Bemisia tabaci Cytogenetic 기술을 사용 하 여 계란 수정 속도 결정

요약

우리 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 수정 속도 결정 하 고 Bemisia tabacihaplodiploid 침입 해충의 기본 성 비율을 사용 하 여 간단한 cytogenetic 기법 제시.

초록

몇 종의 수액 빠는 whiteflies 그들은 입혀 작물 손상 및 식물 바이러스 벡터 그들이 전세계 가장 파괴적인 지상파 해충 있습니다. 서로 다른 환경에서 이러한 종의 생물학의 수많은 연구에도 불구 하 고 주요 생활 역사 매개 변수, 자손 성 비율, 작은 관심을 받고 있다, 아직 예측 인구 역학에 대 한 중요 한. Bemisia tabaci 의 기본 성 비율 (산란에서 성 비율) 적 보고 하지만이 haplodiploid 곤충의 달걀 수정 속도 결정 하 여 찾을 수 있습니다. 기술은 포함 표 백제, 일련의 고정 단계와 일반적인 DNA 형광 얼룩, DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole, DNA 바인딩 형광 염료), 여성 및 남성 pronuclei에 바인딩할 응용 프로그램 계란의 dechorionation. 여기, 우리 기술, 그리고 여부는 endosymbiotic 박테리아, 리케차 sp. nr 테스트 하는 응용 프로그램의 예 제시. bellii, B. tabaci의 기본 성 비율에 영향을 받습니다. 이 방법은 whiteflies의 인구 연구 또는 섹스 할당 특정 환경 자극으로 존재 하는 경우 결정 하는 데 도움이 수 있습니다.

서론

섹스 할당의 연구 또는 남성과 여성의 자손에 상대적인 투자 행동 생태학^1,2,3의 초석입니다. 뿐만 아니라 그것의 행동의 적응 모델을 테스트 하기 위해 기체의 섹스 할당 전략을 알고 하는 것은 그것의 인구 역동성의 모델 높일 수 있습니다. 많은 종에서 섹스 할당 어머니에 의해 제어 됩니다. 섹스 할당을 확인 하려면 그것은 계란 증 착의 시간에 주 성 비율 또는 암컷의 비율을 결정 하는 것이 중요. 성인 출현에 섹스 률 섹스 할당에 단서를 제공할 수 있습니다, 하지만 남성과 여성 청소년 사이의 차동 발달 사망률 수 있습니다 일반적으로 왜곡 성인 섹스 률 크게. Hymenoptera, 포함 개미, 꿀벌, 말 벌, 곤충의 순서의 일부 수 종에 1 차 섹스 률 cytogenetic 분석 실험, 유전자 DNA를 보려면 배아 얼룩으로 결정 되었습니다. Hymenopterans haplodiploid 이기 때문에, 초기 남성 계란 단일 이며 초기 여성 계란 2 중이 고 둘 다 남성과 여성 pronuclei (2n)를 포함 하는 동안만 여성 pronucleus (n)를 포함 합니다. Aleyrodidae, true 버그 (Hemiptera) whiteflies로 알려진의 sap 먹이 가족 haplodiploid도 있지만, 거기 되지 않았습니다 이러한 곤충에 주 성 비율을 찾을 수 설립된 분석 결과. 이것은 아마도 놀라운 주어진이 가족에 몇 가지 국제적인 심각한 해충의 연구와 whiteflies^{4,,56,7의 경쟁적인 상호 작용에서 섹스 비율의 중요성의 강도 ,8,,910} 인구 역학에 일반적으로. Haplodiploid 곤충에도, 섹스 비율 섹스 결정 시스템, 선택적 수정 및 환경²와 다 정한 섹스 비율의 가능성을 수 있도록 두지 않도록 됩니다. 여기에 우리가 whiteflies sweetpotato whitefly로 알려진 종 복합 기본 섹스 비율을 결정 하는 기법을 제시 B. tabaci. 이 한 종 이상 28 종 전세계¹¹를 포함 이름과 파괴적인 글로벌 침입 해충^12,13의 일부를 포함 합니다. B. tabaci 및 다른 Aleyrodidae 섹스 할당 패턴을 결정 하기 위해이 기술의 응용 프로그램 변수, 온도, 기 주 식물, endosymbiotic 박테리아, 또는 식물/whitefly 포함의 더 엄격한 조사를 허용할 것 이다 병원 체, whitefly 기본 섹스 비율 및 whitefly 인구 역학에 영향을 미칠 수 있습니다.

우리는 어떤 유사한 계란 얼룩 기법 B. tabaci에 대 한 인식입니다. 프로토콜은 하룻밤 정착 단계를 생략 하 고, 따라서 3 h 이내 완료 될 수 있다 다른 곤충 계란¹⁴ 사용 되는 착 색 방법에 비해 편리 합니다. 으로 응용 프로그램, endosymbiotic 박테리아, 리케차 sp. nr의 한 예입니다. bellii, B. tabaci 중동 아시아 부 1 (MEAM1)^15,16의 우리의 실험실 라인에 여성 바이어스와 연결 됩니다. 우리가 테스트 한 B. tabaci MEAM1 실험실 줄 ("MAC1," Maricopa 농업 센터에서 수집), 여부 리케차-감염된 (R⁺) 여성 감염된 (R^-) 여성 보다 더 많은 계란을 기름 지 게.

프로토콜

참고: 통풍이 잘되는 지역에서 나는 연기 후드 실 온에서 모든 작업 수행 됩니다 확인 합니다. 이 프로토콜에서 모든 '방울' 운영자의 취향에 따라 5-20 µ L로 정의 됩니다.

1. 초기 설정

1. 깨끗 한 잎에 oviposit를 여성 whiteflies를 허용 합니다. 산란 경기장에 대 한 예로 클립 감 금 소 또는 잎에 한 천 배양 접시에서 잘라 있습니다. 클립 케이지 또는 삽입 및 제거는 성인 배양 접시 덮개에 coverable 구멍을 확인 합니다. 또는, 신속 하 게 수집 된 성인 배 얼음에 넣고, 다음, 잎에 그들을 입금. 계란에 아버지 pronucleus 정자 전환의 관찰을 위해 산란 및 계란 고정 더 이상 60 분 사이의 시간을 제한 합니다.
   참고: 계란 잎에서 제거 되지 않습니다 성인 섹스 비율을 기록 하는 성인을 기르는 수 있습니다.
2. 전 또는 whitefly 산란 중, 잘, 그리고 다음 파라핀 필름 조각의 한쪽 끝, 파라핀 필름 표면 휴식 하지 않습니다 확인 하 고 (그림 1)을 통해 스트레칭 비누와 물, 건조 그것을 청소 하 여 현미경 슬라이드 준비.
   참고: 파라핀 영화 소수는 고 세미 불투명, 삭제 하 고 더 쉽게 볼 수 계란 액체 형태를 허용.

2입니다. Dechorionation

1. 유리 파스퇴르와 함께 플라스틱, 파라핀 영화 표 백제 솔루션 (0.83% 염소)의 방울을 추가 합니다.
   참고: 그것은 경우에 각 드롭에 2-3 달걀은 달걀의 추적을 쉽게입니다. 또는, 큰 계란의 수를 관리 하기 위해 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1 방울에 계란을 수집 합니다.
   주의: 표 백제가 부식; 처리 표 백제 및 흡입 하지 할 때 장갑을 착용 한다.
2. 잎에서 성인 whiteflies를 제거 합니다.
3. 계란을 명확 하 게 볼을 단독으로 달걀을 수집 현미경 그리고 신중 하 게 얇은 프로브 잎을 놓습니다. 탐사선을 45 ° 또는 녹은 피 펫 팁 (그림 2)으로 편안한 작업 각도에서 분 nadel 핀을 삽입 합니다.
4. 표 백제 또는 1 x PBS 계란을 전송 합니다. 1 x PBS를 사용 하 여 1 x 유리 파스퇴르와 함께 PBS 한 번 계란 수집 하 고, 다음, 계란에 표 백제를 추가 모든 플라스틱을 제거 합니다.
   참고: 계란을 수집 하는 때 천천히는 pedicel 잎에서 제거 될 때까지 그것의 기초에서 계란을 들어올립니다. pedicel 스티커, 그리고 표 백제에 담근는 때까지 계란 일반적으로 프로브 팁에 충실 합니다.
   참고: 모든 시 약에 대 한 별도 유리 파스퇴르 펫을 사용 하는 것이 좋습니다 하 고는 펫 팁 좁은 고 실수로 whitefly 계란 발음의 위험을 줄이기 위해 열을 수정할 수 있습니다. 잔여물 및 오염 방지, 모든 사용 후 이온된 수와 펫을 청소.
5. 10 분을 기다립니다. 계란 1 시간 보다 오래 된 embryogenesis에 관심 있다면, 최대 15 분 동안 표 백제에 계란을 둡니다.
   참고: 계란을 1 시간까지 10 분은 충분 합니다.

3입니다. 고정

참고: 이 단계는 Hymenopteran 프로토콜¹⁷에서 가져옵니다.

1. 유리 파스퇴르 피 펫 (chorion 파편을 포함 하는) 표 백제를 제거 하 고 그것을 폐기. 유리 파스퇴르와 빙 초 산의 방울 플라스틱 기다려 3 분 추가 합니다.
   주의: 증기 두건 아래이 단계를 진행 합니다. 빙하 아세트산은 부식; 착용 장갑 때 빙 초 산을 처리 하 고, 잔여 표 백제와 함께에 특히 흡입 하지 마십시오.
2. 유리 피 펫 파스퇴르와 빙 초 산을 제거 하 고 클라크의 솔루션의 방울을 추가 (3: 1의 절대 에탄올: 빙 초 산) 플라스틱 유리 파스퇴르. 대기 솔루션의 대부분은 증발 때까지 (또는 10 분 최대).
3. 유리 파스퇴르 피 펫 및 대기는 에탄올의 대부분은 증발 때까지 (또는 10 분 최대) 계란을 70% 에탄올의 방울을 추가 합니다.

4. 얼룩

1. 유리 피 펫 파스퇴르와 모든 잔여 에탄올을 제거 하 고 유리 파스퇴르 피 펫 7.0에 가까운 pH를 계란에 1 x PBS의 방울을 추가. 건조, 예를 들어 (그림 3) 내부는 젖은 종이 타월로 빈 피 펫 팁 상자에서 방지 하기 위해 습도 챔버에 현미경 슬라이드를 설정 합니다. 적어도 30 분을 기다립니다.
   참고: 이것은 최고의 포인트 일시 필요한 경우로 습기 건조를 방지할 수 있습니다.
2. 유리 파스퇴르 피 펫, 1 x PBS를 제거 하 고 0.1 μ g/mL DAPI, DNA 형광 얼룩의 방울을 추가, 플라스틱 유리 파스퇴르. 어둠의 습도 챔버에 현미경 슬라이드를 설정 하 고 15 분 이상 기다립니다.
   주의: DAPI 자극, 그래서 장갑 처리.

5입니다. 세척

1. 유리 피 펫 파스퇴르 DAPI를 제거 합니다.
2. 1 방울을 추가 x TBST (5 배 솔루션 트리 스의 30 g, NaCl의 43.8 g, 폴 20의 5 mL 및 1.0 g 앤₃ [pH 7.5]의 만든 및 PCR 학년 물 1 L에 가져온) 플라스틱 유리 파스퇴르와 함께 계란. 1을 제거 하기 전에 5 분 기다립니다 유리 파스퇴르 피 펫 x TBST. 2 번이이 단계를 반복 합니다.

6입니다. 장착

1. 최종 세척 후 신중 하 게 현미경 슬라이드의 깨끗 한 부분에 파라핀 영화에서 모든 계란 플라스틱. 초과 1 제거 x TBST; 그런 다음 미디어를 장착의 20 µ L를 추가 (80% 글리세롤과 20 %1 2 %n-틸-gallate와 x TBST) 계란 위에 깨끗 한 커버 슬라이드를 놓습니다.
2. 장기 저장을 위한 투명 매니큐어와 커버 슬라이드를 봉인, 다음, 2 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장 하거나 즉시 형광 현미경 아래 그것을 볼 합니다.

결과

리케차 B. tabaci MEAM1 여성에 대 한 수정 속도 영향을 미치는 여부를 테스트 하려면 우리 reared 리케차-감염 (R⁺) 또는 (R^-)를 감염 되지 않은 B. tabaci 에서 cowpea 식물 (Vigna unguiculata)에 27 ° C, 상대 습도 70%, 그리고 빛/8 h 16 h 어두운 photoperiod 케이지를 분리 합니다. R⁺ 및 R^- 4 탈피 whiteflies 신중 하 게 잎에서 제거 하 고 200 µ L 스트립 튜브에서 고립 되었다. 성인 등장, 그들은 50% 여성의 그룹에 수집 하 고 접시에 깨끗 한 잎을 전송 (n = ~50-100/leaf) 짝짓기의 4 일 동안. 약 20 명의 여성 및 여러 남성 그룹 다음 35 mm 접시 1 %agar 휴식에 (R

토론

이 프로토콜 수정 속도 또는 B. tabaci의 1 차 섹스 률을 캡처 처음 이다. 이 프로토콜의 도전은 그것 whitefly 계란을 신속 하 게 처리 하는 방법은 연구자 1 h는 고정 될 때까지 계란 oviposited 했다 이후 통과 했다 보다 더 보장 요구 이다. 예비 실험, 동안 3 h 또는 더 postoviposition에서 수정 된 계란 너무 오래 수정, syngamy 발생 했다 고 mitotic 사단 진행 했다 관찰 했다. 1 ~ 3 h, 사이 pronuclei 라운드 모양에 했다. 두 핵의 초기 존재 이면 수정 된 계란, 조금 나중에, syngamycan에 대 한 준비에 두 핵의 apposition 표시 한 핵, 그리고 나중에 다시, 첫번째 mitotic 사단의 두 제품 모두 남성과 여성의 계란에서 찾을 수 있습니다. 따라서, 남녀 간의 구별이 분명이 나중 시간 지점에서 그리고 산란에서 보수적인 측정으로 1 시간에 고정 간격을 제한 하는 것이 좋습니다. 또한 각 전송 액체의 계란과 부드러운 될 실수...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1x PBS	Any
1x TBST	30g		Tris, 43.8g NaCl, 5mL Tween-20 및 1.0g NaN3 pH 7.5로 만든 5x 용액 PCR 등급 물로 1L로 가져옴
Bleach	Clorox		모든 가정용 표백제는 0.83%로 희석할 수 있는 한 작동합니다. 차아염소산나트륨
투명 매니큐어	모든
DAPI dilactate	Santa Cruz Biotechnology	sc300415
에탄올			70% EtOH로 희석
광 현미경	Nikon		Nikon Eclipse 50i가 이 실험에 사용되었지만 340/380nm 여기 필터와 최소 4-10배 배율이 있는 모든 형광 현미경을 사용할 수 있습니다
아세트산	Mallinckrodt	UN2789
글리세롤	모든
현미경	Wild		이 실험에는 Wild M5A 현미경이 사용되었지만 작업자가 흰 파리 알을 명확하게 볼 수 있는 모든 현미경을 사용할 수 있습니다
현미경 슬라이드 커버	모든		방법은 18mm x 18mm 크기의 슬라이드 커버입니다. 더 큰 슬라이드 커버를 위해 더 많은 장착 매체를 추가해야 합니다.
현미경 슬라이드	Any
Minuten nadel pins	BioQuip	1208SA	Minuten nadel pin은 피펫 팁이 있는 프로브로 만들기 위한 선택 사항입니다
NaCl	Any
NaN3	Any
n-propyl-gallate	Sigma/Santa Cruz Biotechnology	P3130/sc-250794
Parafilm	Bemis
파스퇴르 피	Fisher Scientific	13-678-20A	Fisherbrand 일회용 붕규산 유리 파스퇴르 피펫 5.75 in. 작업자가 피펫을 늘리고 좁히고 싶은 경우 분젠 버너가 필요할 수도 있습니다.
PCR 등급 물	모든
피펫 팁	모든		피펫 팁은 미세한 나델 핀이 있는 프로브로 만들기 위해 선택 사항입니다.
작은 스포이드 전구	파		스퇴르 피펫
트리스에	모든
Tween-20	Any