조류 배아 배아 Cardiomyocytes의 생체 내 주입에 대 한 microinjection 기반 시스템

요약

이 방법에서는, 배아 심장 조직 microdissected, 해리, 붙일 레이블 및 호스트 배아 조직으로 이식 수술이 있습니다. 이 개인 또는 조직 수준 발달 조직 아래 소성 hemodynamic 조건 및/또는 변경된 paracrine/juxtacrine 환경 공부를 위한 플랫폼을 제공 합니다.

초록

세포 계보 결심에 외부 microenvironmental 영향 대 셀 자치 패턴의 상대적 영향 해석 발달 생물학 연구에서 일반적인 문제를 나타냅니다. 배아 심장에서이 특히 transcriptional 레 귤 레이 터, paracrine/juxtacrine 신호 신호의 표현에 있는 지역 다름으로 어려울 수 있습니다 그리고 hemodynamic 힘 모두 cardiomyocyte 성숙에 영향을 알려져 있습니다. 따라서, 개발 cardiomyocyte 분자와 biomechanical microenvironment를 변경 하는 단순화 된 방법, 어떻게 지역 조건 영향 세포 운명 및 기능을 검사 하는 강력한 기술 역할을 합니다. 이 해결 하기 위해 우리는 물리적으로 청소년 cardiomyocytes 심장이 나 주변 배아 조직에서 소성 위치에 이식 하는 방법을 최적화 했습니다. 이 단일 셀 해상도 그대로 태아 내에서 어떻게 microenvironmental 조건 영향 cardiomyocyte 운명 전환 검사 수 있습니다. 여기, 우리는 배아 myocytes 심장 하위 도메인의 다양 한 절연, 해리, 붙일 레이블이 고 수 높은 정밀도 함께 호스트 배아로 microinjected 프로토콜을 설명 합니다. 셀 수 다음 직접 분석 원래의 장소에 다양 한 이미징 및 조직학 기법을 사용 하 여. 이 프로토콜은 심장 등 움직이는 조직에 prohibitively 어려울 수 있는 전통적인 이식 실험에 대 한 강력한 대안입니다. 이 방법의 일반적인 개요는 다양 한 기증자 조직 및 호스트 환경, 그리고 저렴 한 비용, 사용의 용이성에도 적용할 수 있습니다 그리고 속도 발달 연구의 다양 한 잠재적으로 유용한 응용 프로그램.

서론

심장 발달 연구는 유전자 규제 네트워크의 많은 그 패턴 다른 세포 계보와 기능 도메인에에서 식별 생식 유전자 변형 모델 시스템의 출현에서 거 대 하 게 유익 했다. 그러나, 식별이 유전자 네트워크와 상호 작용 및 microenvironmental 조건에 응답 하는 방법 paracrine/juxtacrine 신호 및 생물 입력 (스트레칭, 스트레인, hemodynamic 흐름)를 포함 하 여 전하실 수 있습니다. 이와 같이, 그것은 항상 쉽지 않다 세포 표현 형 발생 변화 심장 역학 또는 더 높은 순서 조직 구성^{1,2에 유전 섭 동에의 직접적인 결과 또는 adaption의 보조 결과 여부를 결정 하} .

접목 운명 사양의 주소 개념에 사용 된 고전적인, 실험, 유도, 헌신과 능력^3,4, 나타내는 것 이라고에 내재 된 문제 중 일부를 우회 하는 이상적인 접근 에 셀 환경 영향 대 자치를 정의합니다. 불행 하 게도, 심장 수축 어려워질 표준 접목 방법. 조직의 급속 한 운동을 자주 마음에 준수에서 이식할된 세포를 방지 하 고 큰 조직의 구멍 (일반적으로 접목에 필요한) 자주 심장 마비와 배아 치 사 율^5,,67이어질. 따라서, 압력 기반 개발 했습니다, 그리고 microinjection 시스템의 조직 접목 기술 장애물을 우회 개발 여자 마음에 정밀 세포 이식에 대 한 기술 이전^8,9. 이 기술을 사용 하 여, 수 개인 또는 소규모 그룹 기증자의 배아에서 분리 된 심장 세포의 광범위 한 호스트 준비 및 사용 하 여 발생 하는 큰 조직 모욕에 대 한 필요성을 제거 하는 호스트 배아 마음의 영역의 다양 한으로 microinjected 수 합니다. 표준 이식 기법입니다. 이러한 이식 연구에 사용 되는 microinjection 바늘의 외부 직경을가지고 ~ 바늘 대상 조직에 직접 배치할 수 있습니다 즉 30−40 µ m (즉, 배아 심근 벽을 관통할 수 있다) 그리고 셀 전달할 수 있습니다 focally 주변 조직에 최소한의 손상입니다. 동위 원소, heterotopic, isochoric, 그리고 heterochronic 조작, 유연한, 빠르고 저렴 한 비용 접근 방식을 직접 검사 개발에 고아 한 실험적인 embryological 패러다임 제공의 다양 한 수행 하는 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 4 연 발 심장입니다.

아래에 설명 된 프로토콜에서 우리 기증자 셀 permeant 형광 염료, microinjection 실험의 성공에 대 한 실시간으로 모니터링할 수 있는 셀을 라벨에 대 한 필요 없이 문서화 engrafted 셀의 위치 추가 얼룩. 그러나,이 접근은 단기 실험 (약 48 h)에 형광 성 염료는 세포 분열을 통해 손실 될 수 있습니다 주목 해야한다. 대체 방법은 더 긴 기간 실험을 위해 사용할 수 있습니다.

우리는 심장 개발의 맥락에서이 기법을 제시 하 고, 하는 동안 우리는 사용 그것은 큰 효과를 세포 이식 실험 mesoderm, 머리, 팔 다리, 그리고 somites에. 따라서 아래 설명 된 기본적인 접근 매우 온순한 이며 기관 시스템의 다양 한에서 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 보호 지침의는 노스 캐롤라이나 대학의 채 플 힐에서 설명한 모든 방법을 준수.

1입니다. 마이크로 주입 펫의 준비

1. 유리 모 세관 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 당겨. 일부 주사 바늘 줄이도록 권장 됩니다 구조 불순물 없는 매우 날카로운 표면 제공. 이렇게 하려면 15−20 분 45 °의 각도로 경사지 바퀴에 가져온된 바늘의 끝을 폴란드어.
   참고: 당기에 대 한 정확한 설정을 사용 하는 끌어당기는 사람에 따라 달라 집니다. 빗면의 최종 내경 20−40 µ m 사이 이어야 한다.
2. 유리를 실리콘으로 모 세관의 내부 및 외부 표면 코트. 먼저 바늘 바늘 그리고 각 micropipette 코트 안쪽 표면에 backload siliconizing 에이전트 솔루션의 외부 표면 코트 siliconizing 에이전트에 찍어.
   주: 코팅 유리 모 세관의 이식 실험 하기 전에 24 시간 수행 되어야 한다. 실리콘 유리 모 세관 코팅 유리를 화학적으로 불활성 화면을 제공 합니다. 모세 혈관은 남아 치료, 나중 단계에서 생성 된 셀 서 스 펜 션 것 이다 유리에 고착 하 고 바늘을 연결. 따라서, 코팅은 필요 하 고 방법의 성공에 매우 중요.
   주의: siliconizing 에이전트 헵 1, 7-dichloro-1,1,3,3,5,5,7,7-octamethyltetrasiloxane (자료 테이블)의 기본 상용 혼합물 이다. 그것은 가연성이 매우 심하게 독성입니다. 항상 적절 한 보호구를 증기 두건 안쪽으로 처리 합니다.
   1. Backload 바늘, 로드 ~ 5−10 µ L 주입 마이크로 피 펫 팁 (자료 테이블)에 siliconizing 에이전트의. 모 세관 놓고 마이크로 주입 팁 가져온된 유리의 넓은 끝에 팁의 위치를 멀리 아래로 (가까운 유리 바늘 팁) 가능 합니다. 바늘에 기포를 최소화 하기 위해 로드 피 펫을 천천히 제거 하는 동안 siliconizing 에이전트를 꺼냅니다.
   2. 10 분 동안 유리 바늘에서 siliconizing 에이전트를 두고, 새로운 로드 피 펫으로 발음 하 여 제거 하 고 바늘 증기 두건에서 하룻밤 건조 허용.
3. 실험의 아침 유리 모 세관 절차 단계 1.2에에서 따라 이온을 제거 된 물으로 씻어과 3−4 h 동안 건조 수 있습니다.

2입니다. 솔루션의 준비

1. 트립 신 4.2 mL Dulbecco의 수정된 독수리의 매체와 햄의 영양 혼합 F12 (DMEM/F12) 750 µ L 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 페니실린/스의 50 µ L를 보완 하 여 솔루션을 중화의 5 mL을 준비 합니다. 37 ° C에서 사용까지 저장 합니다.
2. 준비 5 µ M의 행 크의 995 µ L에 pipetting 5 µ L 1 m m 재고 (디 메 틸 sulfoxide [DMSO] 재료의 표)에 염료를 라벨에 의해 염료 솔루션 라벨 균형 소금물 (HBSS). 1 분 및 저장소 사용까지 37 ° C에 소용돌이.
3. 32 %PFA 재고 솔루션의 분자 생물학 학년 물과 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) x 10의 8 mL 62 mL와 10 mL을 결합 하 여 신선한 paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다. 최종 농도 4% PFA 1 x DPBS에.

3입니다. 호스트 배아의 준비

1. 38 ° C까지 햄버거와 해밀턴 (HH) 단계 19¹⁰습도 인큐베이터에서 수평 방향에 비옥한 계란을 품 어.
   참고: 조작에 대 한 선택 단계는 유연 하 고 각 개별 실험의 목표에 전적으로 의존.
2. 작은 빵 꾸를 직각된 포 셉을 사용 하 여 계란 적도 따라 달걀 껍질의 "평면" 최종 점수 > 직경에서 1 m m. 첨부 10 mL 주사기는 바늘을 통해 18 G 바늘을 삽입 하 고 ~ 5 mL의 알 부 민 제거.
   참고:이 해 부 위치 계란 내부 "공기 셀" 외부 고 누수는 펑크 일단 알 부 민을 유지 합니다. 그것은 "상품" 달걀 껍질, 후속 단계에 잠재적인 손상을 방지에서 배아로,이 단계에 것이 좋습니다.
3. 달걀 껍질의 상단에 투명 테이프를 적용 됩니다. 직각된 포 셉으로 점수와 곡선된 tenotomy가 위를 사용 하 여 ~2.5 cm 창 잘라.
4. 검사 하 고 햄버거와 해밀턴¹⁰ 설립 기준에 따라 배아 단계 투명 테이프로 3.2 단계에서 찔린 인감.
   참고: 여기, 무대 HH 19 배아 사용 됩니다 있는 37−40 somites 꼬리 새싹으로 확장. 빵 꾸 (3.3 단계) 계란의 위쪽 창이 열린 후까지 밀봉 되어야 하지.
5. ~ 200 µ L 32 G 바늘을 사용 하 여 연결 된 1 mL 주사기 배아 아래 인도 잉크/HBSS 혼합물 (1:5)의 주사.
   참고: 인도 잉크 태아와 아래 노 른 자 사이 시각적인 대조를 제공합니다. 대체 중립 빨강 또는 상용 시안색 형광 단백질 (CFP) 같은 염료 또는 파란 형광 성 단백질 (BFP) 형광 필터 세트 대비를 향상 시키기 위해 사용할 수 있습니다.
6. 미 발달 디스크에 dropwise HBSS의 1 mL을 추가 하 고 파라핀 영화 창 포탄 인감. 주입에 대 한 준비까지 습도 인큐베이터에 다시 계란을 배치 합니다.

4입니다. 기증자 조직의 격리

1. 무대 HH 19 (또는 원하는 단계)까지 기증자 38 ° C에 습도 인큐베이터에 비옥한 계란을 품 어.
2. 계란에서 태아를 제거 하 고 살 균 HBSS 상 온 (RT)를 포함 하는 100 m m x 15 m m 페 트리 접시에 놓습니다.
3. 수술 먼저 태아에서 전체 미 발달 심 혼을 절연 하 고 다음 심장에서 심 방 분리 하 여 집게, tenotomy의가 위, 그리고 스테레오 해 부 현미경 아래 microspatula을 사용 하 여 각 배아에서 microdissect atrial 기증자 조직. HBSS 얼음의 1 mL를 포함 하는 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 수영장.
4. 일단 모든 기증자 조직 수집에서 1000 x g 고정 각도 microcentrifuge에 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리 하 여 조직의 작은.

5. 트립 신 소화 기증자 조직

1. Prewarmed 0.05% 트립 신-EDTA의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend 그리고 300 rpm에서 떨고 열 블록에 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 또는, 물을 욕조를 사용 하 여 샘플의 정기 동요와 함께.
2. 위쪽 및 아래쪽을 헤어 모든 나머지 조직 단계 4.4 에서처럼 작은 소화 솔루션 플라스틱
3. 솔루션 및 단계 4.4에서 원심 분리기를 중화 하는 트립 신 1 mL에 펠 릿을 resuspend.
4. Resuspend 400 µ L 빨간색 형광 염료 솔루션 라벨의 셀 및 열 블록에 20 분 동안 37 ° C에서 품 어. 또는 물 목욕을 사용 합니다.
5. 라벨 반응이 완료 되 면 단계 4.4 에서처럼 셀 작은 고 HBSS (단계 1와 3 사이 변화 될 수 있다 세척 수)의 1 mL로 씻어.
6. ~ 50, 000 셀 / µ L, 총 셀 수율에 따라 5−10 µ L 작업 볼륨에 일반적으로 결과의 농도에 레이블, 수송과 셀 resuspend
   참고: 셀 ~ 50000 / µ L 아래 셀 농도 가난한 주입 효율에 발생할 수 있습니다.

6. vivo 주입

1. 1.2 단계에서 절차에 따라 실리콘 처리 유리 모 세관 피펫은에 backload 세포 현 탁 액. 피펫으로 압력 microinjector 기구에 탑재 합니다.
2. 습도 인큐베이터에서 호스트 배아를 제거 하 고는 계란 홀더 형광 스테레오 해 부 현미경 아래에.
   1. 멸 균 미세 집게를 사용 하 여 vitelline 막 열고 심 낭에 작은 절 개 (길이 ~0.5−1.0 m m)를 확인 합니다. 추가 조작/절 개 주사에 대 한 대상 지역에 따라 필요할 수 있습니다.
3. Microinjection 바늘의 팁 대상 조직을 관통 하는 microinjector를 배치 합니다.
   1. 압력 셀, 주사 하 고 형광 라벨을 사용 하 여 이식된 세포가 원하는 조직에 존재 확인. 일반적인 주사에 대 한 적용 0.5 미만 단일 펄스 압력에 100-400 hectopascals에서 배열 하는 기간에 s.
      참고: 펄스 길이 절대 압력 주입 하는 셀의 수에 따라 달라 집니다 및 개별 요구에 맞게 수정할 수 있습니다.
   2. Microinjector 장치를 제거 하 고 압력 주입 후 소유자에서 계란을 제거 합니다.
4. 태아에 dropwise 따뜻한 HBSS의 1 mL를 추가, 계란 투명 포장 테이프를 사용 하 여 봉인 하 고 24 h 포스트 주입에 대 한 38 ° C에 습도 인큐베이터에서 품 어.

7. 분리 및 분석

1. RT HBSS 집게, tenotomy 위와 비슷한 단계 4.3, microspatula를 사용 하 여 호스트 배아를 분리 하 고 4 %PFA 부드러운 락 4 ° C에서 하룻밤에 수정.
2. 부드러운 락와 RT에는 HBSS에 배아 3 x 5 분을 세척 하 고 HBSS 추가 다운스트림 분석 (현미경, immunohistochemistry에서 제자리 교 잡, 등.) 4 ° C에서 저장.

결과

호스트의 24 시간 보육, 심장 및 서라운드 조직 후 배아 고립 되었다, (그림 1A), 촬영 및 immunofluorescent 분석에 대 한 처리. 이 예제에서는 기증자 심 myocytes 비슷한 무대 호스트의 proepicardium에 microinjected 했다 태아. 근육 마커 (MF20 녹색)와 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 블루) 호스트 배아 스테인드 다음 이었다. 주입 된 세포 (레드)는 명확 하 게 표시 (그림 1B). 셀 표시 되지 않는 경우를 고려 하는 가능한 조정 포함: 기증자 조직 이상 소화 했다 (셀 수 없습니다 연결할), 너무 묽 게 했다 염료 솔루션 라벨, 셀-세척 또는 라벨의 손실 귀착되 었 다 여러 세포 분열.

이 예제에서 삽입 된 셀은 심근 확인, 우리는 광학 confocal 현미경 (그림 1C-E)를 사용 하 여이 배아 구분. Proepicardium (PE) 내 유일한 MF20 긍정적인 세포는 이식 focally 했다 형광 레드 긍정적인 세포.

그림 1 : 배아의 대표 이미지 절연 24 시간 포스트 주입. (A) E3.5 (HH 단계 19) 병아리 태아의 트렁크 지역의 낮은 배율 대물 이미지. (B) 주입 결합 된 이미지 표시 세포 (빨간색), (녹색), cardiomyocytes와 DAPI. 세포는 atria 으로부터 격리 되었고는 proepicardium에 microinjected. (C) 높은 확대 confocal 영상 보여주는 표시는 proepicardium의 핵심에 셀. (D) 높은 확대 confocal 영상 cardiomyocytes는 CT 레드 셀 표시 확인. (E) D 와 E패널에서 삽입 된 셀의 3 차원 (3D) 재건. 에, 심 방; 자주, 유출 관; PE, proepicardium; Vt, 심 실; MF20, Myosin 4 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

영향의 방법을 microenvironmental 조건 심장 세포 운명 명세와 혈통 안정화를 정의 하는 선 천 성 심장 질환도 적절 한에 대 한 효율적인 프로토콜을 개발로 압축 이해를 만드는 기본 줄기 세포 나 체세포 reprograming 기반 cardiomyocytes 성숙 프로토콜 설명 제공 위에 조사 능력에서 심장 세포 개발을 직접 시험을 vivo에서 조건, 셀 자치 성숙 프로세스 또는 hemodynamic paracrine/juxtacrine 신호에서 분리 될 수 있도록 변경. 고해상도 영상, 유전자 분석, 그리고 생리 적인 분석 실험 결합,이 기술은 기존의 유전자 변형 모델에 강력한 보완 될 수 있습니다.

기술 서 지점 양식, 효율적인 절연, 라벨, 및 호스트 배아 조직에 기증자 심 혼 세포의 정확한 주입에 여기에 제시 된 프로토콜 의존 합니다. Microinjection 시스템의 사용 크게 에이즈 기증자 세포를 대상으로 하 고 호스트 조직에 큰 engraftment 사이트를 만들기 위한 필요 없이 성공적인 이식에 대 한 있습니다. 그러나,이 방법을 수행 하려면 일부 운영 기술 필요 감소 된 생존 능력 주사 바늘 (심장 또는 로컬 맥 관 구조의 파열을 일으키는) 대상 조직에 신중 하 게 배치 되지 않습니다 경우 발생할 수 있습니다. 관심과 생각 또한 격리와 라벨 단계에 부여 되어야 합니다. 기증자의 소화 동안 조직 가난한 주입 효율, 이어질 수 있습니다 그리고 과도 기술 라벨 시간대는 기증자 세포 추적할 수 있습니다 (세포 분열 라벨 희석 수)로 제한할 수 있습니다.

이 기술은 매우 대 이며 다양 한 목적에 적응 시킬 수 있다. 예를 들어 기증자 세포 조직 및 단계의 넓은 범위에서 (비록 효소 소화의 최적화가 필요) 격리 될 수 있으며 마찬가지로 수 개발의 여러 단계에 걸쳐 다양 한 호스트 조직에 주입. 마찬가지로, 레이블 접근 이상 과도 라벨에 대 한 형광 무기 반도체 나노를 사용 하 여, 메 셀 이나 녹색에서 세포의 이식 등 다른 시간 창에서 셀을 추적을 수정할 수 있습니다. 형광 단백질 유전자 변형 (GFP +) 기증자 배아¹¹ permeant 라벨에 대 한.

우리는 현재이 기법을 사용 하 여 조류 이식 연구에 대 한, 우리는 사용 될 수 공상 연구의 넓은 범위에 대 한 미래에 느낀다. 예를 들어 유전자 변형 유기 체에서 유전으로 변경 된 심장 세포 격리 수 있고 매우 유사한 프로토콜을 사용 하 여 새 마음으로 microinjected. 또한, 세포에서 cardiomyocytes에 분화 줄기 세포 또는 체세포 reprograming 접근을 통해 배아 심장 조직 또는 biomechanical vivo에서에서 성숙에 그들의 통합을 평가에 microinjected 수 있습니다. 조건입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1mL 인슐린 주사기	BD	329654
1.7mL 마이크로튜브, 투명	Genesee Scientific	24-282
10ml 주사기	BD	305482
1000ul 리치 배리어 팁 랙형, 멸균	Genesee Scientific	24-430
15mL 원심분리기 튜브, 랙형	Genesee Scientific	28-101
1588 Genesis Hova-Bator 인큐베이터	GQF	813927021221
18G x 1 1/2 바늘	BD	305196
200ul 배리어 팁 낮은 바인딩, 랙형, 멸균	Genesee Scientific	24-412
32G x 1/2" 바늘	TSK Steriject Air-Tite	TSK3213
Alchohol Wipes 70%	Thermo Fisher Scientific	19015744
앵글 집게	Fine Scientific Tools	11260-20
백로딩 팁	Eppendorf	930001007
Black India 잉크	KOH-I-NOOR	3084-F
CellTracker Green CMF	Thermo Fisher Scientific	C7025	1 mM in DMSO
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	1 mM in DMSO
Centrifuge	Eppendorf	5424R
상용 등급 포장 테이프	스테이플	2619001
곡선형 건절개 가위	Fine Scientific Tools	14067-11
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11330-032
DMSO, 무수	Thermo Fisher Scientific	D12345
DPBS (10X), 칼슘 없음, 마그네슘 없음	Thermo Fisher Scientific	14025092
Femtojet 4i	Eppendorf	5252000021
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10437-028
부화 알	순례자의 부화장	--
HBSS, 칼슘, 마그네슘, 페놀 없음 레드	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Injectman 4	Eppendorf	5192000027D
마이크로매니퓰레이터	Leica Microsystems	--
파라필름	SIGMA	P6543-1EA
파라포름알데히드 32% 수용액, EM 등급	VWR	100496-496
페니실린/스트렙토마이신	Thermo Fisher Scientific	15140-022
페트리 접시	Genesee Scientific	32-107
피펫 그라인더	Narishige	EG-44
피펫 풀러	HEKA	PIP 6
스카치 투명 테이프	스테이플	487909
Sigmacote	SIGMA	SL2-25ML
스테레오 현미경	Leica	--
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
얇은 벽 유리 모세관	세계 정밀 기기	TW100F-4
전사 피펫	Thermo Fisher Scientific	273
Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드	Thermo Fisher Scientific	25300-054