반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

Summary

우리는 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 절차를 제시. 포함 하는 두 개의 다른 hydrogels 입방 장치 다 방향 영상 조직 패턴 형성에 대 한 달성 하기 위해 채택 된다.

Abstract

생체 외에서 3D 문화의 중요성은 세포/조직 문화에 상당히 강조 했다. 그러나, 실험적인 반복성의 부족의 제한 중 하나입니다. 패턴 형성의 몇 반복 결과 악화 자기 조직 기본 메커니즘의 분석. 셀 밀도 등은 세포 외 기질 (ECM)에 배포 초기 문화 조건에 변화를 줄이는 것은 3D 문화의 반복성을 향상 시키기 위해 중요 한. 이 문서에서는 높은 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 간단 하지만 강력한 절차를 설명 합니다. 원하는 모양으로 micromold 사진 평판 또는 머시닝 프로세스를 사용 하 여 조립 되었다 그리고 그것은 하이브리드 젤 큐브 (HGC)에 포함 된 ECM에서 3D 포켓을 형성. 셀 클러스터 모양이 조작된 형 모양으로 일치 되도록 농축된 셀 했다 다음 주머니에 주입 됩니다. 고용된 HGC 허용 다 방향 회전, 저 배율 렌즈를 사용 하더라도 고해상도 이미징 및 전체 조직 구조의 캡처를 사용 하도록 설정 하 여 검색. 정상적인 인간의 기관지 상피 세포는 방법론을 설명 하기 위해 사용 되었다.

Introduction

2D 문화 보다 더 나은 생물 환경 모방, 3D 문화의 중요성은 세포/조직 문화^1,2,3에 상당히 강조 했다. 세포와 세포 외 기질 (ECM) 간의 상호 작용 morphogenesis^4,5에 관한 중요 한 단서를 제공합니다. 많은 조직 형성 접는 과정^6,7, invagination⁸, 관 형성^9,10등 3D 환경 아래 에서만 나타날 수 있습니다. 그러나, 수많은 어려움 2D 실험에서 3D 실험 접시에 이동에서 연구원을 방지 합니다. 3D 실험에 큰 어려움 중 하나는 이미징 3D 샘플 문제입니다. 평면 실험에 비해, 적절 한 3D 이미지의 수집 아직도 많은 경우에 도전 이다. 특히, 적절 한 3D 이미지를 얻는 때 어려운 작업 샘플 크기 때문에 낮은 확대 렌즈의 큰 초점 깊이....

Protocol

1입니다. 하이브리드 젤 큐브 장치 제조

1. 폴 리카 보 네이트 (PC) 큐빅 프레임 가공 공정 또는 3D 프린터를 사용 하 여 준비 합니다. PC 프레임의 크기는 샘플의 크기에 따라 달라 집니다. 이 연구에서 우리가 사용 5mm의 프레임 양쪽에 분기 했다 경작 하는 동안 길게 하기에 충분 한 공간.
2. 사전 냉각된 유리 슬라이드 또는 얼음 상자에 다른 부드러운 표면에 PC 프레임을 배치 (< 0 ° C) (그림 1A).
3. 피 펫과 아래쪽 표면에 큐빅 프레임의 상단 면에서 미리가 열된 1.5 %agarose (w/v)의 12 µ L를 추가 합니다. 평평한 표면 (그림 1B)를 만드는 데는 agarose 확산을 피펫으로 뇌졸중.
4. 분 내는 agarose 완 치 될 것입니다. 핀셋을 사용 하 여 유리 슬라이드의 가장자리에 그것을 밀어서 PC 프레임을 선택 합니다. 참고는 수직 유리 슬라이드에서 프레임을 따기는 agarose 및 유리 슬라이드 (그림 1C) 사이의 접착 력 때문에 입방 프레임에서 agarose의 분리에 발생할 수 있습니다.
5. 큐빅 프레임, 오픈 얼....

Results

정상적인 인간의 기관지 상피 (NHBE) 셀 그림된 방법론을 설명 하 고 실린더 모양 및 ECM 환경에서 각각 프리즘 모양 초기 집단 셀 형상을 제어 하 사용 되었다. 단계 대조로 phalloidin 실린더 모양 (그림 4AB)와 (그림 4CD) 프리즘 모양의 얼룩 다 방향 이미징 결과 표시 됩니다. 셀은 ECM 환경에서 원하는 3D 형태를 적절 하 게 정렬 됩니다. 그 후, 세포는 4 일 특정 모양에 대 한 교양 되었고 다 방향 영상에 의해 분석 되었다. 큰 샘플 크기 어려운 꽤 한 방향;에서 전체 조직 이미지 그러나, HGC는 전체 조직 모양을 드러내는 영상 최대 6 개의 측면에서 허용. 그림 5 는 NHBE 세포에서 개발 기관지 나무의 immuno.......

Discussion

이 문서에 소개 된 방법은 간단 하 고 높은-기술 장비 없이 수행할 수 있습니다. 동시에, 히드로의 3D 공간에서 정확한 셀 클러스터 모양을 제어 결과 얻을 수 있습니다. 초기 제어 후 셀 만큼 그들은 접시에 교양으로 HGC에서 성장할 수 있다. 다 방향 영상 HGC 어떤 현미경 시스템을 사용 하 여 함께 샘플을 회전 하 여 수행 되 고 크게 이미징 품질을 향상 시킵니다. HGC 프레임 및 micromold에 대 한 자료의 선택은 그들은 생체로 서 유연한입니다. 3D 프린터의 정확도 그들의 응용 프로그램에 대 한 충분 한 경우 HGC 프레임 또는 micromold를 생산 하는 3 차원 프린터를 사용할 수 있습니다. 제안된 된 방법 투명도 약^20,21 및 빛 시트 현미경 시스템 등의 기술을 강화 하는 많은 이미지와 호환 됩니다. 이러한 기술을 채용 하 여 이미지 품질을 개선할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12웰 플레이트	Corning  Inc.	3513
2-메톡시-1-메틸에틸 아세테이	후지필름 Wako Pure Chemical Co.	130-10505	PGMEA, CAS: 108-65-6
파라포름알데히드 4%	후지필름: Wako Pure Chemical Co.	161-20141	CAS: 30525-89-4
아가로스, 저겔화 온도  생물 시약	시그마-알드리치	A9414
알렉사 플루어 488 팔로이딘	써모 피셔 사이언티픽	A12379
AZ1512	머크
BEGM 총알 키트	Lonza	CC-3170	NHBE 세포 용 특수 배지
소 혈청 알부민 용액 (10 %)	시그마 알드리치	A1595
EGM-2 총알 키트	Lonza	CC-3162	내피 세포 전문 배지
Lipidure	NOF co.		MPC 폴리머
Matrigel 성장 인자 감소 기저막 매트릭스	Corning  Inc.	354230
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50197Z
Normal human bronchial epithelial cells	Lonza	CC-2541
SILPOT 184 W/C	Dow Corning Co.		3255981 PDMS용 염기 수지 및 촉매
SUEX D300		DJ MicroLaminates, Inc	두꺼운 네거티브 포토레지스트(두께: 300mm)
Triton X-100(1%)	Thermo Fisher Scientific	HFH10
Trypsin-EDTA(0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416