여기에 우리가 현재에 cellulo BBB (혈액 뇌 장벽)의 설정을 설명 하는 프로토콜-Minibrain 폴리에스터 다공성 막 문화 인간의 BBB에 걸쳐 생체 또는 전염 성 요원의 전송 평가 시스템 삽입 및 그들의 이웃 뇌 세포에 생리 적 영향입니다.
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방법 논문
병원 체 또는 의약품 및 두뇌와 그들의 상호 작용에 의해 장벽 횡단 연구를 인간의 혈액-뇌 인터페이스 모델
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
초기에 관련 신 경계 의약품의 심사와 그들의 침투와 장벽와 뇌 실질의 상호 작용에 대 한 cellulo BBB 모델에서 신뢰할 수 있는 여전히 충족된 필요. 이 간격을 채우기 위해 우리는 폴 리 에스테 트라이-인간의 뇌 세포 (뉴런, 이다 microglial 세포)의 문화에 의해 형성 된 다공성 멤브레인 문화 삽입 인간의 BBB 모델은 Minibrain와 결합 하 여 BBB-Minibrain, cellulo 모델에서 2D 설계 되었습니다. BBB-Minibrain BBB, 뉴런에이 분자의 특정 대상으로 확인 하 고 약물의 신경 보호 속성 후 보존 되었다 표시를 통해 신경 보호 약물 후보 (예: Neurovita), 전송 테스트를 허용 약 BBB를 교차 했다. 우리 또한 그 BBB-Minibrain 내 피 세포 장벽을 가로질러 바이러스 입자의 흐름을 감지 하 고 neuroinvasive 바이러스 입자는 Minibrain의 감염을 모니터링 하는 재미 있는 모델을 구성 하는 설명 했다. BBB-Minibrain은 신뢰할 수 있는 시스템, 쉽게 치료 또는 모욕 후 연구원 셀 문화 기술에서 훈련 및 뇌 세포 고기의 예측에 대 한 처리. Cellulo 테스트 등의 관심은 두 가지 것: 소개 하는 한편 약물 개발의 초기 단계를 derisking 하 고 다른 한편으로 테스트 하는 동물의 사용을 줄이고.
서론
두뇌는 뇌 실질과 혈액-뇌 장벽 (BBB) 이라는 혈액의 교류를 제한 하는 비 투과성 구조에 의해 조직의 순환에서 분리 된다. 주로 대뇌 내 피 세포의 구성, BBB는 동적 이다, 혈관 주위 microglia 및 이웃 뇌 실질의 신경 상호 작용 합니다. BBB의 세 가지 주요 기능은 생성 및 유지 관리의 영양소와 독성 부상 방지와 뇌의 공급 또는 병원 체1,2에 공헌 하는 신경 기능에 대 한 이온 항상성 뇌 항상성 및 그 기능3의 유지 보수. 이 그래서 몇 가지 약물만 BBB4,5교차 수 있습니다 효율적입니다. 현재, 분자 BBB 통과 되며 뇌에 확산 여부를 예측 하기 위해 사용할 수 있는 방법을 ex vivo 연구 부검 소재, 이미지 추적 MRI (자기 공명 영상) 또는 애완 동물 (위치 방출에 의해 인간의 자원 봉사자의 두뇌에서에 구성 단층 촬영) 또는 pharmacodynamics와 동물6,,7
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프로토콜
1. 세포의 Ntera/CL2 문화 작품. D1 포스트 mitotic hNeurons 및 hAstrocytes (NT2-없음)의 공동 문화를 준비 하
참고: 이것은 Minibrain (그림 1)의 구성 요소입니다.
- Ntera/Cl2.D1을 배양
- 액체 질소 탱크에서 냉동된 셀의 유리병을 제거 합니다. 얼음에 계속.
- 37 ° C 물 욕조에 빠르게 셀 동
- 완전 한 DMEM F12 매체의 10 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 세포를 전송 (Dulbecco의 수정이 글 매체: 영양소 혼합 F-12 매체) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2 mM 글루타민, 100 IU 페니실린와 100 µ g 스 보충 (즉, 완료 DMEM F12 매체)입니다.
- 실 온 (RT)에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심. 완전 한 DMEM F12 매체의 2 mL에 펠 릿 해리
- 민감한 부착 세포에 대 한 구체적인 치료와 폴리스 티 렌에서 T75 조직 배양 플라스 크에 전송 (T75Cell+) 포함 하는 완전 한 DMEM F12 매체의 13 mL.
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결과
BBB-Minibrain에서 cellulo 실험은 혈액-뇌 인터페이스의 모델.
BBB-Minibrain는 상위 레벨에 혈액 구획 및 혈액-뇌 인터페이스 (그림 2AB)의 낮은 수준에 두뇌 구획을 모방 하기 위해 폴 리 에스테 르 막 문화 삽입 시스템에 설정 됩니다. BBB 형성 필터에 hCMEC/D3 내 피 세포와 luminal 구획 및 뇌 세포 (뉴런, 이다 microglial 세포)의 Minibrain 인간의 트라이 문화를 포함 하는 abluminal 구획 그것에 의하여 이루어져 있다. Minibrain 셀 클래식 트라이 문화 인구 표현 형 (그림 1, 하단 오른쪽 패널)과 급행 특정 셀 다 코.......
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토론
이 문서에서 우리는 cellulo을 구축 하는 방법을 시연 혈액/뇌 인터페이스, BBB-Minibrain, BBB 모델과의 문화를 결합 하 여 하나의 키트로 뇌 세포 (Minibrain) 뇌를 혼합. 이 시스템은 생물학으로 관련, 쉽게 설정 하 고 세포 배양에서 잘 훈련 된 경험에 대 한 처리.
BBB의 다른 어떤 생체 외에서 모델에 관해서는 장벽의 견고의 과감 한 제어 적용 되는 경우 신뢰할 수 있는 결과 얻을 것 이다. 침투성 및 부적당 한 침투성 값 (즉, Pe정 1.2 보다 더 높은)와 모든 삽입을 폐기 해야 합니다에 대 한 삽입은 신중 하 게 테스트 되어야 합니다.
FBS 샘플 BBB의 특성을 해제 하지 않는 한 일괄 처리를 식별 하기 위해 신중 하 게 시험 되어야 한다. 동일한 통보는 바이러스에서 입자 또는 생체 희석은 자동차 매체에 관한 만들 수 있습니다. 그것은 또한 luminal 구획의 중간 구.......
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공개 사항
시스템의 지적 재산권은 특허 32, 35 , 38참조.
감사의 글
이 연구는 사노 피 파스퇴르 파스퇴르에 의해 Incitative 그랜트 (PTR 435)를 포함 하 여 파스퇴르에서 내부 교부 금에 의해 및 "성립 드 지원 à 라 검색" 제공 된 교부 금에 의해 지원 되었다. A. 다 코스타는 사노 피-파스퇴르 그랜트와 플로리안 Bakoa에 의해 지원 되었다는 ANRT에서 제공 하는 박사 학위 부여의 (협회 국립 드 라 검색 외 드 라 Technologie). 우리는 유용한 토론에 대 한 홍보 피에르 올리비에 Couraud와 박사 피렌체 밀러에 빚을입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 12웰 플레이트 | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2' deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
| 85mm 페트리 접시 | Sarstedt | 83-3902-500 | |
| Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
| β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
| CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | Dr Lafon | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Dark 96 웰 플레이트 | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | 내피 세포 매체 |
| 에탄올 | Carlo Erba | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| 포름 알데히드 | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
| GIEMSA | RAL 진단 | 320310 | |
| 염소 - 안티 마우스 | 잭슨 면역 연구 | 115-545-003 | |
| 염소 - 안티 토끼 | 써모 피셔 Scientific | R37117 | |
| HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-글루타민 | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
| Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
| MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
| MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| 파라포름알데히드 | 전자 현미경 과학 | 15714 | |
| Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
| 펜/스트렙 | Eurobio | CXXPES00-07 | |
| Poly-D-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
| Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
| 쥐 콜라겐 I | Cultrex | 3443-100-01 | |
| 레티노산 All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
| RNA 정제 키트 | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
| 중탄산나트륨 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
| Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
| T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | 민감한 부착 세포를 위한 특정 표면 처리(Cell+)가 있는 조직 배양 폴리스티렌 플라스크 |
| Transwell | Corning | 3460 | 폴리에스터 다공성 멤브레인 배양 인서트 |
| Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
| 초순수 | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| 우리딘 | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
| Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IP 다카르 | 백신 바이알 |
참고문헌
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.
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