도체 특성을 가진 전극.

대부분의 실험 동물 종(즉, 마우스 및 래트)에서, 인간 기반 두피 EEG 접근법은 근본적인 피질에 의해 생성된 신호가 제한된 수의 동기화된피라미드 뉴런(9)으로 인해 너무 약하기 때문에 기술적으로 적용되지않는다. 10,11. 설치류에서, 표면 (두피) 전극 또는 피하 전극은 따라서 심전도에 의해 심각하게 오염되고 고품질 의 EEG 기록을불가능하게 하는 주로 전기 신경학상 유물 9,11, 12. 무마취 자유롭게 움직이는 마우스와 쥐를 사용하는 경우, 따라서 직접 감지 팁의 직접 물리적 연결을 보장하기 위해 경막 외 전극을 통해 피질또는 깊은, 내추적 구조에서 중 하나를 기록하는 것이 필수적이다 신호 생성 신경 세포 클러스터에 납 /이식 된 전극의. 이러한 EEG 접근법은 구속된 테더링 시스템 설정에서 또는 비억제 이식형 EEG 무선 원격측정 접근법 9,10,11을사용하여 수행될 수 있다. 두 기술은 자신의 장점과 단점을 가지고 있으며 발작 감수성 / 발작 활동, circadian 리듬, 수면 아키텍처, 진동 활동 및 동기화의 질적 및 정량적 특성화에 귀중한 접근 이 될 수 있습니다. 시간 주파수 분석, 소스 분석등을 포함하여 9,10,13,14,15,16,17.

테더링 된 시스템 및 무선 원격 측정은 각각 억제 / 반억제 또는 비 억제 조건하에서 EEG 기록을 허용하는 반면, 관련 실험 조건은 ABR 기록에 대한 요구 사항과 일치하지 않습니다. 라우드 스피커와 실험 동물의 정의된 위치와 제어된 음압 레벨(SPL)으로 시간이 지남에 따라 반복적으로 제시되는 정의된 음향 자극에 대한 후자의 요구. 이것은 제지 조건 하에서 머리 고정또는 마취18,19에의해 달성될 수 있습니다. 실험 적 스트레스를 줄이기 위해, 동물은 일반적으로 ABR 실험 동안 마취되지만 마취가 ABR19,20을방해 할 수 있다고 고려해야합니다.

일반적인 특성으로서, EEG는 50-100 μV. 배경 주파수 및 진폭의 전압 범위에서 상이한 주파수로 구축되어 실험 동물의 생리적 상태에 크게 의존한다. 깨어 있는 상태에서, 베타(β) 및 감마(γ) 주파수가 더 낮은 진폭을 가진 우세. 동물이 졸리거나 잠들 때, 알파(α), 세타(θ), 및 델타(δ) 주파수가 발생하여, 증가된 EEG진폭(21)을 나타낸다. 일단 감각 채널 (예를 들어, 음향 통로)가 자극되면, 정보 전파는 말초 및 중추 신경계를 통해 신경 활동을 통해 중재됩니다. 이러한 감각(예: 음향) 자극은 소위 EP 또는 유발 된 응답을 유발합니다. 특히, 이벤트 관련 전위(ERP)는 EEG(즉, 몇 마이크로볼트만)보다 진폭이 훨씬 낮다. 따라서, 단일 자극에 기초한 임의의 개별 ERP는 더 높은 진폭 의 EEG 배경에 대하여 손실될 것이다. 따라서 ERP를 기록하려면 동일한 자극(예: ABR 기록의 클릭)과 후속 평균화의 반복적인 적용이 필요하며, 이는 임의의 EEG 배경 활동 및 아티팩트를 제거한다. ABR 기록이 마취 된 동물에서 수행되는 경우, 여기에서 피하 전극을 사용하기 쉽습니다.

주로 AEP에는 일반적으로 A벌또는 BERA와 관련된 짧은 대기 시간 EP가 포함되며, 또한 중간 지연 EP(중간 지연 응답 [MLR]) 및 긴 대기 시간 EPs22와같은 이후 발병 전위가 포함됩니다. 중요한 것은, 청각 정보의 정보 처리에 있는 교란은 수시로 신경 정신병병 (demyelinating 질병, 정신 분열증 등)의 중앙 특징 및 AEP 변경과 관련되었던23,24 ,25. 행동 조사는 기능적 장애를 드러낼 수 있는 반면, AEP 연구는 특정 신경 해부학 적 구조와 관련된 청각 기능 장애의 정확한 시공간 분석을 허용합니다26.

ABR은 보통 에서 높은 강렬한 클릭 응용 프로그램에서 일반적으로 감지되며, 최대 7개의 ABR 피크(W I-WVII)가발생할 수 있습니다. 가장 중요한 파도(W I-W V)는 다음과 같은 신경 해부학 구조와 관련이 있습니다 : WI은 청각 신경 (말단 부분, 내이 내); W II를 달팽이관 핵(청각 신경의 근위 부분, 뇌간 종단); W III상수체(SOC)에 우수한 올리바리 복합체; W IV를 측면 렘니스커스(LL);; W V는 반대측에서 열등한 콜리큘러스(IC) 내의 측면 렘니스커스(LL)의 종결(27)(보충도 1)이다. WII-W V는 그(것)들에 기여하는 오름차순 청각 통로의 하나 이상의 해부학 적 구조를 가질 가능성이 있다는 것을 유의해야 한다. 특히, 피크와 청각 지역의 기본 구조의 정확한 상관 관계는 여전히 완전히 명확히되지 않습니다.

청각학에서 ABE는 스크리닝 및 진단 도구로 사용할 수 있으며 외과 모니터링28,29. 이형성증, 히pacusis 및 아나쿠스시스(예: 노화 관련 난청, 소음 유발 난청, 대사 및 선천성 난청, 기형 또는 기형으로 인한 비대칭 청력 상실 및 청력 결핍) 식별에 가장 중요합니다. 기형, 부상 및 신 생물)28. AAB는 또한 활동적이고 지적 장애가 있는 어린이 또는 기존의 청력 측정에 반응할 수 없는 다른 어린이(예: ADHD, MS, 자폐증 등)에 대한 선별 검사와 관련이 있습니다29 , 30)인공와우의 개발 및 외과적 피팅에28. 마지막으로, A브라스는 항간질제31,32와같은 신경정신병치료제의 잠재적이독성 부작용에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있다.

약리학 또는 형질전환 마우스 모델에서 인간으로 의한 신경 생리학적 지식의 번역의 가치는 쥐와 쥐33의 청각 패러다임에서 ERPs의 수준에서, 특히 수많은 설정에서 입증되었습니다. 34,35. 변경된 초기 AEP에 대한 새로운 통찰력 및 마우스와 쥐의 청각 정보 처리의 관련 변화에 대한 새로운 통찰력은 따라서 인간에게 번역될 수 있으며 청각, 신경학상 및 신경 정신 질환이 미래에. 여기에서 우리는 ABE가 기본적인 과학, 독성 학 및 약리학적 인 목적을 위해 마우스에서 성공적으로 기록되고 분석 될 수있는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

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Protocol

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모든 동물 절차는 독일 동물 관리 위원회의 지침에 따라 수행되었으며 모든 프로토콜은 동물 관리에 대한 지역 기관 및 국가위원회의 승인을 받았습니다 (Landesamt für Natur, Umwelt, und Verbraucherschutz, 주 노스 라인 - 웨스트 팔리아의 사무실, 자연, 환경 및 소비주의의 학과 [LANUV NRW], 독일). 저자는 모든 동물 실험이 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 수행되었다는 것을 추가로 증명 (NIH 간행물 No. 80-23) 개정 1996 또는 영국 동물 (과학 절차) 법 1986년 및 관련 지침, 또는 1986년 11월 24일(86/609/EEC) 및 2010년 9월 22일(2010/63/EU)의 유럽 공동체 이사회 지침. 사용되는 동물의 수와 고통을 최소화하기 위해 구체적인 노력이 이루어졌습니다 (3R [교체, 감소 및 정제] 전략).

1. 실험동물

  1. 실험 동물 과 종의 선택
    1. 특정 인간 질병과 관련된 상동성, 등화및 예측 가능성의 요구 사항을 충족하는 설치류/설치류 모델(예: 마우스 또는 쥐)에서 ABR 연구를 수행합니다. 이것은 번역 신경 과학에 있는 기본적인 양상 측면에서 특정 중요성입니다.
      참고 : 사용 가능한 잡종 마우스 및 쥐 균주는 기본적인 생리학적 특성 및 병리생리학적 특성36,37,38의차이를 보여줄 수 있다는 것을 고려한다. 이러한 마우스/래트 라인 관련 특이성은 실험 계획에서 고려해야 합니다.
    2. 전기 생리학적 실험에 영향을 미칠 수 있는 생리학 및 약리학의 마우스 및 쥐 균주 별 변경(예: 변경된 마취 감도, circadian rhythmi, [오디오 제닉] 발작 감수성, 연령, 및 유전 적 배경)39,40,41,42.
    3. 연구 설계에 성별별 계층화를 포함합니다. 에스트로스 주기는 마취 감수성, 중앙 리듬, circadian 의존성 및 발작 활동 (청각 발작) 및 감각 (청각) 정보 처리에 심각하게 영향을 미칠 수 있음을 기억하십시오43,44 , 45. 따라서 성별별 분석을 수행합니다.
      참고: 일반적으로 사이클링 여성으로부터다양한 신경생리학적 파라미터가 남성46에비해 증가된 가변성을 나타내지 않는 것처럼 보이지만, 재정적 및 실험적 능력이 제한되는 경우 남성 마우스로 제한한다.
  2. 동물 수용 및 취급
    1. 동물 시설 내부의 개별 환기 케이지에 쥐 또는 쥐를 집.
    2. 실험 동물을 동물 시설에서 마취, ABR 전극 배치 및 ABR 기록을 위한 특수 실험실 에 있는 환기 캐비닛으로 옮김으로 옮김을 옮김.
    3. 동물이 표준 환경 조건 (즉, 21 ± 2 ° C, 50 % - 60 % 상대 습도, 기존의 12 /12 h 빛 / 어두운 주기의 온도)에서 통풍이 잘되는 캐비닛에 보관되어 있는지 확인하십시오. 동물이 순응하고 후속 실험 전에 적어도 14 일 동안이 circadian 패턴에 적응 할 수 있도록.
    4. 명확한 폴리 카보네이트 케이지 유형 II (26.7 cm x 20.7 cm x 14.0 cm, 410cm2의면적)를 사용하여 3-4 의 그룹에서 하우징 마우스를 사용하고 명확한 폴리 카보네이트 케이지 유형 III (42.5 cm x 26.6 cm x 18.5 cm, 800cm2)를 사용합니다. 식수 및 표준 식품 펠릿에 대한 광고 리비텀 액세스를 제공합니다.
    5. ABR 기록 전후에 실험 동물의 분리/분리는 실험 결과에 영향을 미치는 심한 스트레스를 가할 수 있기 때문에 피하십시오. 따라서 마취, ABR 전극 배치 및 ABR 기록에 따라 동물을 홈 케이지에 다시 넣습니다.
    6. 특히 청각 연구에서 다양한 실험적 단점이 있기 때문에 개방형 주택 조건을 적용하지 마십시오. 대신 통풍이 잘 되는 캐비닛은 감각신경성 난청(예: 소음 유발 난청)으로 이어질 수 있는 실험적인 청각 절차 이전과 그 사이에 음향 스트레스로부터 보호하여 결과에 영향을 미칩니다.
    7. 마우스- 및 쥐 특정 위생, 마취 및 기술 장비를 활용하여 쥐나 쥐가 경쟁 종의 상호 감각 지각으로 서로의 존재를 감지 할 수 없도록 연구에서 피할 수있는 혼란 요인을 초래할 수 있습니다.

2. 마우스 마취

  1. 주 사용 마 취를 사용 하 여 마 취를 수행 합니다. 케타민 염산염 (설치류 투여량 : 100 mg / kg)과 자일라진 염산염 (설치류 투여량 : 10 mg / kg)을 0.9 % NaCl 또는 링거 용액으로 조합하여 몸 무게에 따라 동물을 복강 내 주사하십시오.
    참고: 이소플루란을 통한 흡입 마약은 ABR 절차에 따라 일반적으로 사운드 감쇠 칸막이와 패러데이 케이지가 필요하므로 녹음 설정 내에서 공간적 제한이 생기는 것이 좋습니다. 많은 마취제가 NMDA 시스템에 작용하고 분명히 ABR 기록 결과에 영향을 미치지만, ABR 기록의 비 마취 제지 접근법은 의식하에 억제 절차가 동물에게 극적인 스트레스를 유발하는 것으로 권장되지 않습니다. A브라이스의 심각한 후속 유물 형성.
  2. 꼬리 꼬집기, 발 꼬집기 및 호흡 률 모니터링(마우스: 150-220 호흡/분)을 수행하여 마취의 깊이를 주의 깊게 관찰합니다. 필요한 경우 가능한 헐떡거리 및 중화 여부를 확인하십시오.
    참고 : 다른 마우스 라인 이나 약리학 마우스 모델은 마취에 다른 감도를 나타낼 수 있습니다. 돌연변이 마우스 모델도 마찬가지입니다. Endotracheal 삽관은이 실험 설정에서 필수가 아니며 권장하지 않습니다. 삽관이 기관 및 감염에 대한 외상의 위험을 증가시키기 때문에 ABR 절차 중 엔도트라클로힐 삽관의 이점/위험은 부정적입니다.

3. 안과 식준비 및 계측의 일반적인 측면

  1. 동물의 체온을 유지하기 위해 가정용 난방 담요를 사용하여 ABR 녹음 중 및 후에 추가 온기를 적용하십시오. 후자를 36.5-38.0 °C(98.6-100.4°F)에서 유지합니다.
    참고 : 저체혈증은 신체 부피 (마우스 몸 표면 = 10.5 x (g의 무게)2/3;쥐 체면 = 10.5 x (중량)2/3)때문에 작은 설치류의 위험 요소입니다.
  2. 각막 탈수방지를 위해 전체 ABR 기록 과정에서 석유 기반 인공 눈물 연고 또는 5% 덱스판테놀로 동물의 눈을 덮습니다. 깜박이는 반사가 완전히 복원될 때까지 이 절차를 계속합니다.
  3. 오토클레이브 나 소독제를 사용하여 실험 기구 (재료 표참조)를 살균하십시오.
    참고 : 유리 구슬이있는 열 기반 수술 기구 멸균기를 사용할 것을 권장합니다.
  4. 정확한 ABR 전극 배치를 위해, 유연한 또는 자가 지지 이동식 광 가이드를 통해 강렬한 조명을 위해 차가운 광원이 있는 쌍안경 수술 배율 현미경을 사용하십시오.
  5. 실험 동물 취급 및 실험 중에 깨끗한 실험실 코트, 얼굴 마스크, 헤드 커버 및 멸균 장갑을 사용하십시오.
    참고: 최적의 기기 및 소모품은 실험실마다 다를 수 있으며 실험실별 및 기관 표준을 충족해야 합니다.

4. ABR 녹음

참고: 여기에 설명된 프로토콜은 모노 및 바이노럴 레코딩을 위해 시판되는 ABR 시스템을 기반으로 합니다. 중요한 것은, 해결해야 할 과학적 질문은 사용되는 ABR 시스템의 기술 사양을 충족해야 합니다. 바이노럴 기록의 ABR 분석은, 예를 들어, 청각 경로에서 청각 자극의 측면 코딩을 조사하고 신경 정신병 질환에서 말초 측면 비대칭을 연구하는 데 사용될 수 있다.

  1. 사전 증폭기와 처리 시스템에 연결된 마이크를 배치하여 매일 녹음하는 날의 자극 주파수 보정을 수행하여 사운드 감쇠 칸막이 내부에 올바른 주파수를 실험적인 뮤린 귀가 위치하게 될 방향.
    1. 교정 최소 5분 전에 마이크에 연결된 프리앰프를 켜서 시스템의 평형을 허용합니다.
    2. 오실로스코프를 켭니다.
    3. 실험용 뮤린 귀를 모방하기 위해 사운드 감쇠 칸막이 내부에 프리앰프에 연결된 마이크를 배치합니다.
    4. 시판되는 처리 및 수집 소프트웨어를 엽니다(재료 표참조).
    5. 소프트웨어 내에서 교정 Cal200K 파일을 선택하여 교정 구성 모드를 활성화하고 실험 조건에 따라 매개 변수를 선택합니다.
    6. 프로세서 시스템을 사용하여 교정 절차를 실행합니다. SPL 제한, 주파수 범위 및 배포측면에서 마이크와 라우드스피커의 기술 사양이 조화를 이루는지 확인합니다.
    7. 미리 정의된 클릭 자극 프로토콜을 선택하고 시작합니다.
    8. 한 번의 클릭으로 SPL(바람직하게는 최대 SPL)을 실행하여 오실로스코프의 온라인 Fast Fourier 변환(FFT)에 의해 분석된 바와 같이 사운드 자극의 스펙트럼이 요구 사항(실질적인 에너지 범위)과 일치하는지 확인합니다.
    9. 관심 범위 내에서 미리 정의된 톤 버스트 자극 프로토콜(예: 1-42kHz)을 선택하고 시작합니다.
    10. 오실로스코프 및 온라인 FFT를 사용하여 기록된 음향 테스트 자극의 주파수 스펙트럼을 확인합니다.
      참고: 자극 주파수와 SPL이 허용 가능한 작동 범위 내에 있음을 보장하기 위해 시스템 및 자극 주파수의 일일 교정이 필요합니다.
  2. 마취된 마우스를 음향 폼이 늘어선 사운드 감쇠 칸막이 안에 놓습니다.
    참고: 전체 칸막이는 외부 전기 간섭으로부터 ABR 기록을 보호하고 소음으로부터 보호하기 위해 패터데이 케이지(맞춤형 메쉬 금속 또는 상업용 케이지)로 덮여 있어야 합니다.
  3. 모계 뇌간을 불러일으킨 청각 전위 기록을 위해, 정점에 피네스테인리스 스틸 전극, 피네아의 축축(양극[+] 전극) 및 오른쪽 또는 왼쪽 피나(음극[-] 전극)의 벤자측을 삽입하십시오. 측정할 수 있습니다. 바이노럴 레코딩의 경우 음극을 오른쪽 과 왼쪽 피네에 배치합니다. 접지 전극을 동물의 엉덩이에 놓습니다(추가그림1).
    1. 삽입 에 앞서, 스테인리스 스틸 전극의 끝에 후크 형상을 형성하여 전극의 피하 고정이 보장되도록47.
  4. 각 기록 전에 모든 전극의 임피던스 측정을 수행하여 적절한 전극 위치/전도도를 확인합니다. 4채널 헤드스테이지의 임피던스 체크 버튼을 사용하여 각 전극 임피던스 레벨을 확인합니다.
    참고: 임피던스는 5kΩ 미만이어야 합니다.
  5. 단일 라우드 스피커(예: 1-65kHz)를 사용하여 자유 필드 조건에서 ADR을 기록하면 동물의 로스트럼(마우스의 축에 수직인 라우드스피커의 선행 가장자리)에 10cm 반대에 배치합니다. 보정 중에 라우드스피커와 마이크 사이의 특정 거리에 따라 마우스 헤드/마우스 귀의 위치가 교정 마이크의 위치인지 확인합니다.
    참고: 자유 필드 조건 대신 이어 튜브를 사용할 수도 있습니다. 그러나 이러한 설정에서 SPL을 확인하려면 특별한 예방 조치와 테스트가 필요합니다.
  6. 자체 프로그래밍 또는 상용 소프트웨어를 사용하여 클릭 및 톤 버스트에 대한 자극 프로토콜을 프로그래밍합니다(재료 표참조). 아래에 나열된 개별 자극 매개변수는 관련 그래픽 사용자 인터페이스에 추가해야 합니다.
    1. 클릭 자극 엔티티의 구성으로 시작(즉, 100μs 지속 시간 자극과 교대로 극성[응축과 희소성 사이 전환] 및 정의된 실질적인 에너지로 시작) 이 자극 엔티티를 사용하여 클릭 임계값, 왼쪽 및 오른쪽 귀의 ABR 대칭, ABR W(I- IV) 진폭 및 W(I -IV) 대기 시간을 나중에 분석하고 결정합니다.
    2. 소프트웨어를 시작하고 구성 창을 사용하여 클릭 자극 매개 변수를 추가합니다. 실행을 클릭하여 프로토콜을 실행합니다.
    3. 한엔엔벨로프상승 및 하강시간 각각 1.5ms(게이트/램프 시간 지속시간)로 극성을 번갈아 가며 4.5ms 톤 버스트(과도 시누오이드 펄스)인 두 번째 자극 엔티티의 구성을 계속한다. 특히 저주파 톤 버스트의 경우 최소 톤 버스트 지속 시간이 3ms입니다. 이 자극을 사용하여 모든 유전자형에서 주파수별 청력 임계값을 분석하고 식별합니다.
    4. 4.6.2 단계와 마찬가지로 구성 창을 사용하여 톤 버스트 자극 파라미터를 추가하고 실행을 클릭하여 프로토콜을 실행합니다(제조업체48에서설명한 대로).
    5. 톤 버스트 스터디의 경우 과학적 질문(예: 6kHz 스텝에서 1-42kHz)에 따라 테스트할 적절한 주파수 범위를 프로그래밍합니다. 적용할 주파수 범위가 라우드스피커의 기술적 기능을 충족하는지 확인합니다(이 경우 자유 또는 폐쇄필드 조건에서 는 주파수 대역폭이 1-65kHz인 다중필드 자기 스피커).
    6. 평균화의 경우 순차음향 자극(클릭 또는 톤 버스트)의 수를 20Hz 속도로 300배로 설정합니다.
    7. 클릭시 5dB 단계, 톤 버스트에 대한 10dB 단계로 SPL을 0dB에서 90dB(SPL 모드 증가)까지 늘립니다.
      참고: SPL 모드의 증가 및 감소는 모두 문헌에 설명되어 있습니다. SPL 단계 크기는 과학적 질문으로 인해 조정될 수 있습니다.
  7. 개별 음향 자극 개시(pre-ABR 기준선) 이전에 5 ms 기준선 기간부터 시작하여 다른 10ms 기준선(post-ABR 기준선)에 의해 10 ms ABR 섹션을 초과하는 ABR 데이터 수집 기간을 25ms로 결정합니다(보충그림 1) ).
  8. 6극 버터워스 필터를 사용하여 ABR 데이터 수집(예: 24.4kHz) 및 밴드패스 필터(하이 패스: 300Hz, 로우 패스: 5kHz)에 적합한 샘플링 속도를 적용합니다. 필요한 경우 노치 필터를 활성화합니다.
    참고: 샘플링 속도 및 필터 특성은 실험 요구 사항으로 인해 조정될 수 있습니다.
  9. 피하 전극에서 기록된 생체 전기 신호를 헤드 스테이지로 전송하고 적절한 증폭을 가진 프리앰프(예: 20배)로 더 전진시보세요.
  10. 특정 ABR 시스템 처리 소프트웨어를 사용하여 라우드 스피커 제어 및 ABR 수집, 처리, 평균화 및 데이터 관리를 조정합니다.
  11. 약 45분 이내에 전체 ABR 프로토콜(클릭 및 톤 버스트 유발 청력 임계값, 피크 진폭 및 피크 대기 시간 분석 등)을 실행해 보십시오. 이것은 100/10 mg 케타민/자일라진을 복강 내로 사용하는 깊은 마약의 시간에 해당합니다.
  12. 동물을 마취하고 실제 녹음을 수행하기 전에 자극 프리젠 테이션 및 수집, 필터 설정 등에 대한 교정, 프로그래밍 / 조정이 예상대로 작동하는지 확인하십시오.

5. ABR 분석

  1. 클릭 및 톤 버스트 유발 ABR 청력 임계값 분석
    1. 시각적 검사/추정49,50,51,52에의한 ABR 임계값 결정의 잠재적불일치를 방지하기 위해 이전 발행물을 기반으로 자동화된 임계값 검색을 수행합니다.
    2. 신호 대 잡음 비(SNR): TW 1(0-5ms), TW 2(5-15ms) 및 TW3(15-25ms)(추가 그림1)을 계산하기 위해 세 개의 별개의 시간 창(TW)을 정의합니다.
    3. AEP가 관찰되지 않는 두 개의 별개의 TW(즉, TW1 및 TW3)내에서 기준선의 노이즈 표준 편차를 계산합니다. 이 계산은 자체 프로그래밍된 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다.
    4. TW1 및 TW 3의 풀드데이터 평균 및 표준 편차를 모두 설정하는 ABR레코드 내의 각 SPL 측정값에 대해 계산합니다.
    5. 모든 기록 샘플을 해당 계산된 평균으로 개별적으로 재설정하여 DC 오프셋을 제거합니다.
    6. 청력 임계값 결정의 경우, ABR 응답 시간 윈도우(TW2)에서 하나 이상의 파진폭값(WI-WIV)이이전에 계산된 표준 편차의 4배를 초과하는 최저 SPL(dB)을 식별한다.
      참고: 최대 SPL에서 클릭 및 주파수 임계값 분석을 위해 ABR 웨이브가 검출되지 않은 경우 100dB의 명목 임계값 수준이 귀에 할당됩니다.
  2. ABR 파진폭 및 파파 대기 시간 분석
    1. 연속 웨이블렛 변환(CWT) 기반의 기본 웨이블릿을 사용하여 양수(p) 파도(peaks)와 음의(n) 파도(p) 파도(p)의 시간적 순차적 배열을 결정하기 위해 멕시코 모자 웨이브렛을 사용하는 웨이블렛 기반 접근법을 실시합니다. 패턴 일치 알고리즘52 (추가그림1).
      1. 수학적으로 CWT는다음과같이 표시됩니다.
        figure-protocol-1
        여기서, s(t)는 신호이고, a는 스케일이고, b는 번역이고, θ(t)는 마더 웨이블렛이고, θa,b(t)는 스케일링 및 번역된 웨이블렛이고, C는 의 2D 매트릭스이다. 웨이블렛 계수.
    2. 처음에는 각 ABR 실행의 55dB 측정을 사용하여 CWT에 전달될 각 웨이브에 대한 최상의 스케일 파라미터를 식별하여 모든 n파에 대해 0.5-4, 모든 p파의 경우 0.5-6, WIV의 경우 0.5-12의 가장 넓은 세 가지 클래스로 생성됩니다. 샘플 내에서 웨이브.
      참고 : 55 dB SPL은 파도가 일반적으로 가장 눈에 띄며 안정적으로 감지 할 수 있기 때문에 선택되었습니다.
    3. 모든 55dB 측정 내에서 W I-WIV의 정확한 시간 적 위치를 안정적으로 감지하기 위해 모든 클래스를 증명하십시오.
    4. 55dB측정 내에서 정확한 시간 순서로 ABR W I-WIV를 결정하기 위해, p-피크와 n-피크(p-peaks)는 이전에 확인된 피크의 상대적 위치를 사용하여 고정 된 시퀀스로 식별되어 시간 창을 제한합니다. 후속 검사를 수행합니다.
    5. 9개의 피크가 모두 55dB로 식별되면 피크 1-9를 식별하기 전에 인접한 음압 측정(50dB 및 60dB)에 대한 시간 검색 프레임의 시작점으로 관련 값을 사용합니다.
    6. 이러한 방식으로 가능하면 모든 dB 수준(55-0 dB 및 60-90dB)의 p-및 n-피크를 결정합니다. p-및 n-peak가 더 이상 웨이블릿 해석에 의해 식별되지 되면, 그 시간적 배열은 이전 dB 수준에서 확인된 다른 피크에 피크의 시간 적 오프셋을 계산하여 설정된다.
    7. 현재 데시벨 수준 내의 다른 p-및 n-peak에 시간 간격띄우기를 피크에 적용하면 평균이 가장 가까운 근사치로 간주되는 정의되지 않은 피크에 대해 최대 8개의 결정된 시간적 위치가 생성됩니다.
    8. 모든 파도(W I-W IV)의 진폭성장 함수및 레이턴시 비교를 평가하기 위해, 관련 n-피크의 시간 프레임 내에서 각 p-피크의 최대 진폭 및 평균 대기 시간을 특성화한다.
    9. 이후에 자체 프로그래밍된 자동 웨이블릿 도구를 기반으로 모든 결과를 시각적으로 확인하고 필요한 경우 엄격한 포함/품질 기준을 충족하지 않는 경우 통계에서 개별 ABR 실행을 제외합니다.
      참고: AR의 자동 분석 및 육안 검사모두에서 이중 블라인드 접근 방식을 권장합니다.

6. 수술 후 치료 및 ABR 후 치료

  1. 동물을 지속적으로 모니터링하고 의식을 회복하고 흉골 의힘을 유지할 수 있습니다.
  2. ABR 기록을 받은 동물을 완전히 회복할 때까지 다른 동물회사에 반환하지 마십시오.
  3. 카프로펜을 주입 (마우스: 1x 5-10 mg/kg, 피하; 쥐: 1 x 2.5-5.0 mg/kg, 피하) 수술 후 통증 치료에 대 한.
    참고: ABR 기록 전극이 피하적으로 삽입되기 때문에 오래 지속되는 통증 치료가 필요하지 않습니다.
  4. 수술 후, 음식 섭취를 촉진하기 위해 축축한 펠릿을 공급하십시오. 음식 (~15 g/100 g의 체중/일; ~5 g/24 시간) 및 물 (~15 mL/100 g/일/ 체중; ~5 mL/24 h) 소비를 주의 깊게 관찰 하십시오.
  5. 동물의 정상적인 자세와 행동이 돌아오도록 동물을 면밀히 모니터링하십시오.
    참고 : enrofloxacin 또는 trimethoprim-설폰 아미드와 같은 항생제의 전신 투여는 피하 전극 배치가 최소한의 침략이기 때문에 여기에서 권장되지 않습니다. 국소 또는 일반화 된 염증의 징후가 발생하지 않는 한 항생제의 적용을 제한해야합니다.
  6. 동물의 체중을 조절하여 ABR 기록 후 후속 실험 후 회복.

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Results

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클릭 및 톤 버스트 유발 ABR 레코딩을 사용하여 청력 임계값 차이, 진폭 증가 함수 및 대기 시간 비교를 평가할 수 있습니다. SPL 증가 모드에서 클릭 유발 AV는 Cav3.2 T 형 전압 게이트 Ca2 + 채널 (즉, Cav3.2+/- 및 Ca)에 대한 부족한 컨트롤과 두 가지 예시돌연변이 마우스 라인에 대한 그림 1에 설명되어 있습니다. v3.2 null 돌연변이 [Cav3.2-/-]). 전술한 바와 같이, 성별별 조사는 일반적으로 인간54,55 및 마우스56,57에서...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 마우스에서 청각 유발 뇌간 반응을 기록하는 방법에 대한 상세하고 통합적인 설명을 제공합니다. 그것은 동물 전처리에 특정 초점을 두고, 마 취, 그리고 잠재적인 방법론 혼란 요인. 후자는 포함, 다른 사람의 사이에서, 성별, 마우스 라인, 나이, 및 주거 조건. 이러한 모든 요인은 감각신경성 난청및 청각 정보 처리의 근본적인 측면에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 따라서, 청각 프로파일링 연구의 적절한 계층화는 필수적입니다.

AEP 레코딩의 계측은 지난 50-60년 동안 엄청나게 발전해 왔으며, 요즘에는 이 기술의 적용을 향상시키고 단순화한 상용 ABR 레코딩 시스템을 사용할 수 있지만 새로운 함정이 도입되었습니다. 이러한 측면 중 일부는 여기에 설명되어 있습니다. 첫째, 사용자는 ABR 시스템, 즉 데스크탑 또는 랩톱 컴퓨터, 프리앰프, 앰프, 전극 입력 상자 및 잠재적 트랜스듀서(예: 라우드스피커, 인서트 이어폰, 수프라-청각)로 구성된 계측에 익숙...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 크리스티나 콜브 박사 (신경 퇴행성 질환에 대한 독일 센터 [DZNE]) 박사 로버트 스타크 (DZNE) 동물 사육 및 동물 건강 관리에 도움을 감사드립니다. 이 작품은 재정적으로 마약 및 의료 장치에 대한 연방 연구소에 의해 지원되었다 (Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM, 본, 독일).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RZ6 용 AEP / OAE 소프트웨어 (BioSigRZ 소프트웨어)Tucker-Davis Technologies (TDT)BioSigRZ
쌍안 외과 확대 현미경Zeiss Stemi 20000000001003877, 435540000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000
케이지 (Macrolon)Techniplast1264C, 1290D
Carprox vet, 50mg / mlVirbac Tierarzneimittel GmbHPZN 11149509
냉광원Schott KL2500 LCD9.705 202
코튼 팁 애플리케이터(멸균)Carl RothEH12.1
맞춤형 메쉬 금속 패러데이 케이지(스테인리스 스틸, 2mm 두께, 1cm 메쉬 크기)맞춤형
맞춤형 5% 덱스판테놀(Bepanthen 눈과 코 크림)바이엘 Vital GmbHPZN: 01578681
일회용 피하 스테인리스강 바늘
전극, 27GA, 12mm		Rochester Electro-Medical, Inc.S03366-18
수술용 드레이프 시트(멸균)HartmannPZN 0366787
에탄올, 70%Carl Roth9065.5
1/4'' 자유 필드 측정 교정 마이크 키트Tucker-Davis Technologies (TDT)PCB-378C0
장갑(멸균)Unigloves1570
Graefe 집게 곡선, 톱니 모양의FST11052-10
GraphPad Prism 6 소프트웨어, V6.07GraphPad Prism Software, Inc.https://www.graphpad.com/
열 기반 수술 기구 살균기FST18000-50
Homeothermic
가열 블랭크		ThermoLux461265 / -67
Ketanest S (케타민), 25mg/mlPfizerPZN 08707288
Ringer' s 솔루션(멸균)B.BraunPZN 01471434
Matlab 소프트웨어MathWorks, Inc.
메두사 4채널 저음. 헤드스테이지Tucker-Davis Technologies(TDT)RA4LI
Medusa 4채널 프리앰프/디지타이저Tucker-Davis Technologies(TDT)RA4PA
마이크PCB Pieztronics378C01
멀티 필드 스피커-스테레오Tucker-Davis Technologies(TDT)MF1-S
오실로스코프TektronixDPO3012
Optibit 인터페이스용 광학 PC1 익스프레스 카드)Tucker-Davis 시스템(TDT)PO5e
Askina Braucel 패드(셀룰로오스 흡수 패드)B.BraunPZN 8473637
프리앰프PCB Pieztronics480C02
RZ6 다중 I/O 프로세서 시스템(BioSigRZ)Tucker-Davis Technologies(TDT)RZ6-A-PI
0.9% 식염수(NaCl, 멸균)B. BraunPZN : 8609255
SigGenRZ 소프트웨어Tucker-Davis Technologies (TDT)https://www.tdt.com/
Software R (버전 3.2.1) + Reshape 2 (버전 1.4.1) + ggplot 2 (버전 1.0.1) + Datatable (버전 1.9.4), + gdata (버전 2.13.3), + Pastecs (버전 1.3.18), + Waveslim (버전 1.7.5), + MassSpecWavelet (버전 1.30.0)The R Foundation, R Core Team 2015오픈 소스 소프트웨어 (무료 배포 가능)
소음 감쇠 큐비클Med Associates Inc.ENV-018V
표준 패턴 집게, 길이 12cm 및 14.5cmFST11000-12, 11000-14
Leukosilk 테이프BSN medical GmbH & Co. KGPZN 00397109
조직 집게- 1x2 치아 12cmFST11021-12
Uniprotect 환기 캐비닛BioscapeTHF3378
환기 캐비닛Tecniplast9AV125P
자일라진(Rompun), 2%바이엘 바이탈 GmbHPZN 1320422
https://de.mathworks.com/products/matlab.html

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