방법 논문

병원 체 또는 의약품 및 두뇌와 그들의 상호 작용에 의해 장벽 횡단 연구를 인간의 혈액-뇌 인터페이스 모델

DOI:

10.3791/59220

⸱

2019년 4월 9일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 우리가 현재에 cellulo BBB (혈액 뇌 장벽)의 설정을 설명 하는 프로토콜-Minibrain 폴리에스터 다공성 막 문화 인간의 BBB에 걸쳐 생체 또는 전염 성 요원의 전송 평가 시스템 삽입 및 그들의 이웃 뇌 세포에 생리 적 영향입니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

초기에 관련 신 경계 의약품의 심사와 그들의 침투와 장벽와 뇌 실질의 상호 작용에 대 한 cellulo BBB 모델에서 신뢰할 수 있는 여전히 충족된 필요. 이 간격을 채우기 위해 우리는 폴 리 에스테 트라이-인간의 뇌 세포 (뉴런, 이다 microglial 세포)의 문화에 의해 형성 된 다공성 멤브레인 문화 삽입 인간의 BBB 모델은 Minibrain와 결합 하 여 BBB-Minibrain, cellulo 모델에서 2D 설계 되었습니다. BBB-Minibrain BBB, 뉴런에이 분자의 특정 대상으로 확인 하 고 약물의 신경 보호 속성 후 보존 되었다 표시를 통해 신경 보호 약물 후보 (예: Neurovita), 전송 테스트를 허용 약 BBB를 교차 했다. 우리 또한 그 BBB-Minibrain 내 피 세포 장벽을 가로질러 바이러스 입자의 흐름을 감지 하 고 neuroinvasive 바이러스 입자는 Minibrain의 감염을 모니터링 하는 재미 있는 모델을 구성 하는 설명 했다. BBB-Minibrain은 신뢰할 수 있는 시스템, 쉽게 치료 또는 모욕 후 연구원 셀 문화 기술에서 훈련 및 뇌 세포 고기의 예측에 대 한 처리. Cellulo 테스트 등의 관심은 두 가지 것: 소개 하는 한편 약물 개발의 초기 단계를 derisking 하 고 다른 한편으로 테스트 하는 동물의 사용을 줄이고.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

두뇌는 뇌 실질과 혈액-뇌 장벽 (BBB) 이라는 혈액의 교류를 제한 하는 비 투과성 구조에 의해 조직의 순환에서 분리 된다. 주로 대뇌 내 피 세포의 구성, BBB는 동적 이다, 혈관 주위 microglia 및 이웃 뇌 실질의 신경 상호 작용 합니다. BBB의 세 가지 주요 기능은 생성 및 유지 관리의 영양소와 독성 부상 방지와 뇌의 공급 또는 병원 체1,2에 공헌 하는 신경 기능에 대 한 이온 항상성 뇌 항상성 및 그 기능3의 유지 보수. 이 그래서 몇 가지 약물만 BBB4,5교차 수 있습니다 효율적입니다. 현재, 분자 BBB 통과 되며 뇌에 확산 여부를 예측 하기 위해 사용할 수 있는 방법을 ex vivo 연구 부검 소재, 이미지 추적 MRI (자기 공명 영상) 또는 애완 동물 (위치 방출에 의해 인간의 자원 봉사자의 두뇌에서에 구성 단층 촬영) 또는 pharmacodynamics와 동물6,,78pharmacokinetic 전 임상 연구. 이러한 기술 및 모델 애완 동물의 제한 된 해상도 MRI6,8, 분자 (즉, 예를 들어 항 체 기반 분자)는 가난 하 게 계량 하기 어려움의 낮은 감도 같은 몇 가지 한계를가지고 7뇌 관통 하 고는 전 임상에 대 한 그들의 높은 비용 및 동물 실험의 연구.

마지막 포인트는 3R의 규칙, (대체, 감소 및 동물 실험의 상세) 규제 행정 질문이 연구원은 급히 동물에 과학적으로 정확한 대안을 개발 하기 때문에 중요 한 실험9,10,11,12,13,,1415.

지난 수 십년 동안 여러 체 외 모델 BBB의 제안 되었습니다16,,1718 필터에 배양 하 여 막 마우스, 쥐, 소, 돼지 등 다른 종에서 내 피 세포를 삽입. 마찬가지로 지금까지 인류의 관한 1 차 셀의 부족 하 고 어려운 여부 메시지가 불멸 하 게 뇌 내 피 세포 또는 줄기 세포 인간 파생19,20, 기반 인체 모델을 개발 하는 연구원 21. 이러한 장벽을 BBB의 적절 한 생체 외에서 서로게이트는 내 피 세포 마커, 긴밀 접합 마커, 경과 전송기, 용 질 운반대, 수용 체, 표현 하 고 내 피 자극 20에 응답. 내 피 세포와 다른 세포 유형 (즉, 이다, 신경 또는 pericytes22,23,24) 코팅 필터 막 삽입을 사용 하 여 몇 가지 BBB 모델 분석 했다. 이러한 공동 문화의 목표 이다/신경 또는 pericytes 수용 성 요인의 분 비를 이용 하 여 BBB 물리적 특성을 증가 했다.

그럼에도 불구 하 고, 이러한 모델의 연구 하 고 장벽 통과 되 면 마약 후보자의 운명을 예측 뇌 실질을 포함 되어 있습니다. 따라서, 우리의 목표는에 cellulo를 건설 했다 혈액/뇌 인터페이스, BBB-Minibrain, 하나의 키트로 BBB 모델과 혼합된 뇌 세포의 문화를 결합 하 여. BBB-Minibrain multiwell 셀 문화 접시의 우물에 삽입 된 다공성 필터 구성 된 문화 시스템을 사용 합니다. 필터는 인간의 뇌 내 피 세포 선 BBB 약25,,2627, BBB를 테스트에 대 한 신뢰성이 입증 되었습니다 hCMEC/D3 셀으로 입힌 다. Minibrain, 인간의 뉴런의 공동 차별화 된 문화 그리고 이다 NTera/Cl2.D1 셀 선28,29 에서 파생 된 인간 microglial 셀 라인 함께 혼합 켐/Cl530 비율에 해당 하는 microglia31뇌 신경 이다 비율 대 접시의 바닥에 잘 재배 이다.

BBB와 그들의 운명은 실질에 약물의 통로 공부, 외 cellulo 모델에는 혈액-뇌 인터페이스 두뇌 (neuroinvasiveness), 뇌 (neurotropism)에 분산에 병원 체의 항목을 해결 하기 위해 강력한 도구가 될 수 있습니다. 그리고 그들은 뇌 실질 세포에 독성 (neurovirulence)을 발휘할 수 있다. Neurovirulence 및 neuroinvasiveness 연구는 효율적인 cellulo 모델에서의 개발에서 유익 하 고 대체 동물 모델을 것 이다. 우리 프랑스 Neurotropic 바이러스 스트레인 황열병 바이러스 (즉, FNV YFV33,34)의 준비 하는 데 사용에 드문 바이러스 돌연변이의 neuroinvasive 표현 형 시연 BBB-Minibrain 키트32를 사용 하는 라이브 YFV 백신과 neuroregenerative 및 신경 biomolecule 라는 Neurovita (라고 NV 이제 원고)35의 통행 중단. 때문에 네바다도 자연스럽 게 세포 막 십자가 BBB, NV BBB를 포함 하 여 생물 막 십자가 관통 분자 (CPM)36셀으로 라마의 단일 체인 항 체의 가변 부분 (VHH)와 융합 했다. CPM 속성의 VHH 전자 점과 VHH37의 길이에 의존 것으로 보인다.

Cellulo 테스트에서이 pharmacokinetic 수행 및 동물, 및 이상적으로 긴장에서 그들의 행동을 예측할 수 있을 것 같은 시간에 pharmacodynamics 분석 하기 전에 잠재적으로 BBB를 교차 수 있는 분자 정렬 가능 하 게 한다 실질입니다. 이 시스템은 생물학적으로 적절 하 고 쉽게 설정 하 고 셀 문화26,29,,3038에 잘 훈련 된 전문가 의해 처리. Cellulo 테스트에서 그러한 관심 두 배 것: 한 손으로 전 임상 시험의 비용을 절감 하 고 반면에 동물 실험의 사용을 줄이고.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 세포의 Ntera/CL2 문화 작품. D1 포스트 mitotic hNeurons 및 hAstrocytes (NT2-없음)의 공동 문화를 준비 하

참고: 이것은 Minibrain (그림 1)의 구성 요소입니다.

  1. Ntera/Cl2.D1을 배양
    1. 액체 질소 탱크에서 냉동된 셀의 유리병을 제거 합니다. 얼음에 계속.
    2. 37 ° C 물 욕조에 빠르게 셀 동
    3. 완전 한 DMEM F12 매체의 10 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 세포를 전송 (Dulbecco의 수정이 글 매체: 영양소 혼합 F-12 매체) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2 mM 글루타민, 100 IU 페니실린와 100 µ g 스 보충 (즉, 완료 DMEM F12 매체)입니다.
    4. 실 온 (RT)에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심. 완전 한 DMEM F12 매체의 2 mL에 펠 릿 해리
    5. 민감한 부착 세포에 대 한 구체적인 치료와 폴리스 티 렌에서 T75 조직 배양 플라스 크에 전송 (T75Cell+) 포함 하는 완전 한 DMEM F12 매체의 13 mL.
    6. 문화 인큐베이터 90% 합류까지 37 ° C, 5% CO2 와 95% 습도 유지에 셀 (즉, 약 5 일). 보통 2-3 일 마다 변경 합니다.
  2. Subculturing Ntera/Cl2.D1 및 증폭
    1. 플라스 크에서 매체를 제거 합니다.
    2. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +보충의 10 mL와 함께 셀 단층 린스.
    3. EDTA 솔루션 (실시간 유지) 10 mL와 함께 셀 단층 린스.
    4. 트립 신-EDTA 솔루션 (0.05 %trypsin, 0.02 %EDTA)의 3 개 mL를 추가 하 고 실시간에 2 분을 품 어
    5. 플라스 크를 흔들어 하 고 셀은 플라스틱 표면에서 분리 된 ㄴ 다는 것을 확인.
    6. 비활성화는 트립 신, 15 mL 튜브에 실시간에 200 x g 에 5 분 동안 원심 분리기 전송 완전 한 DMEM F12 매체의 10 mL을 추가
    7. 완전 한 매체의 10 mL와 펠 릿을 해리 하 고 1 mL를 사용 하 여 각 새로운 플라스 크를 포함 하는 완전 한 DMEM F12 매체의 14 mL 접종.
      참고: 30 T75 셀+ 플라스 크는 각 차별화 필요 합니다.
    8. 90% 합류까지 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에 플라스 크를 품 어.
  3. 인간의 신경-사이토 공동 문화에 NTera/Cl2.D1의 차별화
    참고:이 Minibrain의 구성 하는 주요 요소입니다.
    1. 0 일에서 트립 신-EDTA 1.2 단계에서 설명한 대로 셀을 해리 하 고 완전 한 DMEM F12 매체의 2 mL와 함께 각 플라스 크의 셀 펠 릿 해리.
    2. 완전 한 DMEM F12 매체의 11 mL를 포함 하는 85 m m 지름의 60 플라스틱 접시에 세포 현 탁 액 (5 x 106 셀에 해당)의 1 mL를 추가 합니다.
      참고: 셀 플라스틱에 첨부 하지 것입니다 및 양식 의사 neurospheres ( 그림 1의 아래쪽 패널에 사진 참조)를 집계 합니다. 1 일 동안 37 ° C, 5% CO2 와 95% 습도 60 페 트리 접시를 품 어.
    3. 하루 1, 모든 트랜스 Retinoic 산 (ATRA) 페 트리 접시 (최종 농도 ATRA 10 µ M) 당 130 µ M로 보완 하는 완전 한 DMEM F12 매체의 1 mL을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2 와 24 h에 대 한 95% 습도에서 요리를 반환 합니다.
    4. 하루 2, 매우 신중 하 게 각 Petri Dish 50 mL 튜브에 50 x g 에서 10 분 원심 분리기 및 실시간 Dissociate 셀 분야를 신중 하 게 10 µ M ATRA와 보완 하는 완전 한 DMEM F12 매체의 13 mL와 느슨한 펠 릿 포함 하는 매체를 전송 하 고 일 추가 e 새로운 85 m m 직경 페 트리 접시 13 mL.
      참고: 다른 구절입니다 (즉, 약 70%의 밀도) 주 2에서 얻은 밀도 높은 영역 밀도 유지 하기 위해 매우 중요 하다. 따라서, 영역 밀도 낮추는 경우 셀의 수에 따라 접시의 총 수를 줄입니다.
    5. 4, 6, 8 일에는 위 절차 (1.3.4 단계)를 반복 합니다.
    6. 10 일, 위의 절차를 반복 하지만 T75 셀+ 플라스 크 배양 접시 대신에 구체를 추가. 한 페 트리 접시에서 한 T75 셀+ 플라스 크에 셀을 추가 합니다.
    7. 일 11, 13, 15, 17, 10 µ M ATRA와 보완 하는 완전 한 DMEM F12의 14 mL와 함께 사용 된 매체를 변경 합니다.
    8. 하루 19 14 mL 플라스 크 당 ATRA 없이 완전 한 DMEM F12 매체와 매체를 변경 합니다.
    9. 하루 20 해리 부드럽게 트립 신/EDTA와 셀 다음과 같습니다.
      1. 각 T75 셀+ 플라스 크에 10 mL PBS 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +; 보충의 셀 린스 실시간 5 분 EDTA의 4 l 셀을 품 어
      2. EDTA를 신중 하 게 제거 하 고 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 추가 및 실시간 쉐이크 아주 부드럽게 플라스 크에서 7 분을 품 어 하며 완전 한 DMEM F12 매체의 신중 하 게 8 mL을 추가
      3. 원심 분리기 10 g 및 실시간 x 160 분에 대 한 완전 한 DMEM F12 매체의 13 ml에서 셀 펠 릿 및 전송 T75 셀+ 플라스 크에서 해리.
        참고: 트립 신-EDTA와 매우 부드러운 분리 플라스틱 도자기에 강력 하 게 연결 된 원래 teratocarcinoma 세포에서 세포 분화는 ATRA 복구 수 있게 됩니다.
    10. 하루 21, 매체와 죽은 세포를 제거 합니다. 추가 5% 보완 하는 완전 한 DMEM F12 매체의 14 mL FBS, 2 mM 글루타민 100 IU 페니실린, 100 µ g 스, 아크 (시 토 신 β-D-arabinofuranoside)의 0.5 µ M (완료 5% FBS DMEM F12-아크).
    11. 일 23, 25, 28, 바꾸기 사용 매체 14 mL 5% FBS DMEM F12-아크.
    12. 49 (매 2 일)까지 일 29, 바꾸기 사용 14 mL 5% 태아 둔감 한 혈 청, 2mm 글루타민, 100 IU 페니실린, 100 µ g 스, FudR (5-플 루 오로-2' deoxyuridine)의 5 µ M 및 10 µ M로 보완 하는 완전 한 DMEM F12 매체와 매체 Urd (Uridine) (전체 5% FBS DMEM F12-FudR-Urd).
    13. 하루에 50, 5 %FBS, 2 mM 글루타민, 100 IU 페니실린, 보완 하는 완전 한 DMEM F12 매체의 14 mL와 함께 사용 하는 바꾸기 매체에서 100 µ g 스와 10 µ M Urd (완료 5% FBS DMEM F12-Urd).
    14. 95 (주 2 회)까지 일 51, 바꾸기 사용 매체 전체 5%의 14 mL FBS DMEM F12-Urd.
      참고: 하루 51에서에서 실험에 대 한 사용 하지만 95 보다 나중이 아니라 셀 수 있습니다. 유사 분열 억제제와 직렬 처리를 사용 하 여 포스트 mitotic hNeuron 및 hAstrocytes (NT2-없음)의 공동 문화의 순수한 인구를 복구 수 있습니다.
    15. 셀을 시드하 진행 부드러운 trypsinization 하루 20에 대 한 설명 된 대로.

2. 세포 문화 작품 인간 microglial의 세포 켐/Cl5

참고: 이것은 microglial 구성 요소는 Minibrain의 (그림 1).

  1. 켐/Cl5 세포 배양 인간 microglial
    1. 액체 질소 탱크에서 냉동된 셀의 유리병을 제거 합니다. 얼음에 계속.
    2. 37 ° C 물 욕조에 빠르게 녹여.
    3. 5% 태아 둔감 한 혈 청, 2mm 글루타민, 100 IU 페니실린와 100 µ g 스 (즉, 전체 5% FBS DMEM F12 매체) 보완 하는 완전 한 DMEM F12 매체의 10 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 세포를 전송 합니다.
    4. 전체 5% FBS DMEM F12 매체의 2 mL와 펠 릿 실시간 Dissociate에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심.
    5. 포함 하는 완전 한 5% FBS DMEM F12 매체의 13 mL T75 셀+ 플라스 크에 전송 합니다.
    6. 37 ° C, 5% CO2 와 90% 합류까지 95% 습도에 문화 세포. 보통 2-3 일 마다 변경 합니다.
  2. Subculturing 인간 microglial 셀 켐/Cl5
    1. 플라스 크에서 매체를 제거 합니다.
    2. 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +보충 PBS의 10 mL와 함께 셀 단층 린스.
    3. EDTA 솔루션 (실시간 유지) 10 mL와 함께 셀 단층 린스.
    4. 트립 신-EDTA 솔루션의 3 개 mL를 추가 하 고 실시간에 2 분을 품 어
    5. 플라스 크를 흔들어 하 고 셀은 플라스틱 표면에서 분리 된 ㄴ 다는 것을 확인.
    6. 비활성화는 트립 신, 한 15 mL와 g 및 실시간 x 200에서 5 분 동안 원심 분리기 전송 완료 5% FBS DMEM F12 매체의 10 mL을 추가
    7. 완전 한 매체의 10 mL와 펠 릿을 해리 하 고 1 mL를 사용 하 여 각 새로운 플라스 크를 포함 하는 완전 한 5% FBS DMEM F12 매체의 14 mL 접종.
    8. 90% 합류까지 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에 플라스 크를 품 어.

3. 문화 사용 코트 다공성 삽입 및 BBB 준비 hCMEC/D3

  1. 인간의 내 피 세포 hCMEC/D3 (그림 2) 경작
    1. 유형 1:30 살 균 증류수 (셀 문화 등급)와 함께 콜라겐을 쥐를 희석.
    2. T75 셀+ 플라스 크에 10 mL를 전송 하 고 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도 인큐베이터에 2 h를 품 어.
    3. 콜라겐 솔루션을 제거 하 고 내 피 세포 매체 10 mM HEPES (완전 한 내 피 세포 매체 라고도 함)의 보충의 15 mL와 함께 그것을 대체.
    4. 액체 질소 탱크에서 셀의 cryo 유리병을 제거 합니다. 얼음에 계속.
      참고: 셀 성장, 그리고 씨앗 많은 제조 업체에 의해 설명 되었다. 셀 라인 생물학 자료 전송 계약에 의해 덮여 있다. 셀 통로 번호 25에서 가져온 고 통과 35 보다 더 사용할 수 없습니다.
    5. 37 ° C 물 욕조에 빠르게 녹여.
    6. T75 셀+ 플라스 크에 세포를 전송 하 고 37 ° C, 5% CO2 와 2 ~ 4 h 95% 습도에 플라스 크를 반환 합니다.
    7. 또는 셀을 제거 하지 않고 신중 하 게 매체를 제거 합니다. 한 번 완전 한 내 피 세포 매체의 10 mL와 함께 셀 린스.
    8. 완전 한 내 피 세포 매체의 15 mL를 추가 합니다.
    9. 37 ° C, 5% CO2 와 매체를 변경 하지 않고 100% 합류 (4 일 미만)까지 95% 습도에 문화 세포.
  2. Subculturing hCMEC/D3 BBB의 삽입을 준비 하
    1. 새로운 T75 셀+ 플라스 크 코트 또는 삽입 유형 나 쥐 콜라겐 (3.1 단계) 위에서 설명한 대로.
    2. 플라스 크에서 매체를 제거 합니다. 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +보충 PBS의 10 mL와 함께 셀 단층 린스.
    3. 트립 신-EDTA 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 37 ° c.에서 5 분을 품 어
    4. 플라스 크를 흔들어 하 고 세포가 완전히 플라스틱 표면에서 분리 된 ㄴ 다는 것을 확인.
    5. 비활성화 된 트립 신을 완전 한 내 피 세포 매체의 4 mL를 추가 합니다.
    6. 플라스틱 피 펫 5 mL와 기계적으로 발음 하 고 플라스 크의 바닥에 5 mL 피 펫 5 배 이상 유지 하는 동안 세포 현 탁 액을 내뿜는 여 셀 해리.
    7. 셀의 개수 및 사용 5 x 104 셀/12 잘 폴 리 에스테 르 막 문화에 대 한 삽입 삽입 삽입 및 T75 셀+ 플라스 크에 대 한 2 x 106 셀. 폴 리 에스테 르 막 문화 삽입과 함께 PELy (즉, 단락 4.2 아래 노란색 루시퍼 참조에 내 피 세포 침투성) 실험에 대 한 셀 없이 3 개의 필터를 준비 합니다.
    8. 플라스 크 또는 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에서 삽입 100% 합류까지 품 어.
    9. 새로운 통로까지 T75 셀+ 플라스 크에 대 한 매체를 변경 하지 마십시오. 폴 리 에스테 르 막 문화에 BBB에 대 한 반대로 삽입: 2-4 일에 매체를 변경, 실험을 위한 BBB를 사용 하 여 주 6에서.

4. 건설 및 BBB-Minibrain (그림 2)의 품질 관리

  1. BBB-Minibrain 폴리에스터 설정 막 문화 삽입 장치 (그림 2B)
    1. 12 hCMEC/D3 셀 잘 폴리에스터 성장 막 문화 실험을 위해 그들을 사용 하기 전에 내 피 세포 매체에 6 일에 대 한 필터를 삽입.
    2. 폴 리-D-라이 신 (1 mL/음, 10 µ g/mL, RT에서 4 h)와 다음 (1 mL/음, RT에서 하룻밤 1 µ g/mL) laminin 12 잘 플레이트 코트.
    3. Laminin를 제거 하 고 추가 5% 보완 하는 내 피 세포 매체의 1 mL FBS (5% 내 피 세포 매체).
    4. 1 h 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에서 품 어.
    5. 부드럽게 NT2-없음 (단계 1.3.9에서에서와 같이) 및 켐/Cl5 (단계 2.2에서에서와 같이) trypsinize와 완전 한 내 피 세포 매체와 셀 펠 릿 해리.
    6. 계산 셀, 믹스 3.6 × 105 NT2-없음, 105 켐/Cl5 셀/잘 씨 12 잘 플레이트 x 0.4.
    7. T = 24 h (시드 후 24 h): 신선한 완전 한 내 피 세포 매체 (Minibrain 세포와 내 피 세포)와 사용 된 매체를 변경 하 고 hCMEC/D3 폴 리 에스테 르 막 문화 삽입 필터 Minibrain 셀 상단 전송. 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에서 BBB Minibrain를 품 어.
      참고: BBB-Minibrain 다음 이루어져 있을 것 이다 인간 내 피 세포 hCMEC/D3 luminal 구획 (또는 "혈액" 구획)를 분리 하는 필터와 인간 세포 hNT2-n/A 및 잘 정의의 밑에 hCHME/Cl5 (Minibrain)의 혼합된 문화 계층 abluminal 구획 (또는 "두뇌" 구획) (그림 2B).
  2. BBB-Minibrain (품질 관리) (그림 2C)의 내 피 침투성의 유효성 검사
    1. 전송 버퍼 (TB)는 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 10 mM HEPES와 1mm 나트륨 pyruvate 보충 HBSS (행 크 스 균형 소금 솔루션) 버퍼를 준비 합니다.
    2. 잘 당 전송 버퍼의 1.5 mL 12 잘 접시를 준비 합니다.
    3. T = 0, 신선한 확인 전송 버퍼 루시퍼 노란색 (LY-TB) 50 µ M으로 보충.
    4. 각 필터는 내 피 세포 장벽을 영향을 주지 않고 매체를 신중 하 게 제거를 거꾸로 되돌립니다.
    5. 필터를 채워진된 12 잘 접시에 놓고 LY TB의 0.5 mL를 추가 합니다.
    6. 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에 인큐베이터에 접시를 품 어.
    7. T = 10 분 전송에서 새로운 TB에 필터 12 잘 접시 가득 하 고 OD 독서에 대 한 첫 번째 접시의 abluminal 구획을 유지.
    8. T = 25 분, 4.2.7 단계를 반복 합니다.
    9. T = 45 분, 격판덮개에서 필터를 제거 하 여 전송을 중지 합니다. 외경 측정에 대 한 luminal 구획과 abluminal를 유지.
    10. 전송 어두운 96에서 잘 접시 샘플: 190 µ L 결핵 luminal 구획과 히 결핵에 대 한 abluminal 구획에 대 한 샘플의 200 µ L 10 µ L.
    11. LY-TB의 형광을 측정 λ428 nm λ535 nm에 다른 샘플에 존재 (여기 및 방출 길이 파도 각각).
    12. LY-TB (PeLY) Siflinger-Birnboim, A 외. (1987)39 와 다 코스타, 수식을 사용 하 여 A 외. (2018)34 쪽으로 내 피 침투성 (Pe)을 계산.
      1/PSe = (1/태평양 표준시)-(1/PSf)와 PeLY= PSe/미
      참고: PSf는 셀 없이 필터의 침투성, PSt는 세포와 필터의 침투성, PSe는 단층, S의 표면에 단층의 표면 이다 내 피 단층에 침투성 (12 잘 필터 = 1.12 m2 ), Pe정 은 cm/min로 표시 됩니다. HCMEC/D3 PeLY 0.7 1.2 x 10 사이 여야는 실험에 사용-3 cm/min에 따라 주로 FBS. 중요: PeLY 보다 1.2 의미 BBB는 꽉 충분히 일부 누설은 관찰 될 수 있다. 이 방 벽을 삭제 합니다.

5. BBB-Minibrain 황열병 바이러스 백신 샘플, 프랑스 Neurotropic 바이러스, YFV-FNV 34 (그림 3) 에서 신경 침입 바이러스 성 입자의 존재를 강조 하기 위해 사용

  1. BBB 건너와는 Minibrain에 있는 황열병 바이러스의 곱셈
    1. 준비 단계 4.1.7 24 h; 바이러스의 추가 하기 전에에서 설명 된 대로 BBB-Minibrain를 사용 하 여 2 %FBS 내 피 세포 매체에 의해 매체를 교체 합니다.
      참고: 바이러스를 추가 하기 전에 단지 매체를 변경 하는 피하기 위해 매우 중요 하다. 매체 변경 인간의 내 피 세포를 활성화 하 고 정도 바이러스의 통과 수 있도록 장벽을 열 수 있습니다. 여기는 매체 실험을 시작 하기 전에 24 시간을 변경 됩니다.
    2. T = 0, 3500 플 라크 형성 단위 (PFU) YFV-FNV의 2%의 50 µ L에 희석 FBS 내 피 세포 매체 luminal 구획 위에 매우 신중 하 게 추가 합니다. BBB-Minibrain 컨트롤 바이러스 없이 2 %FBS 내 피 세포 매체의 50 µ L로 접종 이다. 동반자에 PeLY 를 잘 확인 합니다.
    3. 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에 인큐베이터에 BBB-Minibrain를 품 어.
    4. 24 시간 후 폴 리 에스테 르 막 문화 삽입 필터 장치를 제거 하 고 PeLY, 샘플 1 mL abluminal 구획에서 결정 한 A. 다 코스타 외. (2018)34에 의해 설명 된 대로 바이러스 적정. 신선한 2 %FBS 내 피 세포 매체와 매체를 교체 합니다.
    5. 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에서 BBB Minibrain를 품 어.
    6. 72 h 후 샘플 abluminal 구획에서 매체 바이러스, 적정 및/또는 유전자 표정 분석 A. 다 코스타 외. (2018)34에 의해 설명 된 대로 대 한 Minibrain 세포에서 RNA를 추출.
  2. YFV-FNV Minibrain 셀 직렬 구절에의 neurotropic 이체의 증폭
    1. 사용 Minibrain 셀 12 잘 플레이트 (즉, 단계 4.1.6 4.1.7) 코팅.
    2. 시간 0 h 포인트 3500 플 라크 형성 단위의 YFV-FNV (luminal 구획) 셀 위에 매우 신중 하 게 2 %FBS 내 피 세포 매체의 50 µ L에 희석 추가.
    3. 1 시간 후 바이러스 inoculum와 매체를 제거 하 고 신선한 2 %FBS 내 피 세포 매체를 바꿉니다.
    4. 48 h 후 문화 매체의 500 µ L를 샘플 하 고 신선한 Minibrain 세포를 감염
    5. 120 h 후 문화 매체의 500 µ L를 샘플 하 고 신선한 Minibrain 세포를 감염.
    6. 192 h 후 배양 (바이러스 주식 농축 =) 저장 하 고 유전자 표정 분석 A. 다 코스타 외. (2018)34에 의해 설명 된 대로 대 한 Minibrain 세포에서 RNA를 추출 합니다.

6. BBB-Minibrain BBB 교차와 뇌 세포는 biomolecule의 대상으로 공부 하기의 사용

  1. 타겟팅 biomolecule 신경의 BBB를 통해 전송
    1. Minibrain-BBB 4.1.7 설명 단계로 준비를 사용 합니다.
    2. 시간 시점 0 h는 biomolecule 추가 (예제 삽입 58.75 ng/BBB 셀 permeant NeuroTag NV 분자의 BBB-Minibrain 당 추가 된 결과 섹션에서 제공 합니다.
    3. 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에서 BBB Minibrain를 품 어.
    4. 24 시간 후 폴 리 에스테 르 막 문화 삽입 필터 장치를 제거 하 고 PeLY, 결정 hNeurons neurofilament Nf200 Minibrain 셀을 얼룩 그리고 (결과에 제공 된 예제에서에서 Minibrain에는 biomolecule의 존재를 감지 섹션, NeuroTag-NV 검색 되었습니다35,40포함 Strep 태그에 대 한 지시는 항 체를 사용 하 여).
  2. biomolecule BBB 넘 후 neuroregenerative biomolecule는 Minibrain 분석 결과 후속 신경의 BBB를 통해 전송
    1. Minibrain-BBB 준비 단계 4.1.7에에서 설명 된 대로 사용 합니다.
      참고: 신경만을 대상으로 하는 분자에 대 한 Minibrain 세포는 신경 세포 (NT2-N)만38로 교체할 수 있습니다.
    2. 시간이 시점에서 0 h, 셀 permeant NV 분자 (활성 폼 CPM-NeuroTag-NV, 비활성 양식 CPM-NeuroTag-NVΔ) C. Prehaud 그 외 여러분 (2014)35에 의해 설명 된의 58.75 ng/BBB-Minibrain를 추가 합니다.
    3. 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에 인큐베이터에 BBB-Minibrain를 품 어.
    4. 4 h 후 주사 바늘 개별 상처 확인 (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, 벨기에) Minibrain 세포에. 각 개인에 적어도 10 스크래치를 잘 확인 합니다. 동반자에 PeLY 를 잘 확인 합니다.
    5. 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에 인큐베이터에 BBB-Minibrain를 품 어.
    6. 8 h 후 신선한 완전 한 내 피 세포 매체에 의해 abluminal 구획에 매체를 교체 합니다.
      참고: 그것은 Minibrain 세포의 부상으로 이어질 수 있습니다 세포 죽음 그리고 세포 독성 화합물의 릴리스 이후이 단계에서 매체를 대체 하는 것이 중요.
    7. 37 ° C, 5% CO2 , 95% 습도에 인큐베이터에 BBB-Minibrain를 품 어.
    8. 48 h 후 hNeurons C. Prehaud 그 외 여러분 (2013)40에 의해 설명 된 대로 축 삭 재생을 위해 셀 스테인드.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BBB-Minibrain에서 cellulo 실험은 혈액-뇌 인터페이스의 모델.

BBB-Minibrain는 상위 레벨에 혈액 구획 및 혈액-뇌 인터페이스 (그림 2AB)의 낮은 수준에 두뇌 구획을 모방 하기 위해 폴 리 에스테 르 막 문화 삽입 시스템에 설정 됩니다. BBB 형성 필터에 hCMEC/D3 내 피 세포와 luminal 구획 및 뇌 세포 (뉴런, 이다 microglial 세포)의 Minibrain 인간의 트라이 문화를 포함 하는 abluminal 구획 그것에 의하여 이루어져 있다. Minibrain 셀 클래식 트라이 문화 인구 표현 형 (그림 1, 하단 오른쪽 패널)과 급행 특정 셀 다 코...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 문서에서 우리는 cellulo을 구축 하는 방법을 시연 혈액/뇌 인터페이스, BBB-Minibrain, BBB 모델과의 문화를 결합 하 여 하나의 키트로 뇌 세포 (Minibrain) 뇌를 혼합. 이 시스템은 생물학으로 관련, 쉽게 설정 하 고 세포 배양에서 잘 훈련 된 경험에 대 한 처리.

BBB의 다른 어떤 생체 외에서 모델에 관해서는 장벽의 견고의 과감 한 제어 적용 되는 경우 신뢰할 수 있는 결과 얻을 것 이다. 침투성 및 부적당 한 침투성 값 (즉, Pe정 1.2 보다 더 높은)와 모든 삽입을 폐기 해야 합니다에 대 한 삽입은 신중 하 게 테스트 되어야 합니다.

FBS 샘플 BBB의 특성을 해제 하지 않는 한 일괄 처리를 식별 하기 위해 신중 하 게 시험 되어야 한다. 동일한 통보는 바이러스에서 입자 또는 생체 희석은 자동차 매체에 관한 만들 수 있습니다. 그것은 또한 luminal 구획의 중간 구...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

시스템의 지적 재산권은 특허 32, 35 , 38참조.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 사노 피 파스퇴르 파스퇴르에 의해 Incitative 그랜트 (PTR 435)를 포함 하 여 파스퇴르에서 내부 교부 금에 의해 및 "성립 드 지원 à 라 검색" 제공 된 교부 금에 의해 지원 되었다. A. 다 코스타는 사노 피-파스퇴르 그랜트와 플로리안 Bakoa에 의해 지원 되었다는 ANRT에서 제공 하는 박사 학위 부여의 (협회 국립 드 라 검색 외 드 라 Technologie). 우리는 유용한 토론에 대 한 홍보 피에르 올리비에 Couraud와 박사 피렌체 밀러에 빚을입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
12웰 플레이트Corning3336
5-fluoro-2' deoxyuridineMerck-Sigma AldrichF0503
85mm 페트리 접시Sarstedt83-3902-500
Anti-Nf200Merck-Sigma AldrichN4142
β-mercapto-ethanolMerck-Sigma AldrichM3148
CHME/Cl5Unité de Neuroimmunologie ViraleDr Lafon
CMCCalbiochem217274
Cytosine β-D-arabinofuranosideMerck-Sigma AldrichC1768
Dark 96 웰 플레이트Corning3915
DMEM F12Thermofisher Scientific31330-038
DMSOMerck-Sigma AldrichD2650
Endogro IVMilliporeSCME004내피 세포 매체
에탄올Carlo Erba529121
FBSHycloneSV30015-04
포름 알데히드Merck-Sigma Aldrich252549
GIEMSARAL 진단320310
염소 - 안티 마우스잭슨 면역 연구115-545-003
염소 - 안티 토끼써모 피셔 ScientificR37117
HBSS with Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14025-100
hCMEC/D3CedarlaneCLU512
Hepes 1MThermofisher Scientific15630-070
Hoescht 33342Merck-Sigma Aldrich33263
LaminineMerck-Sigma AldrichL6274
L-글루타민Thermofisher Scientific25030-024
Lucifer YellowMerck-Sigma AldrichL0259
MEM 10XThermofisher Scientific21430
MEM 1XThermofisher Scientific42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
파라포름알데히드전자 현미경 과학15714
Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14190
PBS-Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14040-091
펜/스트렙EurobioCXXPES00-07
Poly-D-LysineMerck-Sigma AldrichP1149
Prolong GoldThermofisher ScientificP36930
QiashredderQIAGEN79656
쥐 콜라겐 ICultrex3443-100-01
레티노산 All-TransMerck-Sigma AldrichR2625
RNA 정제 키트QIAGEN74104
SDSMerck-Sigma AldrichL4509
중탄산나트륨 5.6%EurobioCXXBIC00-07
Sodium PyruvateThermofisher Scientific11360
T75 Cell+ FlaskSarstedt83-1813-302민감한 부착 세포를 위한 특정 표면 처리(Cell+)가 있는 조직 배양 폴리스티렌 플라스크
TranswellCorning3460폴리에스터 다공성 멤브레인 배양 인서트
Trypsin-EDTAMerck-Sigma AldrichT3924
초순수Thermofisher Scientific10977-035
우리딘Merck-Sigma AldrichU3750
VerseneThermofisher Scientific15040-033EDTA
YFV-FNVIP 다카르백신 바이알
에게 요청 시 없이 PBS

참고문헌

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