간 질 연구의 도전은 고전적인 치료가 부적당 한 환자를 위한 새로운 치료를 개발 하는 것입니다. 새로운 프로토콜을 사용 하 여-이식 가능한 약물 전달 시스템의 도움으로-우리는 간 질 초점에 GABA의 전기 영동 전달에 의해 마 취 된 쥐에서 발작을 제어할 수 있습니다.
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방법 논문
간 질 초점으로 γ-아미노 버터 산 (GABA)의 전기 영동 전달은 생쥐의 발작을 방지 합니다.
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
간 질은 전세계 수백만의 사람들에 영향을 미치는 신경학 상 무질서의 그룹입니다. 약물 치료는 70%의 경우에 도움이 되지만, 심각한 부작용은 환자의 삶의 질에 영향을 미친다. 더욱이, 간 질 환자의 높은 비율은 약물 내성; 그들의 경우에는 신경 수술이 나 신경 자극이 필요 합니다. 따라서 간 질 연구의 주요 목표는 부작용 없이 간 질을 치료 하거나 약물 내성 환자에서 재발 성 발작을 예방 할 수 있는 새로운 치료법을 발견 하는 것입니다. 신경 공학은 새로운 전략과 기술을 사용 하 여 간 질 환자를 위험에 치료할 수 있는 더 나은 솔루션을 찾도록 합니다.
간 질병의 급성 마우스 모델에서 신규 한 실험 프로토콜을 시연 하는 것으로 서, 직접적으로 현장 전기 영동 약물 전달 시스템이 사용 된다. 즉, 미세 유체 이온 펌프 (µ FIP)를 포함 하는 신경 프로브가 온 디맨드 약물 전달 및 국 소 신경 활성의 동시 기록을 위해 이식 되 고 4-aminopyridine 유도 (4AP 유도) 발작과 같은 제어가 가능한 것으로 입증 이벤트 (SLE) 활동. Γ-아미노 부 티 르 산 (GABA) 농도는 발작 집중에의 한 항 간 질 효과에 도달 하는 GABA 전달의 정밀한 제어에 의해 생리 적 범위 내에서 유지 되지만 과잉 억제 유도 된 반발 파열을 야기 하지 않는다. 이 방법을 통해 병리학 적 활동과 개입을 감지 하 여 억제 신경 전달 물질을 정확한 시 공간적 제어와 함께 간 질 초점에 직접 전달 함으로써 발작을 막을 수 있습니다.
실험 방법에 대 한 개발의 결과로 서, SLEs는 발작 발병 시에 정확 하 게 조정 된 GABA 전달을 통해 발작 제어를 허용 하는 고도로 국 소화 된 방식으로 유도 될 수 있다.
서론
간 질은 넷째 가장 일반적인 신경 장애: 인구의 약 1%는 간 질을 앓고 있으며, 영향을 받는의 1/3 정도 재발 발작이 있습니다. 대부분의 경우 발작을 약물로 조절할 수 있습니다. 그러나, 약물 치료는 개별적으로 모든 환자에 대 한 설정 될 필요가, 어디 적절 한 먹이 지 수 년은1,2를 찾는 데 걸리는. 추가적으로, 대부분의 약물은 삶의 질을 감소 시키는 심각한 부작용을 갖는다,4,5,6,7. 마지막으로, 환자의 30%에서 환자는 약물에 내성이 있으며, 일정 한 단일 발작 발생기 궤적의 경우에만 전염 성 신경 수술이 발작의 발생을 감쇠 할 수 있습니다8. 따라서, 현대 간 질 연구에 있는 주요한 이니셔티브는 위험한 상태에 환자에 있는 재발 하는 발작을 방지할 수 있는 새로운 전략을 발견 하는 것입니다, 강한 약물 치료 및 침략 적인 전염 하는 수술의 필수품을 감소 시키면서.
간 질 발작이 뇌의 흥분 성 및 억제 회로 내에서 불균형이 있을 때 발생 (일반화 된 뇌 전 증) 또는 두뇌의 국부 적 인 부분 (초점 간 질), 비정상적인 패션에서 뉴런 방전 등9 , 10 , 11. 항 경련 제는 발작 예방에서 두 가지 방법으로 작용할 수 있습니다: 여기를 감소 시키거나 억제를 강화12. 구체적으로, 그들은 세포 막 (13 )에서 이온 채널에 영향을 주는 것에 의해 뉴런 세포의 전기적 활성을 수정 하거나 억제 신경 전달 물질 GABA 또는 흥분 성의 영향을 미치는 신경 간의 화학적 전달에 작용 하 여 시 냅 스14,15에서 조미료. 일부 약물에 대 한, 행동의 모드는 알 수 없는18. 또한, 약물 치료는 환자에 게 지속적인 영향을 주며 발작의 유 병 역학에 적응할 수 없습니다. 이상적으로, 행동의 특정 메커니즘을 가진 약물은 근본적인 간 질 과정에 행동. 최적의 치료는 뇌의 interictally를 만지지 않을 것 이지만 발작이 발달 하기 시작할 때 즉시 작용할 것입니다. 그와는 대조적으로, 간 질의 모든 경우에, 약물은 지금 전체 뇌와 환자의 몸 전체에 영향을 미치는 체계적인 치료를 의미9.
간 질 발작 뇌 외상 등 초기 모욕 후 몇 년 동안 나타날 수 있습니다. 첫 번째 자발적 발작의 초기 모욕과 발생 사이의 기간은 신경 네트워크 연결 및 축 삭의 실종과 함께 신경 사 멸을 포함 하 여 상당한 분자 및 세포 조직 재구성을 특징으로 한다 새로운 연결의 출현으로 발 아/neosynaptogenesis19,21. 발작이 재발 되 면, 그들의 빈도와 심각도는 증가 하는 경향이 있다, 더 많은 뇌 영역을 포함. 발작 기원과 전파의 규칙이 다를 수 있기 때문에, 전파 네트워크에서 발작 개시 (epileptogenic 지역)의 사이트를 구별 하는 것이 중요 합니다. 인간 조직 및 간 질 실험 모델에서 수행 된 연구는 회로의 재 조직 및 발작 생성 능력에 관한 중요 한 데이터를 제공 하 고 있다20,21,22, 23. 그러나 이러한 재조직이 적응 적 응답 인지 또는 epileptogenesis 발작 발생 및 전파12와 관련이 있는지를 확인 하는 것은 어렵습니다.
따라서, 간 질 초점을 현지화 하 고 항 경련 제를 국 소 적으로 적용 하는 것은 현대 간에 서 연구에서 주요 과제 중 하나입니다. 간 질 및 일부 임상 연구의 동물 모델을 사용 하는 몇 가지 실험은 발작 사건의 발병을 발견 하 고 뇌24,25,26,27에서 기저 기전을 정의 하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해, 4ap-유도 간 질 모델 (28,29,30,31 )을 사용 하는 새로운 실험 프로토콜을 개발 하 여 3 개의 정밀한 삽입을 가능 하 게 하는 급성 마우스 준비 생체 내 네트워크 활동이 고도로 현지화 된 방식으로 조작 되는 해 마의 주어진 영역으로 장치. 유리 마이크로 피 펫에의 한 국부 적 4AP 주입은 해 마에서 국 소화 된 자리에서 간 질 SLEs를 유도 하는 데 도움을 주며, 한편 신규 한 중합체 기반 µ FIP 프로브의 도움으로 발작 활성의 제어가 동시에 뉴런을 기록 함으로써 달성 된다 장치의 녹화 사이트와 전기적 활동. 해 마 지역 필드 활동은 또한 피 질 및 해 수에서 동시에 층 별 방식으로 멀티 채널 실리콘 프로브로 모니터링 된다.
최근에 발명 한 µ FIP 프로브는 적용 된 전기장을 사용 하 여 마이크로 유체 채널에 저장 된 전 하 약물을 이온 교환 막 (IEM)을 통해 주변 조직으로 밀어내는 방식으로 작동 합니다 (그림 1). IEM은 한 종류의 이온 (양이온 또는 음이온)만을 선택적으로 전송 하 고, 따라서 "off" 상태에서 수동 확산을 제한 하 고 주변 조직에서 장치에 반대 하 여 충전 된 종을 수송 하는 작업을 합니다. 전기장은 미세 유체 채널 내부에 있는 소스 전극과 디바이스 외부에 있는 타겟 전극 사이에 작은 전압 (< 1V)을 인가 함으로써 필요에 따라 생성 된다 (이 경우에는 동물 모델의 헤드 스크류). 약물 전달 속도는 소스와 타겟 전극 사이에 인가 된 전압과 측정 된 전류에 비례 합니다. 약물 전달의 정확한 tunability는 µ FIP의 주요 이점 중 하나입니다. 또 다른 중요 한 이점은, 유체 또는 압력 기반 약물 전달 시스템에 비해, µ FIP에서 약물이 그들의 캐리어 용액 없이 IEM을 통해 전달 되는 약물 전달 출구에서 무시할 압력 증가가 있다는 것 이다.
Μ FIP는 "off" 때 GABA의 수동 누출의 소량이 있다, 하지만 이것은 SLEs를 영향을 하지 발견. Μ FIP는 우리가 이전에 보고 한 전통적인 미세 제조 방법에 따라 주문 제작31.
재발 성 발작을 방지 하는 한 가지 방법은 처음에 또는 심지어 첫 번째 발작 이벤트 전에 네트워크 방전의 봉쇄 이기 때문에, GABA 억제 신경 전달 물질을 간 질 초점으로 전달 하기 위한 제시 된 방법은 훌륭한 국 소 간 질 환자에서 발작 제어를 위한 치료 적 가능성. 이후 GABA는 내 인 성 기질, 그것은 생리 적 농도에서 변경 되지 본질적인 신경 속성을 나뭇잎. GABA의 낮은 수준의 로컬 응용 프로그램은 자연스럽 게 억제에 응답 하는 세포에 영향을 미칠 것입니다., 생리 적 억제에 비슷한 효과 일으킬 것입니다., 깊은 뇌 자극에 반대 (DBS), 모든 세포를 자극 하 여 비 특이 한 행동 그 환경에서 신경 네트워크의, 여기 및 억제를 포함 하는 혼합 된 응답을 일으키는. 결론적으로, 제안 된 방법은 DBS 보다 발작 제어에 대 한 보다 구체적인 접근법을 제공 한다.
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프로토콜
모든 실험 절차는 연구소 드 신경 과학 des 시스템의 윤리적 지침에 따라 수행 하 고 지역 윤리 위원회 및 수의학 사무실에 의해 승인.
참고: 17 명의 성인 남성 OF1 마우스를 실험에 사용 하였다. 마우스는 음식 및 물 사용 가능한 광고 libitum와 12 h 빛/어두운 주기에 훈련을 받았다.
1. 마 취
- 케 타 민과 자일 린 100 (복 강 내의 체중과 10mg/kg 체중을 각각의 혼합물에 주입 하 여 동물을 마 취 시켰다.
-
호흡 속도와 위스키를 관찰 하 고 통증에 대 한 마우스의 반응을 확인 하 여 마 취 수준을 확인 하십시오.
참고: 마우스의 호흡이 규칙적이 되 면, 어떤 위스키도 관찰할 수 없고, 동물이 꼬리 핀 치에 반응 하지 않으면 마 취는 계속 될 정도로 깊을 것입니다.- 동물을 전기적으로 프로그래밍 가능한가 열 패드 위에 놓으십시오. 석유 젤리 기반 제품 ( 재료 표참조)을 사용 하 여 직장 온도 프로브를 덮고 체온을 모니터링 하기 위해 마우스의 항문에 부드럽게 배치 하십시오 (1 ~ 2cm 깊이). 수술 절차 및 실험 기록 중에 36.5과 37.5 ° c 사이의 체온을 유지 합니다.
- 마우스의 반사, 수염 운동 및 호흡의 주파수를 확인 하 여 마 취 수준을 모니터링 합니다. 적어도 30 분 마다 기록 된 마 취의 수준을 고려 하 여 케 타 민 lazine 칵테일 (20 ~ 50 µ L, 이전과 같은 농도로 사용 된 농도)의 소량을 근육 내에 제공 합니다.
2. 수술/두개 절제술
- 마우스의 머리를 입체 프레임으로 고정 합니다. 30 G 바늘을 사용 하 여 계획 된 절 개 부 위에서 피하 지방 진통제 ropivacm(5µ, 7.5 mg/mL, 재료 표참조)를 주입 하십시오. 5 분 동안 사용 하면 효과가 적용 됩니다.
- 메스로 두개골 위의 피부에 직선 컷 중간 선을 확인 합니다. 미세 집게로 부드럽게 피부를 당겨 하 고 더 작업에 대 한 노출 두개골을 떠나 불독 serrefine 클램프 옆으로 클램프.
- 메스 또는 유사한 도구를 사용 하 여 처마 돌림의 두개골을 청소 합니다. 표면 출혈의 경우 면봉 이나 종이 타월의 작은 조각으로 혈액을 제거 하십시오.
- 폴 리 에틸렌 (ethylenedioxythiophene) 폴리스 티 렌 술 포 네이트 (PEDOT: PSS) 코팅 접지 나사 (크기: #00 직경: 0.047, 길이: 1/8 납땜 와이어를 사용 하 여 커넥터와 앰프 헤드 스테이지에 연결 하십시오.
- 원하는 구멍 부 위에 두개골을 적시고 소 뇌가 보일 때까지 두개골 위에 있는 미세한 원형 드릴 비트 (0.4 mm 직경)를 사용 하 여 고속으로 구멍을 뚫습니다. 구멍에 접지 나사를 넣고 소 뇌의 상단에 도달 할 때까지 정밀 드라이버로 나사.
참고: 헤드 스크류는 PEDOT: glycidyloxypropyl) 트리메 (GOPS)를 중량 기준으로 하 여 140 ° c에서 90 분 동안 베이킹 하 여 딥 코팅 하였다. PEDOT: PSS는 생체 적합성으로 알려진 체적 커패시턴스를 갖는 공액 고분자입니다. GOPS는 PEDOT: PSS와 혼합 된 교차 링커로 수성 매체의 안정성을 높입니다 (그림 2). - 입체 프레임의 도움으로 원하는 뇌 영역에 대 한 입체 좌표를 측정 합니다. 예를 들어, 관심 영역은 마우스32에 대 한 뇌 아틀라스를 기반으로 하는 브 레 gma 포인트에서 해 마, 전후 (AP)-1.8 mm 및 mediolateral 1.8 mm 이다.
참고: 다음은 오른쪽 반구의 좌표입니다 (그림 2). - 신뢰할 수 있는 치과 용 드릴 ( 재료 표참조)을 사용 하 여 대상 영역 위의 두개골에서 약 1 ~ 2mm 직경의 면적이 얇고 잘 다듬어진 투명 한 뼈 막이 남아 있을 때까지 빠른 속도로 설정 합니다.
- 그 후, 골 막의 두께가 충분히 얇으 면 (< 200 µm) 얇은 집게로 작은 구멍을 만들고 뼈33의 얇은 층을 부드럽게 제거 하십시오. 경질을 제거 하기 위해 주문 제작 된 훅 팁 바늘을 사용 하십시오. 부 종 절제술 및 경도 절제술의 크기를 최소화 하 여 부 종의 발병을 방지 하 고 뇌의 심장 및/또는 호흡기 진동을 최소화 합니다.
참고: 두개 절제술은 건조를 방지 하 고 실험 중에 정기적으로 리필 되는 식 염 수 용액으로 채워야 합니다 (그림 2).
3. 멀티 채널 실리콘 프로브의 삽입
- 실리콘 프로브가 다른 두 임 플 란 트의 위치 지정을 위한 충분 한 공간을 두고 전극, 이온 펌프 및 마이크로 피 펫의 기록 및 주입 부위를 최대한 가깝게 유지 하기 위해 약간의 AP 각도 (20 °)로 입체 암을 사용 하십시오.
참고: 전극, 주사기 및 이온 펌프에는 디 메 틸 설 폭 사이드의 이식 흔적 (0.5 mg/ml DiI)의 사후 시각화를 위해 DiI 얼룩 용액 (1 dioctadecyl, 3, 3 tetramethylindocarbocyanine)을 떨어 트 렸 다. - 실리콘 프로브를 자기 홀더에 부착 된 입체 암에 놓고 입체 프레임 옆에 놓습니다. AP 각도 (20 °)를 설정한 다음 프로브를 헤드 스테이지와 접지 나사에 연결 합니다.
-
미크론 단위의 정밀한 입체 암이 나 전동 마이크로 매니 퓰 레이 터를 사용 하 여 실리콘 프로브를 해 마로 천천히 내려 측면 움직임을 피합니다 (그림 2 와 그림 3).
- 헤드 스테이지, 커 넥 티 드 앰프 및 컴퓨터-전기 신경 신호를 사용 하 여 대상 dorsoventral (DV) 위치까지 피 질의 상단에서 멀티 채널 실리콘 프로브를 이동 하면서 기록 소프트웨어와 기록을 시작 합니다 (- 1800 대뇌 피 질 표면에서 µm). 컴퓨터 화면에 침투 하는 동안 로컬 필드 전위 신호 (LFP)를 기록 하 고 시청 합니다.
참고: 기록 하는 동안 천천히 그리고 지속적으로 이동 하 고, 침투에 대 한 더 나은 시각적 제어를가지고 대상 영역에 도달 하도록 프로브의 하강 제어. - 기록 된 LFP의 하 마 형성의 피라미드 층에서의 리플 활성을 표적 영역의 마커로 서 사용 한다.
참고: 리플 활동은 기록 사이트 사이에 100 µm 거리를 갖는 다중 채널 실리콘 (Si) 프로브의 하나 또는 두 개의 인접 한 채널에 표시 됩니다 (그림 4). - 멀티 채널 Si 프로브 (그림 4)를 사용 하 여 다채널 증폭기의 소프트웨어 ( 재질 표참조)를 통해 피 질과 해 마의 레이어에서 LFP 신호를 동시에 기록할 수 있습니다.
- 헤드 스테이지, 커 넥 티 드 앰프 및 컴퓨터-전기 신경 신호를 사용 하 여 대상 dorsoventral (DV) 위치까지 피 질의 상단에서 멀티 채널 실리콘 프로브를 이동 하면서 기록 소프트웨어와 기록을 시작 합니다 (- 1800 대뇌 피 질 표면에서 µm). 컴퓨터 화면에 침투 하는 동안 로컬 필드 전위 신호 (LFP)를 기록 하 고 시청 합니다.
4. µ FIP의 삽입
- Μ FIP의 입구에 튜브 ( 재료 표참조)를 연결 하 고 0.05 M GABA 용액으로 프로브를 채 웁 니다. 튜브를 제거 하 고 파라핀 필름 포장으로 입구를 닫으십시오. 전기 리드를 소스 측정 유닛에 연결 합니다.
- Mediolateral (MP) 각도로 입체 암의 도움으로 µ FIP를 삽입 합니다. Si 프로브는 전체 과정에서 삽입 된 상태로 유지 됩니다.
참고: µ fip는 매우 유연 하 고 뇌 표면에 도달 할 때까지 똑바로 유지 하기 위해 작고 깨끗 한 페인트의 지원 혜택을 누릴 수 있습니다. 그 단계 후에, µ FIP는 축방향 운동으로 부드럽게 낮출 수 있습니다. - Μ FIP를 천천히 축방향 움직임으로 낮추고 궤적 중에 dorsoventral (-1200 µm 대뇌 피 질 표면에서) 좌표에 도달 할 때까지 구부러지게 하십시오.
참고: Μ FIP 팁에서 출구의 300 μ m 거리를 고려 하 여 가능한 한 서로 가깝게 두 장치 (µ FIP 및 실리콘 프로브)를 넣어 보십시오.
주의: 삽입 하는 동안 장치 및 커넥터 사이에 기계적인 문제가 발생 하지 않도록 하십시오 (그림 2b 및 그림 3b).
5. 발작 유도를 위한 장치 준비
- 주사기의 금속 바늘 (10 µ L)을 변경 합니다 ( 재료 표참조). 바늘 고정 금속 부분을 제거 하 고 마이크로 피 펫을 배치 하 고 고정 합니다 (외경 [OD]: 1.2, 0.75 내경 µm, 팁 지름: 20 ~ 50 섕크의 테이퍼를 ± 0.5 cm로 하 고 바늘 고정 요소를 교체 합니다.
- 주사기와 부착 된 붕 규 산 마이크로 피 펫을 인공 뇌 척 수액에 4AP (50)의 주입을 위한 20 ° lateromedial (LM) 각도로 위치 시킵니다.
주의: 주사기의 금속 바늘 이나 마이크로 피 펫을 50 µm 보다 큰 팁으로 사용 하지 마십시오. - 자동 마이크로 주입 펌프의 도움으로 500 nL-50 mM 4AP의 µ L을 그립니다.
6.4AP 주입을 위한 주사기에 부착 된 유리 피 펫의 삽입
- 주사기에 부착 된 유리 마이크로 피 펫을 조 준 된 DV 위치 (-1500 µm)로 낮추고 4AP 솔루션의 250 nL을 주입 합니다 (그림 2 와 그림 3). 녹음 소프트웨어로 녹화를 시작 합니다. 화면을 보고 첫 번째 interictal 스파이크가 나타날 때까지 기다립니다.
- 첫 번째 interictal 스파이크의 모양으로 즉시 µ FIP에 의해 GABA 배달을 시작 합니다. 에 대 한 소스와 대상 사이 1 V를 적용 하 여 GABA를 제공 100 s에 대 한 그 뒤에 1soff, 30 사이클에 대 한. 녹음 소프트웨어의 도움으로, 최소 2 시간을 기록 합니다.
참고: 전달 된 GABA의 총 질량은 약 1 nmol (그림 5). - 실험이 끝날 때 삽입 된 프로브와 접지 나사를 부드럽게 제거 하 고 입체 장비에서 동물을 제거 합니다. 동물은 약물의 과다 복용 (i. p. 100mg/kg pentobarbital을 사용 하 여 안락사 시켰다. 죽음은 호흡과 순환의 중단에 의해 확인 되었다.
7. 임 플 란 트의 배치 평가
- 동물을 안락사 한 후에, 먼저 50 mL의 생리 식 염 수와 함께이를 사용 하 고 0.1 M 인산 완충 제 (PFA)34에서 4% 파라 포 름 알 데히드를 함유 하는 얼음 차가운 고정 용액을 150 ML로 첨가 하였다.
주의: PFA는 위험 하므로 주의 해 서 취급 해야 합니다. - 동물을 욕 한 다음 두개골의 상단과 측면에서 피부와 근육을 제거 하십시오. 포 아 멘 매그넘에서 시작 하 여 두개골을 귀 쪽으로 옆으로 절 개 하 고 시상 하 부를 절제 하 여 뇌를 손상 시 키 지 않도록 주의 하십시오. 뼈 트리머를 사용 하 여 두개골을 부드럽게 제거 합니다. 뇌를 제거 하 고 뇌 매트릭스 ( 재료 표참조)의 도움으로 관심 영역 (bregma 포인트에서-1 ~ 3mm AP)에서 조직 블록을 절단 합니다.
- 조직 블록을 진동의 시 편 홀더에 접착 하 고, 스탠드를 넣고, PB 목욕에서 40 µm 두께로 바이브 레이 팅을 설정 하 여 40 µm 코로나 섹션을 만듭니다.
- 0.1 M PB로 광범위 하 게 세척 하십시오. 신경 교 섬유 소 산 단백질 (GFAP) 염색31에 대 한 조직 학적 프로토콜을 따른다.
- 슬라이드에 섹션을 장착 하 고 amidinophenyl-인 돌-carboxamidine)를 포함 하는 마운팅 매체로 커버 합니다 ( 재질 표참조).
8. 공초점 현미경
- 스테인드 코 날 섹션이 있는 슬라이드를 공초점 현미경의 20x 목표 하에 배치 합니다. 대상 영역을 선택 합니다.
- 염료에 대 한 최적의 여기 및 방출 (exc/ems) 필터 세트를 다음과 같이 선택 합니다. DAPI = 358/461 nm, DiI = 551/569 nm 및 형광 ( 재료 표참조) = 490/525 nm.
참고: 단면 마다 염색이 다르기 때문에 최소 및 최대 구동 및 검출의 적절 한 범위는 각 섹션에 대해 결정 되어야 하며, 여기서 가장 조밀 하 고 밀도가 가장 높은 영역은 모두 발광을 나타냅니다. - 밀도가 가장 낮은 영역을 선택 하 고 레이저 강도와 감지를 높은 값으로 설정한 다음,이 값이 감지 된 방출의 과다 포화를 유발 하는지 여부를 가장 깊은 영역에서 확인 합니다. 이 경우 값을 낮추고 밀도가 가장 낮은 영역으로 다시 확인 합니다. 낮은 염색 수준에서 가능한 가장 높은 검출에 도달할 때까지이 단계를 반복 하 고 높은 얼룩이 있는 영역에서 지나치게 포화 수준이 아닌 적절 한 것으로 강조 합니다. 모든 염료에 대해이 과정을 반복 합니다.
- 타일 당 512 x 512 픽셀로 현미경의 타일 스캔 기능을 사용 하 여 사후 처리를 위한 적절 한 해상도로 프로브 삽입 사이트의 큰 개요를 얻습니다.
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결과
여기에 제시 된 절차를 사용 하 여 마 취 된 마우스에서 4AP 간 질 모델을 이용 하 여 발작을 조절 하는 것에 대 한 항 경련 제 집중을 달성할 수 있다. 임 플 란 트의 정확한 국 소화 (그림 2)는 해 마 국부 잠재력 (Lfps, 도 4)을 기록 하 여 작은 해 마 발작을 유도 하 고 발작 발병 시 GABA를 전달 하는 데 도움이 되었습니다. 임 플 란 트의 국 소화는 사후 학적 조직학에 의해 각 실험 후에 확인 하였다 (도 3).
SLEs가 해 마에만 존재 하는 경우에, 간 질 활성은 완전 한 통제 하에 넣어 졌다. 도 5 는 µ fip를 통합...
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토론
간 질에 대 한 급성 마우스 모델에서 새로운 실험적 프로토콜을 개발 함으로써, SLEs는 발작 초점에 이식 된 µ FIP의 도움으로 성공적으로 제어 될 수 있었습니다. 시간 및 공간 정밀도와 GABA를 제공 하는 그것의 기능 덕분에, 4AP 유도 SLEs 포착의 개시에 통제 되었다. 간 질병의 치료는 이론적으로는 발작 시작의 장소에서 신경 네트워크 방전의 제어가 달성 되는 경우에 가능 하다. 제시 된 프로토콜은 주입 된 억제 신경 전달 물질의 국 소화가 가능한 경우이를 증명, GABA, 시간에 간 질 초점에 도달 하기에 충분히 정확 하다. 그러나, 그 경우 간 질 발작 뇌의 큰 영역에 영향을, 정확 하 게 지역화 GABA 납품에 의해 발작 제어는 불가능. Μ FIP 프로브의 영향 영역은 출구 로부터 약 550 μ m의 반경으로 추정 되었다. 이것은 SLEs가 4AP 주입이이 지역31에 국한 된 경우에만 영향을 받을 수 있다는 것이 입증 되었습니다.
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
C.M.P.는 국제 교육 기관에서 관리 하는 휘 태 커 국제 학자 보조금의 기금을 인정 한다. 에반젤린는 마리 퀴리 IEF (No. 625372)의 후원을 받았습니다. A.W.는 유럽 연합 (eu)의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램에 따른 유럽 연구 위원회 (ERC)의 자금 조달을 승인 합니다 (보조금 계약 번호 716867). A.W.는 엑스-마르세유 대학 A * MIDEX의 우수성 이니셔티브를 인정, 프랑스의 "Investissements" 프로그램. 저자는 일 케 Uguz 박사, 사 히 카 나 우, 빈 첸 쿠 토 박사, 메리도 나 휴 박사, 마크 페로 박사, 그리고 조 소 피아 마그리트가 유익한 토론에 참여 했음을 인정 합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4AP | 시그마 | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| 앰프 | Neuralynx, 몬타나, USA | Digital Lynx 4SX | |
| 앰프 | 앰프liplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica 유리 피펫 | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| 뼈 트리머 | FST | 16109-14 | |
| 컨포칼 현미경 | Zeiss | LSM 510 | |
| 커넥터 | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| 커버 슬립 | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | 써모 피셔 | D282 | |
| DMSO | 시그마 | 11412-11 | |
| 드릴 | FOREDOM | K1070 | |
| 집게 | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP 단클론 항체 | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | 해밀턴 | 80330 | |
| 헤드스크류 | 구성 요소 공급 | TX00-2FH | |
| 히팅 패드 | 하버드 기구 | 341446 | |
| 분사 펌프 | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| 케타민 | Renaudin | 5787419 | |
| 마그네틱 홀더 | Supertech Instruments | MH-1 | |
| 마우스 | Charles River | 612 | |
| 모터 매니퓰레이터 | Scientifica, 영국 | IVM | |
| Na2HPO4 | 시그마 | 255793 | |
| NaH2PO4 | 시그마 | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| 종이 타월 | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | ||
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| 직장 온도 프로브 | 하버드 장치 | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| 메스 | F.S.T | AUST | |
| R195806 Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine 클램프 | F.S.T | 18050-28 | 4 권장 |
| 실리콘 프로브 | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 또는 A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic 프레임 | 스톨팅 | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| 튜빙 | INSTECH | LS20 | |
| 바셀린 | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, 캘리포니아, 미국 | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | 바이엘 | 4007221032311 | |
| 실리콘 프로브 | Neuromicrosystems Ltd | A1x32_dbl_5.0_50_0_176_50 |
참고문헌
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